專利名稱：化膿鏈球菌抗原的制作方法
化膿鏈球菌抗原本申請是題為“化膿鏈球菌抗原”的中國專利申請No. 200480005628. 5的分案申請。本發明涉及分離的核酸分子，它編碼關于化膿鏈球菌(Str印tococcus pyogenes) 的抗原，適用于制備藥物以預防和治療由化膿鏈球菌引起的細菌感染。化膿鏈球菌，又稱為A族鏈球菌(GAS)，是一種重要的革蘭氏陽性細胞外細菌病原體且常常感染人。GAS集群于咽喉或皮膚處造成許多化膿性感染和非化膿性后遺癥。它主要是兒童疾病且在人體中引起包括細菌性咽炎、猩紅熱、膿皰病和膿毒病在內的多種感染。 數十年的流行病學研究產生了顯著不同的咽喉和皮膚菌株的概念，其中某些血清型通常分別與咽喉或皮膚感染有關{Cunningham，Μ.，2000}。已發現GAS造成了最近在美國復蘇的鏈球菌中毒休克綜合征相關性壞死性筋膜炎{Cone，L.等，1987 ；Stevens,D. ,1992}并被描述為侵入皮膚和軟組織導致組織或肢體損傷的“食肉”細菌。感染后人體中可出現幾種鏈球菌后遺癥，諸如急性風濕熱、急性腎小球腎炎和反應性關節炎。急性風濕熱和風濕性心臟病是其中最嚴重的自身免疫后遺癥并已在世界范圍內導致了兒童的殘疾和死亡。化膿鏈球菌還可引起諸如猩紅熱和壞死性筋膜炎等嚴重的急性疾病并且已與Tourette氏綜合征以及運動和注意力失調癥相關。A族鏈球菌是咽喉疼痛和咽炎的最常見的細菌誘因且至少占季節性依賴的普通門診的 16% {Hope-Simpson,R.，1981}。它主要侵襲 5-15 周歲的學齡兒童{Cunningham,M.， 2000}。在例如學校等擁擠條件下所有年齡段都容易受該生物體傳播的侵襲。盡管GAS不被認為是正常的菌群，但A族鏈球菌的咽運載現象存在時可以無臨床癥狀。A族鏈球菌可用血清學分類的Lancefield分類方案基于其碳水化合物進行區分或基于通過與鹽酸一起煮沸細菌可提取的表面蛋白劃分成M蛋白血清型。這樣已產生了 80個以上的血清型標識，它還可通過分子方法進行分型(emm基因)。化膿鏈球菌的某些M 蛋白血清型主要與咽炎和風濕熱相關，而其它的似乎主要引起了膿皮病和急性腎小球腎炎 {Cunningham, Μ.，2000}。此外，在引起咽炎及偶爾的中毒性休克中涉及的是C型和G型鏈球菌，它必須在咽喉培養后被識別出來{Hope-Simpson, R.，1981 ；Bisno, A.等，1987}。目前，鏈球菌感染只能用抗生素療法治療。不過，用抗生素治療的案例中有 25-30%顯示出疾病復發和/或在粘膜分泌物中流出了所述的生物體。目前尚未有預防療法(疫苗)可供避免鏈球菌感染。因此，仍然需要尋找一種有效的療法用于預防或減輕鏈球菌感染。疫苗不僅能預防鏈球菌的感染，還可更特異地預防或改善對宿主組織的定植，從而降低咽炎和其它化膿性感染的發生率。諸如風濕熱、急性腎小球腎炎、膿毒病、中毒性休克和壞死性筋膜炎等非化膿性后遺癥的消除是降低該生物體急性感染和攜帶發生率的直接后果。顯示出能起交叉保護作用以抵抗其它鏈球菌的疫苗也可用于預防或減輕由所有其它溶血性鏈球種引起的感染，即A、B、C和G族。疫苗可包含全部各種不同抗原。例如，抗原的實例是被完全殺死或減毒的生物體、這些生物體/組織的亞組分、蛋白質，或者，它們最簡單的形式-肽。抗原還可以糖基化的蛋白質或肽的形式被免疫系統所識別，而且還可是或者包含多糖或脂類。可以使用短肽，因為例如細胞毒性T細胞(CTL)識別通常形式短至8-11個氨基酸長的肽且與主要組織相容性復合體(MHC)結合的抗原。B-細胞可識別4-5個氨基酸短的線性表位以及三維結構(構象表位)。為了獲得持續不變的抗原特異性免疫應答，需要用佐劑觸發涉及所有必需的免疫系統細胞的免疫級聯反應。根本上，佐劑是作用于所謂的抗原呈遞細胞(APCs)，但不局限于其作用形式。這些細胞通常首先遇到抗原，然后將加工過或未修飾過的抗原呈遞于免疫效應器細胞上。還可涉及中間細胞類型。只有具有適當特異性的效應器細胞可在生產性免疫應答中被激活。佐劑還可局部保留抗原并與其它因子共同注射。此外，佐劑可用作其它免疫細胞的化學引誘物或可局部的和/或全身性地用作免疫系統的刺激劑。開發A族鏈球菌疫苗的方法主要集中于化膿鏈球菌的細胞表面M蛋白{Bessen， D.等，1988 ；Bronze, Μ.等，1988}。由于存在80多種不同的化膿鏈球菌M血清型且新的血清型不斷出現{Fischetti，V.，1989}，用有限數目的血清型特異的M蛋白或M蛋白衍生肽接種將不可能起到有效抵抗所有其它M血清型的保護作用。此外，已顯示M蛋白包含一段氨基酸序列，它與人的心臟組織具有免疫學交叉反應性，被認為是風濕熱相關性心臟瓣膜損傷的起因{Fenderson, P.等，1989}。疫苗開發還可考慮其它蛋白質，諸如紅斑毒素、鏈球菌熱原性外毒素A和鏈球菌熱原性外毒素B{Lee，P. K.，1989}。對這些毒素的免疫性可能預防鏈球菌中毒性休克的致命癥狀，但可能不預防A族鏈球菌的定植。利用上述蛋白質以及許多另外的候選分子作為抗原用于潛在疫苗{Ji，Y.等， 1997 ；Guzman, C.等，1999}主要是通過基于鑒定的方便性或獲得的機會進行選擇決定的。 需要鑒定針對化膿鏈球菌的有效和相關抗原。本發明的發明人研發了一種方法用于鑒定、分離和產生來自具體病原體的超免疫血清反應性抗原，特別是來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) (W0 02/059148)。不過，由于生物學特性、致病功能和遺傳背景的差異，化膿鏈球菌與葡萄球菌菌株是顯著不同的。重要的是，用于鑒定來自化膿鏈球菌的抗原的血清選擇是與應用于金黃色葡萄球菌篩選的血清選擇不同的。為此目的收集三種主要類型的人血清。首先，針對化膿鏈球菌的鼻咽攜帶，檢測年齡小于45周歲且優選家庭中有幼兒的健康成人。大部分幼兒是化膿鏈球菌的攜帶者，且就其家庭成員而言他們被認為是一暴露源。基于相關資料，保護性(集群中和)抗體有可能存在于非化膿鏈球菌攜帶者的被暴露的個體中(在家庭中具有高攜帶率的兒童)。為了選擇相應的血清來源，用細菌裂解物和培養物上清蛋白質進行檢測抗化膿鏈球菌IgG和IgA抗體水平的一系列ELISA。 在基于基因組的抗原鑒定中包括來自高效價非攜帶者的血清。用于人血清選擇的這種方法基本上與針對金黃色葡萄球菌的方法非常不同，其中攜帶和非攜帶狀態不能與抗體水平聯系起來。其次，以相同方式表征和選擇來自咽炎患者的血清樣品。獲自患有鏈球菌后遺癥-諸如急性風濕熱和腎小球腎炎的個體的第三組血清樣品主要用于確認的目的。此較后的一組幫助排除表位，它在這些患者中誘發了高水平的抗體，因為鏈球菌感染后疾病是與 GAS所誘導的抗體有關的且具有抗諸如心肌等人組織的反應性或者涉及腎小球炎中有害的免疫復合物的形成。兩個細菌種屬化膿鏈球菌和金黃色葡萄球菌自身的基因組顯示出了許多重要的差異。化膿鏈球菌含大約1. 85Mb，而金黃色葡萄球菌含2. 85Mb。它們的平均GC 含量分別為38. 5和33%且大約30-45%的編碼基因在這兩個病原體之間不是共有的。此夕卜，這兩個細菌種屬繁殖需要不同的生長條件和培養基。而化膿鏈球菌是嚴格的人類病原體，金黃色葡萄球菌還被發現可感染一系列溫血動物。下文中提供了可由所述的兩種病原體造成的一系列重要疾病。金黃色葡萄球菌主要引起醫院內的、條件性病原微生物感染膿皰病、濾泡炎、膿腫、癤子、被感染的傷口、心內膜炎、腦膜炎、膿毒性關節炎、肺炎、骨髓炎、 皮膚燙傷綜合征(SSS)、中毒性休克綜合征。化膿鏈球菌主要引起群落獲得性感染鏈球菌咽喉疼痛(發熱、滲出性扁桃體炎、咽炎)、鏈球菌皮膚感染、猩紅熱、產褥熱、敗血病、丹毒、 肛周蜂窩織炎、乳突炎、中耳炎、肺炎、腹膜炎、傷口感染、急性腎小球腎炎、急性風濕熱、中毒性休克樣綜合征、壞死性筋膜炎。關于本發明的問題是提供用于開發諸如抗化膿鏈球菌感染的疫苗等藥物的方法。 更具體而言，此問題是提供可用于所述藥物制備的來自化膿鏈球菌的一套有效、相關和全面的核酸分子或超免疫血清反應性抗原。