專利名稱：基于微衛星座位多態性的中國樹鼩分子遺傳標識方法
技術領域：
本發明涉及一種基于微衛星座位多態性的中國樹駒分子遺傳標識方法，屬生物高技術領域。
背景技術：
中國樹駒(Tupaia belangeri chinensis)，隸屬于樹鼠句目Gcandentia)，樹鼠句科 (Tupaiidae)，樹駒屬(Tupaia)動物。形似松鼠，同時具有食蟲目Gnsectivora)和靈長類 (Primates)動物的一些特征。樹駒吻部較長，指(趾)端具爪，齒式和食性等特征與食蟲目動物相似，而其發達的大腦、頭骨結構、中耳部結構、肌群組成和腸胃道結構等與靈長類動物相似，因此其系統分類地位一直是分類學上爭論的話題。上世紀80年代，根據樹駒眾多形態系統發生和分子系統發生的研究，一些學者提出建立樹駒目，將其置于食蟲目與靈長目之間。現有遺傳學證據表明樹駒和靈長類動物關系密切，是其近親。由于樹駒個體小，飼養繁殖周期短，成本低，且具有多種自發性疾病，在疾病和正常情況下都表現出諸多與靈長類動物相似的特征，已被大量運用于生物醫學研究，并有望在某些方面替代數量日趨減少的瀕危的非人靈長類實驗動物。目前，樹駒被廣泛運用于近視、肝炎、肝癌、抑郁癥、糖尿病和微生物感染等疾病的研究，實驗用樹駒呈現了供不應求的狀態。雖然樹駒的人工飼養繁殖工作早在19世紀80年初就已開展，但到目前為止，依然沒有建立一個純的實驗品系，且缺少一種能用于個體識別和純系評估的分子遺傳標識系統。 現有文獻報道中所用的樹駒大多是野外捕獲的，或者是捕獲后只經過短期的室內馴養。然而，野外生存的樹駒種群存在豐富的遺傳多樣性，這導致不同實驗所采用的樹駒的遺傳背景存在較大差異，往往研究結果出現巨大差異。為了更好地推進新型實驗動物樹駒的模式化和遺傳背景清晰的品系的創制，合理開發利用樹駒資源，建立一套樹駒個體識別和純系評定的遺傳標識系統尤為迫切。用于遺傳分析的分子標記有多種，如限制性長度片段多態(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP),隨機擴增多態性 DNA(RandomAmplified PolymorphicDNA，RAPD)，數目可變串聯重復多態(Variable Number Tandem Repeat, VNTR) 和微衛星(microsatellite)。微衛星又稱為簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSR) 或短片段重復序列(Short Tandem R印eat，STR)，是由l_6bp的堿基作為核心重復單元，串聯重復形成的一類DNA序列。由于微衛星廣泛且較均勻地分布在基因組中(約30-501Λ就存在一個微衛星DNA)，具有豐富的多態性、信息含量大、呈共顯性、符合孟德爾遺傳規律等特點，被廣泛運用于連鎖圖譜構建、種群遺傳多樣性分析、品種品系的選擇和建立、以及不同品系間親緣關系界定、個體識別和親權鑒定等。要評估建立的樹駒品種或品系是否遺傳背景清晰，首先需要檢測一套分子遺傳標記。因此，本發明針對現有技術的不足，提出一種基于微衛星座位多態性的中國樹駒分子遺傳標識方法。經文獻檢索，未見與本發明樹駒微衛星遺傳標記相同的公開文獻報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種基于微衛星座位多態性的中國樹駒分子遺傳標識方法，用于檢測樹駒種群雜合度、群體結構、個體識別和親權鑒定。本發明以Ensembl數據庫下載的樹駒基因組序列為模板，搜尋微衛星序列，用 Primerpremier 5軟件設計用于擴增微衛星序列的引物對。經PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，不斷優化擴增條件，最后得到12對具有等位基因多態性和特異性擴增的樹駒微衛星序列的引物。這12個樹駒微衛星座位的擴增引物信息、微衛星序列的重復元件、擴增片段長度范圍以及擴增條件列于表1中。基于全自動測序儀的DNA片段分析(GENESCAN)原理， 將每對引物的正向引物用5' -FAM標記后，利用優化好的擴增條件，再次進行PCR擴增，并將PCR產物與一定量的分子內標混合，分別在ABI PRISM3730型或其他型號全自動測序儀 (Applied Biosystems)上掃描檢測。具有多態性的微衛星位點擴增出的PCR產物依據長度的不同，在電泳中顯示出不同的遷移率，其帶有的FAM標記熒光信號在電泳過程中被測序儀檢測。依據分子內標的條帶數與片段大小，我們利用相關軟件即能判讀出目的片段的大表1.中國樹駒12個多態性微衛星座位的引物序列、產物長度、擴增條件及重復元件
權利要求
1. 一種基于微衛星座位多態性的中國樹駒分子遺傳標識方法，其特征在于該方法的具體步驟如下A、使用酚/氯仿法或試劑盒提取法從樹駒組織或血液中提取基因組DNA；B、以步驟A提取的基因組DNA為模板，擴增各微衛星位點的各個上游引物標記 5' -FAM，進行PCR反應；PCR反應引物和擴增條件如下
全文摘要
本發明涉及一種基于微衛星座位多態性的中國樹鼩分子遺傳標識方法，屬生物高技術領域。本發明將微衛星引物標記熒光(5′-FAM)，再進行PCR擴增，使PCR產物帶有5′-FAM熒光標記。將PCR產物與分子內標混合，經DNA全自動測序儀的掃描檢測后，通過不同等位基因擴增片段與分子內標的相對位置而識別出目的片段的長度大小，達到基因分型的目的。通過計算雜合度及各項法醫學鑒定指數，能對個體識別和群體多樣性、品系純度評估。本發明也能夠通過10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，依據不同大小的等位基因片段判別不同基因型。本發明具有簡單、快速、靈敏和適用的特點，對于樹鼩資源遺傳多樣性評估、品種品系的分子標記輔助選育和個體識別具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102424864SQ20121000422
公開日2012年4月25日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者劉小紅, 姚永剛 申請人:中國科學院昆明動物研究所