因此，本發明提供了編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子，該核酸包含選自由下列各項組成的組的核酸序列a)與選自下列各項的核酸分子具有至少70%序列同一性的核酸分子Seq ID No 1、4-8、10-18、20、22、24-32、34-35、38-40、43-46、49-51、53-54、57-61、63、65-71、73、 75-77、81-82、88、91-94 和 96-150，b)與a)的核酸分子互補的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子的至少15個連續堿基的核酸分子，d)在嚴謹雜交條件下與a)、b)或C)的核酸分子退火的核酸分子，e)若非遺傳密碼的簡并性，可與a)、b)、c)或d)中所定義的核酸分子雜交的核酸分子。依照本發明優選的實施方案，序列同一性至少是80%，優選至少95%，尤其是 100%。此外，本發明提供了編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子，該核酸包含選自由下列各項組成的組的核酸序列a)與選自kq ID No 64的核酸分子具有至少96%的序列同一性的核酸分子，b)與a)的核酸分子互補的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子的至少15個連續堿基的核酸分子，d)在嚴謹雜交條件下與a)、b)或C)的核酸分子退火的核酸分子，e)若非遺傳密碼的簡并性，可與a)、b)、c)或d)中所定義的核酸雜交的核酸分子。根據另一方面，本發明提供了包含核酸序列的分離的核酸分子，所述核酸序列選自由下列各項組成的組a)選自 Seq ID No 3、36、47_48、55、62、72、80、84、95 的核酸分子，b)與a)的核酸互補的核酸分子，c)若非遺傳密碼的簡并性，可與a)、b)、c)或d)中所定義的核酸雜交的核酸分子。優選地，核酸分子是DNA或RNA。
依照本發明的優選實施方案，核酸分子分離自基因組DNA，尤其是來自化膿鏈球菌的基因組DNA。依照本發明提供了含有按照本發明任一方面的核酸分子的載體。在優選的實施方案中，改造所述載體使其適用于由按照本發明的核酸分子編碼的超免疫血清反應性抗原或其片段的重組表達。本發明還提供了含有按照本發明的所述載體的宿主細胞。根據另一方面，本發明進一步提供了所含氨基酸序列由按照本發明的核酸分子編碼的超免疫血清反應性抗原。在優選的實施方案中，氨基酸序列(多肽)選自Seq ID No 151、154_158、 160-168、170、172、174-182、184-185、188-190、193-196、199-201、203-204、207-211、213、 215-221、223、225-227、231-232、238、241-244 和 246-300。在另一優選的實施方案中，氨基酸序列(多肽)選自SEq ID No 214。在另一優選的實施方案中，氨基酸序列(多肽)選自kq ID No 153、186、 197-198、205、212、222、230、234、245。根據另一方面，本發明提供了超免疫血清反應性抗原的片段，其選自包含下列各項的氨基酸的肽表1欄“預測免疫原性氨基酸”和“已鑒定的免疫原性區域的位置”的氨基酸序列、表2血清反應性表位，尤其是含以下氨基酸序列的肽Seq ID No 151的第4_44 位、57-65 位、67-98 位、101-107 位、109-125 位、131-144 位、146-159 位、168-173 位、 181-186 位、191-200 位、206-213 位、229445 位、261-269 位、288-301 位、304-317 位、 323-3 位、350-361 位、374-384 位、388-407 位、416-425 和 1-114 位 Jeq ID No 152 的第 5-17 位、49-64 位、77-82 位、87-98 位、118-125 位、127-140 位、142-150 位、153-159 位、 191-207 位、212-218 位、226-270 位、274-287 位、297-306 位、325-331 位、340-347 位、 352-369 位、377-382 位、390-395 和四_2洸位 Jeq ID No 153 的第 4-16 位、20-26 位、 32-74 位、76-87 位、93-108 位、116-141 位、148-162 位、165-180 位、206-219 位、221-228 位、 230-236 位、239-245 位、257-268 位、313-328 位、330-335 位、353-359 位、367-375 位、 394-403 位、414-434 位、437-444 位、446-453 位、456-464 位、478-487 位、526-535 位、 541-552 位、568-575 位、577-584 位、589-598 位、610-618 位、624-643 位、653-665 位、 667-681 位、697-718 位、730-748 位、755-761 位、773-794 位、806-821 位、823-831 位、 837-845 位、862-877 位、879-889 位、896-919 位、924-930 位、935-940 位、947-955 位、 959-964 位、969-986 位、991-1002 位、1012-1036 位、1047-1056 位、1067-1073 位、 1079-1085 位、1088-1111 位、1130-1135 位、1148-1164 位、1166-1173 位、1185-1192 位、 1244-1254 和 919-9 位 feq ID No 154 的第 5-44 位、62-74 位、78-83 位、99-105 位、 107-113 位、124-134 位、161-174 位、176-194 位、203-211 位、216-237 位、241-247 位、 253-266 位、272-299 位、323-349 位、353-360 和 145-305 位 feq ID No 155 的第 15-39 位、 52-61 位、72-81 位、92-97 和 71-81 位 feq ID No 156 的第 13-19 位、21-31 位、40-108 位、 115-122 位、125-140 位、158-180 位、187-203 位、210-223 位、235445 和 173-186 位；Seq ID No 157 的第 5-12 位、19-27 位、29-39 位、59-67 位、71-78 位、80-88 位、92-104 位、 107-124 位、129-142 位、158-168 位、185-191 位、218-226 位、230-243 位、256-267 位、 272-277 位、283-291 位、307-325 位、331-344 位、346-352 和 316-331 位 Jeq ID No 158 的第 6- 位、43-53 位、60-76 位、93-103 和 21-99 位 feq ID No 159 的第 10-30 位、120-126 位、145-151 位、159-169 位、174-182 位、191-196 位、201-206 位、214-220 位、222-232 位、 254-272 位、292-307 位、313-323 位、332-353 位、361-369 位、389-396 位、401-415 位、 似8-439 位、465-481 位、510-517 位、560-568 和 9-264 位 feq ID No 160 的第 5- 位、 39-45 位、107-1 和 1-112 位 Jeq ID No 161 的第 4-38 位、42-50 位、54-60 位、65-71 位、 91-102 和 21-56 位 feq ID No 162 的第 4-13 位、19-25 位、41-51 位、54-62 位、68-75 位、 79-89 位、109-122 位、130-136 位、172-189 位、192-198 位、217-224 位、262-268 位、270-276 位、281-298 位、315-3 位、333-342 位、353-370 位、376-391 和 23-39 位 Jeq ID No 163 的第 6-41 位、49-58 位、62-103 位、117-124 位、147-166 位、173-194位、204-211 位、221-229 位、255-261 位、269-284 位、288-310 位、319-325 位、348-380 位、383-389 位、402-410 位、 424-443 位、467-479 位、496-517 位、535-553 位、555-565 位、574-581 位、583-591 和 474-489 位 Jeq ID No 164 的第 8_；35 位、52-57 位、66-73 位、81-88 位、108-114位、125-131 位、160-167 位、174-180 位、230-235 位、237-249 位、2M-262 位、278-285 位、308-314 位、 321-326 位、344-353 位、358-372 位、376-383 位、393-411 位、439-446 位、453-464 位、 471-480 位、485-492 位、502-508 位、523-529 位、533-556 位、558-563 位、567-584 位、 589-597 位、605-619 位、625-645 位、647-666 位、671-678 位、690-714 位、721-728 位、 741-763 位、766-773 位、777-787 位、792-802 位、809-823 位、849-864 和 37-241 位、409-5；34 位、582-604 位、743-804 位 Jeq ID No 165 的第 4-17 位、24-36 位、38-44 位、59-67 位、 72-90 位、92-121 位、126-149 位、151-159 位、161-175 位、197-215 位、217-227 位、241-247 位、257-264 位、266-275 位、277-284 位、293-307 位、315-321 位、330-337 位、345-350 位、 357-366 位、385-416 和 202-337 位 Jeq ID No 166 的第 4-20 位、22-46 位、49-70 位、80-89 位、96-103 位、105-119 位、123-129 位、153-160 位、181-223 位、227-233 位、236-243 位、 248-255 位、261-269 位、274-279 位、283-299 位、305-313 位、315-332 位、339-344 位、 349-362 位、365-373 位、380-388 位、391-397 位、402-407 和 1-48 位；Seq ID No 167 的第 18-37 位、41-63 位、100-106 位、109-151 位、153-167 位、170-197 位、199-207 位、212-229 位、232-253 位、273-297 和 203-217 位；Seq ID No 168 的第 20-26 位、54-61 位、80-88 位、 94-101 位、113-119 位、128-136 位、138-144 位、156-188 位、193-201 位、209-217 位、 221-229 位、239-244 位、251-257 位、270-278 位、281-290 位、308-315 位、319-332 位、 339-352 位、370-381 位、388-400 位、411-417 位、426-435 位、468-482 位、488-497 位、 499-506 位、512-521 和洸1-273 位 feq ID No 169 的第 6-12 位、16-36 位、50-56 位、86-92 位、115-125 位、143-152 位、163-172 位、193-203 位、235444 位、280-289 位、302-315 位、 325-348 位、370-379 位、399-405 位、411-417 位、419-429 位、441-449 位、463-472 位、 482-490 位、500-516 位、536-543 位、561-569 位、587-594 位、620-636 位、647-653 位、 659-664 位、677-685 位、687-693 位、713-719 位、733-740 位、746-754 位、756-779 位、 792-799 位、808-817 位、822-828 位、851-865 位、902-908 位、920-938 位、946-952 位、 969-976 位、988-1005 位、1018-1027 位、1045-1057 位、1063-1069 位、1071-1078 位、 1090-1099 位、1101-1109 位、1113-1127 位、1130-1137 位、1162-1174 位、1211-1221 位、 1234-1242 位、1261-1268 位、1278-1284 位、1312-1317 位、1319-1326 位、1345-1353 位、 1366-1378 位、1382-1394 位、1396-1413 位、1415-1424 位、1442-1457 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位、289-295 位、297-306 位、308-315 位、323-352 位、 357-371 位、381-390 位、394-401 位、404-415 位、417-425 位、427-462 位、466-483 位、 485-496 位、502-507 位、520-5 位、531-541 位、553-570 位、577-588 位、591-596 位、 600-610 位、619-632 位、642-665 位、671-692 位、694-707 和 434-444 位 feq ID No 177 的第 6-14 位、16-25 位、36-46 位、52-70 位、83-111 位、129-138 位、140-149 位、153-166 位、 169-181 位、188-206 位、212-220 位、223-259 位、261-269 位、274-282 位、286493 位、 297-306 位、313-319 位、329-341 ^,343-359 位、377-390 位、409-415 位、425-430 和 360-375 位；Seq ID No 178 的第 4-26 位、28-48 位、54-62 位、88-121 位、147-162 位、 164-201 位、203-237 位、245-251 和 254-260 位 Jeq ID No 179 的第 12-21 位、26-32 位、 66-72 位、87-93 位、98-112 位、125-149 位、179-203 位、209-226 位、233-242 位、249-261 位、 266-271 位、273-289 位、293-318 位、346-3M 位、360-371 位、391-400 和 369-382 位；Seq ID No 180 的第 11-38 位、44-65 位、70-87 位、1四-1；35 位、140-163 位、171-177 位、225-232 位、238-249 位、258-266 位、271-280 位、284-291 位、295-300 位、329-337 位、344-352 位、 405-412 位、416-424 位、426-434 位、436-455 位、462-475 位、478-487 和 270-312 位；Seq ID No 181 的第 5-17 位、34-45 位、59-69 位、82-88 位、117-129 位、137-142 位、158-165 位、 180-195 位、201-206 位、219-226 位、241-260 位、269-279 位、292-305 位、312-321 位、 341-347 位、362-381 位、396-410 位、413-432 位、434-445 位、447-453 位、482-487 位、 492-499 位、507-516 位、546-552 位、556-565 位、587-604 和 486-598 位；Seq ID No 182 的第 4-15 位、17-32 位、40-47 位、67-78 位、90-98 位、101-107 位、111-136 位、161-171 位、 184-198 位、208-214 位、234445 位、247-254 位、272-279 位、288-298 位、303-310 位、 315-320 位、327-333 位、338-349 位、364-374 和 378-396 位；Seq ID No 183 的第 5-27 位、 33-49 位、51-57 位、74-81 位、95-107 位、130-137 位、148-157 位、173-184 和 75-235 位；Seq ID No 184 的第 6-23 位、47-53 位、57-63 位、75-82 位、97-105 位、113-122 位、124-134 位、 142-153 位、159-164 位、169-179 位、181-187 位、192-208 位、215-243 位、247-257 位、 285-290 位、303-310 和 30-51 位；Seq ID No 185 的第 17-29 位、44-52 位、59-73 位、77-83 位、86-92 位、97-110 位、118-153 位、156-166 位、173-179 位、192-209 位、225-231 位、234-240 位、245-251 位、260-268 位、274-279 位、297-306 ^,328-340 位、353-360 位、 369-382 位、384-397 位、414-423 位、431-436 位、452-465 位、492-498 位、500-508 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和 617-6；35 位 feq ID No 189 的第 7-25 位、30-40 位、42-64 位、70-77 位、85-118 位、120-166 位、169-199 位、202-213 位、 222-244 和 190-203 位；SeqID No 190 的第 4-11 位、15-53 位、55-93 位、95-113 位、120-159 位、164-200 位、210-243 位、250-258 位、261-283 位、298-319 位、327-340 位、356-366 位、 369-376 位、380-386 位、394-406 位、409-421 位、425-435 位、442-454 位、461-472 位、 480-490 位、494-505 位、507-514 位、521-527 位、533-544 位、566-574 和 385-398 位；Seq ID No 191 的第 5-36 位、66-72 位、120-127 位、146-152 位、159-168 位、172-184位、205-210 位、221-232 位、234443 位、251-275 位、295-305 位、325-332 位、367-373 位、470-479 位、 482-487 位、520-548 位、592-600 位、605-615 位、627-642 位、655-662 位、664-698 位、 718-725 位、734-763 位、776-784 位、798-809 位、811-842 位、845-852 位、867-872 位、879-888 位、900-928 位、933-940 位、972-977 位、982-1003 和 12-190 位、276-283 位、 666-806 位 Jeq ID No 192 的第 4-38 位、63-68 位、100-114 位、160-173 位、183-192 位、 195-210 位、212-219 位、221-238 位、240-256 位、258-266 位、274490 位、301-311 位、 313-319 位、332-341 位、357-363 位、395-401 位、405-410 位、420-426 ^,435-450 位、 453-461 位、468-475 位、491-498 位、510-518 位、5四_537 位、545-552 位、585-592 位、 602-611 位、634-639 位、650-664 和 30-80 位、89-105 位、111-151 位 feq ID No 193 的第 7-29 位、31-39 位、47-54 位、63-74 位、81-94 位、97-117 位、122-127 位、146-157 位、168-192 位、195-204 位、216-240 位、251-259 和 195-203 位；SeqID No 194 的第 5-16 位、28-34 位、 46-65 位、79-94 位、98-105 位、107-113 位、120-134 位、147-158 位、163-172 位、180-186 位、 226-233 位、237-251 位、253-259 位、275-285 位、287494 位、302-308 位、315-321 位、 334-344 位、360-371 位、399-412 位、420-426 和 32-50 位；Seq ID No 195 的第 8-20 位、 30-36 位、71-79 位、90-96 位、106-117 位、125-138 位、141-147 位、166-174 和 75-90 位；Seq ID No 196 的第 4-13 位、15-33 位、43-52 位、63-85 位、98-114 位、131-139 位、146-174 位、 186-192 位、198-206 位、227-233 和 69-88 位；Seq ID No 197 的第 4-22 位、29_；35 位、59-68 位、153-170 位、213-219 位、224-238 位、240-246 位、263-270 位、285-292 位、301-321 位、 327-346 位、356-371 位、389-405 位、411-418 位、421-427 位、430-437 位、450-467 位、 472-477 位、482-487 位、513-518 位、531-538 位、569-576 位、606-614 位、637-657 位、 662-667 位、673-690 位、743-753 位、760-767 位、770-777 位、786-802 和 96-230 位、361-491 位、572-585 位；SeqID No 198 的第 4-12 位、21-36 位、48-55 位、74-82 位、121-127 位、 195-203 位、207-2 位、247-262 位、269-278 位、280-289 和 102-210 位 Jeq ID No 199 的第 13-20 位、23-31 位、38-44 位、78-107 位、110-118 位、122-144 位、151-164 位、176-182 位、190-198 位、209-216 位、219-243 位、251-256 位、289-304位、306-313 和 240-248 位；Seq ID No200 的第 5-26 位、34-48 位、57-77 位、84-102 位、116-132 位、139-145 位、150-162 位、 165-173 位、176-187 位、192-205 位、216-221 位、234448 位、250-260 和 182-198 位；Seq ID No 201 的第 10-19 位、26-44 位、53-62 位、69-87 位、90-96 位、121-127 位、141-146 位、 148-158 位、175-193 位、204-259 位、307-313 位、334-348 位、360-365 位、370-401 位、 411-439 位、441-450 位、455-462 位、467-472 位、488-504 和 41-56 位 Jeq ID No 202 的第 5-21 位、36-42 位、96-116 位、123-130 位、138-144 位、146-157 位、184-201 位、213-228 位、 252-259 位、277-297 位、308-313 位、318-323 位、327-333 和 202-217 位；Seq ID No203 的第 6-26 位、33-51 位、72-90 位、97-131 位、147-1M 位、164-171 位、187-216 位、231-236 位、 260-269 位、275-283 和 1-127 位；Seq IDNo 204 的第 4-22 位、24-38 位、44-58 位、72-88 位、 99-108 位、110-117 位、123-129 位、131-137 位、142-147 位、167-178 位、181-190 位、 206-214 位、217-223 位、271-282 位、290-305 位、320-327 位、329-336 位、343-352 位、 354-364 位、396-402 位、4邪_434 位、451-456 位、471-477 位、485-491 位、515-541 位、 544-583 位、595-609 位、611-626 位、644-656 位、660-681 位、683-691 位、695-718 和 297-458 位 JeqID No 205 的第 5-43 位、92-102 位、107-116 位、120-130 位、137-144 位、 155-163 位、169-174 位、193-213 和 24-1；35 位；Seq ID No 206 的第 4-25 位、61-69 位、 73-85 位、88-95 位、97-109 位、111-130 位、135-147 位、150-157 位、159-179 位、182-201 位、 206-212 位、2M-248 位、253-260 位、287-295 位、314-331 位、338-344 位、365-376 位、396-405 位、413-422 位、4M-430 位、432-449 位、478-485 位、487-494 位、503-517 位、 522-536 位、544-560 位、564-578 位、585-590 位、597-613 位、615-623 位、629-636 位、 640-649 位、662-671 位、713-721 和 176-330 位 Jeq ID No 207 的第 31-37 位、41-52 位、 58-79 位、82-105 位、133-179 位、184-193 位、199-205 位、209-226 位、256-277 位、281-295 位、297-314 位、322-328 位、331-337 位、359-367 位、379-395 位、403-409 位、417-432 位、 442-447 位、451-460 位、466-472 和 46-62 位、296-341 位 feq ID No 208 的第 23- 位、 56-63 位、67-74 位、96-108 位、122-132 位、139-146 位、152-159 位、167-178 位、189-196 位、 214-231 位、247-265 位、274-293 位、301-309 位、326-332 位、356-363 位、378-395 位、 406-412 位、436-442 位、445-451 位、465-479 位、487-501 位、528-555 位、567-581 位、 583-599 位、610-617 位、622-629 位、638-662 位、681-686 位、694-700 位、711-716 和 667-684 位 Jeq ID No 209 的第 20-51 位、53-59 位、109-115 位、140-1M 位、185-191 位、 201-209 位、212-218 位、234-243 位、253-263 位、277-290 位、303-313 位、327-337 位、 342-349 位、374-382 位、394-410 位、436-442 位、464-477 位、486-499 位、521-530 位、 536-550 位、560-566 位、569-583 位、652-672 位、680-686 位、698-704 位、718-746 位、 758-770 位、774-788 位、802-827 位、8；35-842 位、861-869 和 258-416 位 Jeq ID No 210 的第 7-25 位、39-45 位、59-70 位、92-108 位、116-127 位、161-168 位、202-211 位、217-227 位、 229-239 位、254-262 位、271-278 位、291-300 和 278-295 位；Seq ID No 211 的第 4-20 位、 27-33 位、45-51 位、53-62 位、66-74 位、81-88 位、98-111 位、124-130 位、136-144 位、 156-179 位、183-191 和 183-195 位；SeqID No 212 的第 12-24 位、27-33 位、43-49 位、55-71 位、77-85 位、122-131 位、168-177 位、179-203 位、209-214 位、226H 和 63-238 位；Seq ID No 213 的第 4-19 位、37-50 位、120-126 位、131-137 位、139-162位、177-195 位、200-209 位、211-218 位、233-256 位、260-268 位、271-283 位、288-308 和 1-141 位 Jeq ID No 214 的第 11-17 位、40-47 位、57-63 位、96-124 位、141-162 位、170-207 位、223-235 位、241-265 位、271-277 位、281-300 位、312-318 位、327-333 位、373-379 和 231-368 位 feq ID No 215 的第 9-33 位、41-48 位、57-79 位、97-103 位、113-138 位、146-157 位、165-186 位、195-201 位、209-215 位、223-2 位、237-247 位、277-286 位、290-297 位、328-342 和 247-260 位；kq ID No 216 的第 7-15 位、39-45 位、58-64 位、79-84 位、97-127 位、130-141 位、163-176 位、 195-203 位、216-225 位、2；35-247 位、254-264 位、271-279 和 64-72 位 Jeq ID No 217 的第 4-12 位、26-42 位、46-65 位、73-80 位、82-94 位、116-125 位、135-146 位、167-173 位、 183-190 位、232-271 位、274-282 位、300-306 位、320-343 位、351-362 位、373-383 位、 385-391 位、402-409 位、414-426 位、434-455 位、460-466 位、473-481 位、485-503 位、 519-525 位、533-542 位、554-565 位、599-624 位、645-651 位、675-693 位、717-725 位、 751-758 位、767-785 位、792-797 位、801-809 位、819-825 位、831-836 位、859-869 位、 890-897 和 222-362 位、756-896 位；Seq ID No 218 的第 11-17 位、22-28 位、52-69 位、 73-83 位、86-97 位、123-148 位、150-164 位、166-177 位、179-186 位、188-199 位、219-225 位、229443 位、250-255 和 153-170 位；Seq ID No 219 的第 4-61 位、71-80 位、83-90 位、 92-1 位、133-153 位、167-182 位、184-192 位、198-212 和 56-73 位 Jeq ID No 220 的第 4-19 位、26-37 位、45-52 位、58-66 位、71-77 位、84-92 位、94-101 位、107-118 位、120-133 位、156-168 位、170-179 位、208-216 位、228-238 位、253-273 位、280-296 位、303-317 位、326-334 和 298-312 位；Seq ID No 221 的第 7-13 位、27-35 位、38-56 位、85-108 位、 113-121 位、123-160 位、163-169 位、172-183 位、188-200 位、206-211 位、219-238 位、 247-254 和 141-157 位；Seq ID No222 的第 23-39 位、45-73 位、86-103 位、107-115 位、 125-132 位、137-146 位、148-158 位、160-168 位、172-179 位、185-192 位、200-207 位、 210-224 位、233-239 位、246-255 位、285-334 位、338-352 位、355-379 位、383-389 位、 408-417 位、423-429 位、446-456 位、460-473 位、478-503 位、522-540 位、553-562 位、 568-577 位、596-602 位、620-636 位、640-649 位、655-663 和 433-440 位、572-593 位；Seq ID No 223 的第 4-42 位、46-58 位、64-76 位、118-124 位、130-137 位、148-156 位、164-169 位、175-182 位、187-194 位、203-218 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ID No 243 的第 6-11 位、17-25 位、 53-58 位、80-86 位、91-99 位、101-113 位、123-131 位、162-169 位、181-188 位、199-231 位、 245-252 和 84-254 位 Jeq ID No 244 的第 13-30 位、71-120 位、125-137 位、139-145 位、 184-199 和 61-78 位 Jeq ID No 245 的第 9-30 位、38-53 位、63-70 位、74-97 位、103-150 位、158-175 位、183-217 位、225-253 位、260-268 位、272-286 位、290-341 位、352-428 位、 434-450 位、453-460 位、469-478 位、513-525 位、527-534 位、554-563 位、586-600 位、 602-610 位、624-640 位、656-684 位、707-729 位、735-749 位、757-763 位、766-772 位、 779-788 位、799-805 位、807-815 位、819-擬6 位、831-855 和 568-580 位 Jeq ID No 246 的第 11-21 位、29-38 和 5-17 位；Seq ID No 247 的第 2-9 位；Seq ID No 248 的第 4-10 位、 16-28 和 7-18 位、26-34 位；Seq ID No 249 的第 10-16 和 1-15 位；Seq ID No 250 的第 4-11 位 feq ID No 251 的第 4-40 位、42-51 和 37-53 位 feq ID No 252 的第 4-21 和 22-29 位；Seq ID No 253 的第 2-11 位；9-17 位、Seq ID No 254 的第 32-44 和 1-22 位；Seq ID No 255 的第 19-25 位、27-32 和 15-34 位 Jeq ID No 256 的第 4-12 位、15-22 和 11-33 位； Seq ID No 257 的第 10-17 位、24-30 位、39-46 位、51-70 和 51-61 位 feq ID No 258 的第 6-19 位；Seq ID No 259 的第 6-11 位、21-27 位、31-54 和 1H9 位 Jeq ID No 260 的第 4-10 位、13-45 和 11-；35 位 Jeq ID No 261 的第 4-14位、23-32 和 11_；35 位 Jeq ID No 262 的第 14-39 位、45-51 和 15- 位 Jeq ID No 263 的第 4-11 位、14- 和 4-17 位 Jeq ID No 264 的第 4-16 和 2-16 位 jeq ID No 265 的第 4-10 位、12-19 位、39-50 和 6-22 位; SeqID No 266 的第 2-13 位 Jeq ID No 267 的第 4-11 位、22-65 和 3-19 位 feq ID No 268 的第 17-23 位、30-35 位、39-46 位、57-62 和 30-49 位；Seq ID No 269 的第 4-19 和 14-22 位 Jeq ID No 270 的第 2-9 位 Jeq ID No 271 的第 7-18 位、30-43 和 4-12 位 feq ID No 272 的第 4-30 位、39-47 和 5-22 位 Jeq ID No 273 的第 6-15 和 14- 位 Jeq ID No 274 的第 4-34 和 23-35 位；Seq ID No 275 的第 4-36 位、44-57 位、65-72 和 14-27 位；Seq ID No 276 的第 4-18 和 11-20 位 Jeq ID No 277 的第 5-19 位 Jeq ID No 278 的第 18-36 和 6-20 位 feq ID No 279 的第 4-10 位、19-34 位、41-84 位、96-104 和 50-63 位 feq ID No 280 的第 4-9 位、19-27 和 8-21 位 Jeq ID No 281 的第 4-16 位、18- 和 22-30 位 Jeq IDNo 282 的第 4-15 和 21_；35 位 feq ID No 283 的第 4-17 和 3-13 位 feq ID No 284 的第 4-12 和 4-18 位 Jeq ID No 285 的第 4-24 位、31_36和四_45 位 feq ID No 286 的第 12-22 位、34-49 和 21-32 位 Jeq ID No 287 的第 4-17 和 22-32 位 Jeq ID No 288 的第 4-16 位、 25-42 和 7- 位 Jeq ID No 289 的第 4-10 和 7-20 位 Jeq ID No 290 的第 4-11 位、16-36 位、39-54 和沘-44 位 Jeq ID No 291 的第 5-20 位、29-54 和 14- 位 feq ID No 292 的第 24-33 和 10-22o 位；Seq ID No 293 的第 10-51 位、54-61 和 43-64 位；Seq ID No294 的第 7-13 和 2-17 位 jeq ID No 295 的第 11_20 和 6_20 位 Jeq ID Nc^96 的第 4-30 位、 34-41 和 19-28 位；Seq ID No 297 的第 11-21 位；Seq ID No 298 的第 4-16 位、2116 禾口 9-38 位 Jeq ID No 四9 的第 4-12 位、15-27 位、30-42 位、66-72 和 10-24 位 feq ID No 300 的第 8-17 和 11-20 位；以及 kq ID No 246 的第 2-19 位；Seq ID No 247 的第 1-12 位 Jeq ID No248 的第 21-38 位 feq ID No 254 的第 2-22 位 Jeq ID No 255 的第 15-33 位 Jeq ID No 256 的第 11-32 位 Jeq ID No 259 的第 1H8 位 Jeq ID No260 的第 10-27 位 Jeq ID No 261 的第 946 位 Jeq ID No 263 的第 4-16 位 Jeq ID No 266 的第 1-18 位；Seq ID No 273 的第 12-29 位；Seq ID No276 的第 6-23 位；Seq ID No 277 的第 1-21 位Jeq ID No 279的第47-64位feq ID No沘5的第沘_45位feq ID No沘7的第 18-35 位 Jeq ID No291 的第 14-31 位 feq ID No 292 的第 7-M 位 Jeq ID No 299 的第 8-25 位；Seq ID No 300 的第 1-20 位；Seq ID No 151 的第 18-33 位；Seq ID Nol51 的第 62-72 位；Seq ID No 152 的第 118-131 位；Seq ID No 巧4 的第 195-220 位；Seq ID No 154 的第 215-240 位 feq ID No 154 的第 255-280 位 Jeq ID No 155 的第 72-81 位 Jeq ID No 156 的第 174-186 位 feq ID No 157 的第 317-331 位 feq ID No 158 的第；35_59 位； Seq ID No 158 的第 54-84 位；Seq ID No 158 的第 79-104 位；Seq ID No 159 的第 33-58 位 Jeq ID No 159 的第 81-101 位 feq ID No 159 的第 136-150 位 Jeq ID No 159 的第 173-186 位 feq ID No 159 的第 231-251 位 feq ID No 161 的第 22-48 位 feq ID No 162 的第 M-39 位 feq ID No 163 的第 475-489 位 Jeq ID No 164 的第 38-56 位 Jeq ID No 164 的第 583-604 位 Jeq ID No 165 的第 202-223 位 Jeq ID No 165 的第 222-247 位 feq ID No 165 的第 M2-267 位 Jeq ID No 165 的第洸2-287 位 feq ID No 165 的第沘2_307 位 Jeq ID No 165 的第 302-327 位 Jeq ID No 166 的第 25-48 位 Jeq ID No 167 的第 204-217 位 feq ID No 168 的第 259-276 位 feq ID No 169 的第 121-139 位 feq ID No 169 的第洸0-267 位 Jeq ID No 169 的第 215-240 位 Jeq ID No 170 的第 115-140 位 Jeq ID No 172 的第 182-204 位；Seq ID No 173 的第 144-153 位；Seq ID No 173 的第 205-219 位 JeqID No 174 的第 196-206 位 Jeq ID No 174 的第 240-249 位 Jeq ID No 174 的第 272-287 位；Seq ID No 174 的第 199-223 位；Seq ID No 174 的第 218-237 位；Seq ID No 175 的第 226-249 位 Jeq ID No 175 的第沘7_306 位 Jeq ID No 176 的第 430-449 位 Jeq ID No 177 的第 61-375 位 feq ID No 178 的第 241-260 位 feq ID No 181 的第 483-502 位；Seq ID No 182 的第 379-396 位；Seq ID No 184 的第 31-51 位；Seq ID No 186 的第 1436-1460 位 Jeq ID No 186 的第 1455-1474 位 feq ID No 186 的第 1469-1487 位 Jeq ID No 187 的第 215-2 位 Jeq ID No 187 的第 5；34_561 位 Jeq ID No 187 的第 59-84 位 Jeq ID No 187 的第 79-104 位 Jeq ID No 188 的第 618_6；35 位 Jeq ID No 189 的第 191-203 位 feq ID No 190 的第 386-398 位 feq ID No 191 的第 65-83 位 feq ID No 192的第 90-105 位；Seq ID No 192 的第 112-136 位；Seq ID No 193 的第 290-209 位 feqID No 194 的第 33-50 位 Jeq ID No 195 的第 76-90 位 Jeq ID No 196 的第 70-88 位 feq ID No 197 的第 418-442 位；Seq ID No 197 的第 574-585 位；Seq ID No 198 的第 87-104 位；Seq ID No 198 的第 124-148 位；Seq ID No 198 的第 141-152 位；Seq ID No 199 的第 241-248 位；Seq ID No 200 的第 183-198 位；Seq ID No 200 的第 40-57 位；Seq ID No 202 的第 202-217 位 Jeq ID No 203 的第 50-74 位 Jeq ID No 203 的第 69_93Seq ID No 203 的第 88-112 位；Seq ID No 的第 203107-127 位；Seq ID No 205 的第 74-92 位；Seq ID No 206 的第 207-232 位 Jeq ID No 206 的第 227-252 位 Jeq ID No 206 的第 M7-272 位 feq ID No 207 的第 47-60 位 Jeq ID No 207 的第四7_305 位 Jeq ID No 207 的第 312-337 位；Seq ID No 208 的第 667-384 位；Seq ID No 210 的第 279-295 位；Seq ID No 211 的第 179-198 位；Seq ID No 213 的第 27-51 位；Seq ID No 213 的第 46-70 位；Seq ID No213 的第 65-89 位 Jeq ID No 213 的第 84-108 位 Jeq ID No 213 的第 112-141 位 Jeq ID No 215 的第 248-260 位；Seq ID No 216 的第 59-78 位；Seq ID No 218 的第 1M-170 位；Seq ID No 219 的第 57-73 位；Seq ID No 220 的第 297-314 位；Seq ID No 221 的第 142-157 位 Jeq ID No 222 的第 428-447 位 Jeq ID No 222 的第 573-593 位 Jeq ID No 223 的第 523-544 位 feq ID No 223 的第 46-70 位 Jeq ID No 223 的第 65-89 位 Jeq ID No223 的第 84-108 位 Jeq ID No 223 的第 122-151 位 Jeq ID No 2 的第 123-142 位 feq ID No 225 的第 903-921 位 Jeq ID No 2 的第 119-136 位 feq ID No 227 的第 142-161 位 Jeq ID No 2 的第 258-277 位 Jeq ID No 2 的第 272-300 位 feq ID No 2 的第四5_322 位 Jeq ID No 2 的第 311-343 位 Jeq ID No 2 的第 278-304 位 feq ID No 230 的第 131-150 位 Jeq ID No 230 的第 195-218 位 Jeq ID No 231 的第 53-70 位 Jeq ID No 232 的第 184-208 位；Seq ID No 232 的第 222-246 位；Seq ID No232 的第 241-265 位；Seq ID No 232 的第洸0484 位 Jeq ID No 232 的第 279-303 位 feq ID No 232 的第 317-341 位； Seq ID No 233 的第 678-696 位 Jeq ID No 2；35 的第 88-114 位 Jeq ID No 2；35 的第 464-481 位 feq ID No 236 的第 153-172 位 Jeq ID No 236 的第 137-155 位、166-184 位； Seq ID No 236 的第 215-2 位 Jeq ID No 237 的第 37-51 位 feq ID No 237 的第 53-75 位 Jeq ID No 237 的第 232-251 位 Jeq ID No 237 的第 318-336 位 Jeq ID No 238 的第 305-315 位 feq ID No 238 的第 131-156 位 JeqID No 241 的第 258-275 位 feq ID No 243 的第 107-137 位 Jeq ID No 243 的第 138-162 位 Jeq ID No 243 的第 157-181 位 feq ID No 243 的第 195-227 位 Jeq ID No 244 的第 62-78 位 Jeq ID No 245 的第 567-584 位。本發明還提供了產生按照本發明的化膿鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段的方法，包括在適當的表達系統中表達按照本發明的一個或多個核酸分子。此外，本發明提供了用于產生表達按照本發明的化膿鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段的細胞的方法，包括用按照本發明的載體轉化或轉染適當的宿主細胞。依照本發明提供了含有本發明中所定義的超免疫血清反應性抗原或其片段或本發明中所定義的核酸分子的藥物組合物，尤其是疫苗。在優選的實施方案中，藥物組合物進一步包含免疫刺激物質，優選選自包含下列各項的組聚陽離子聚合體，尤其是聚陽離子肽；免疫刺激性脫氧核苷酸(ODNs)；含至少兩個賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸基序的肽，尤其是KLKL5KLK ；刺激神經組織的化合物，尤其是人生長激素；清蛋白，弗氏完全或不完全佐劑或它們的組合。在更優選的實施方案中，免疫刺激物質是聚陽離子聚合體與免疫刺激性脫氧核苷酸的組合或含至少兩個賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸基序的肽和免疫刺激性脫氧核苷酸的組
合O在還更優選的實施方案中，聚陽離子聚合體是聚陽離子肽，尤其是多精氨酸。依照本發明提供了按照本發明的核酸分子或按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段在制備藥物制劑，尤其是制備抗化膿鏈球菌感染的疫苗中的應用。同此還提供了至少與按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的選擇性部分結合的抗體或至少其有效部分。在優選的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在另一優選的實施方案中，所述抗體的有效部分包含Fab片段。在另一優選的實施方案中，所述抗體是嵌合抗體。在更優選的實施方案中，所述抗體是人源化抗體。本發明還提供了生產按照本發明的抗體的雜交瘤細胞系。此外，本發明提供了生產按照本發明的抗體的方法，其特征在于以下步驟·按照本發明中所定義的，通過對所述動物施用超免疫血清反應性抗原或其片段在非人動物體內引發免疫應答，·從所述動物中取出含抗體的體液，并 通過將所述含抗體的體液進行進一步的純化步驟生產該抗體。此外，本發明還提供了生產按照本發明的抗體的方法，其特征在于以下步驟·按照本發明中所定義的，通過對所述動物施用超免疫血清反應性抗原或其片段在非人動物體內引發免疫應答，·從所述動物體內取出脾臟或脾細胞，·產生所述脾臟或脾細胞的雜交瘤細胞，·選擇并克隆對所述超免疫血清反應性抗原或其片段特異的雜交瘤細胞，·通過培養所述被克隆的雜交瘤細胞和任選進一步的純化步驟生產抗體。依照以上方法提供或生產的抗體可用于制備治療或預防化膿鏈球菌感染的藥物。依照另一方面，本發明提供了與按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段結合的拮抗劑。這樣的能與按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段結合的拮抗劑可用包含以下步驟的方法進行鑒定a)在能提供響應候選拮抗劑與所述超免疫血清反應性抗原或其片段的結合的可檢測信號的組分的存在下，將按照本發明的分離的或固定的超免疫血清反應性抗原或其片段與候選的拮抗劑在允許所述候選拮抗劑結合所述超免疫血清反應性抗原或其片段的條件下結合，并b)檢測響應拮抗劑與超免疫血清反應性抗原或其片段結合所產生的信號的存在或不存在。能降低或抑制按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段與其相互作用配體之間的相互作用活性的拮抗劑可通過包含以下步驟的方法進行鑒定a)提供按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其超免疫片段，b)提供針對所述超免疫血清反應性抗原或其片段的相互作用配體，尤其是按照本發明的抗體，c)使所述的超免疫血清反應性抗原或其片段與所述的相互作用配體相互作用形成相互作用復合物，d)提供候選拮抗劑，e)允許候選拮抗劑和所述的相互作用復合物之間發生競爭性反應，f)確定候選拮抗劑是否抑制或降低了超免疫血清反應性抗原或其片段與相互作用配體之間的相互作用活性。按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段可用于分離和/或純化和/或鑒定所述超免疫血清反應性抗原或其片段的相互作用配體。本發明還提供了在體外診斷涉及按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的疾病的方法，包括測定編碼所述的按照本發明的超免疫血清反應性抗原或片段的核酸序列的存在或按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的存在。本發明還提供了在體外診斷細菌感染，尤其是化膿鏈球菌感染的方法，包括分析編碼所述的按照本發明的超免疫血清反應性抗原或片段的核酸序列的存在或按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的存在。此外，本發明提供了按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段在生產結合所述超免疫血清反應性抗原或其片段的肽中的應用，其中的肽是抗促成素(anticaline)。本發明還提供了按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段在制備功能性核酸中的應用，其中的功能性核酸選自包含適體(aptamer)和spiegelmer的組。按照本發明的核酸分子也可用于制備功能性核糖核酸，其中的功能性核糖核酸選自核酶、反義核酸和siRNA。本發明有利地提供了一套有效、相關且全面的分離的核酸分子以及它們編碼的超免疫血清反應性抗原或其片段，它們可利用來自多個人血漿庫的抗體制劑和來自化膿鏈球菌基因組的表面表達文庫從化膿鏈球菌中鑒定而來。因此，本發明滿足了對用于制備抗體和用于鑒定有效抗化膿鏈球菌感染的化合物的化膿鏈球菌抗原、疫苗、診斷劑和產品的廣泛需求。有效的疫苗應由蛋白質或多肽組成，它們可由所有菌株表達并能誘導高親和力的、豐富的抗化膿鏈球菌細胞表面組分的抗體。所述的抗體應是用于調理作用的IgGl和/ 或IgG3，以及用于中和粘附和毒素作用的任何IgG亞型和IgA。化學定義的疫苗必定確實優于全細胞疫苗(減毒的或滅活的)，因為可除去與人組織交叉反應或抑制調理作用的化膿鏈球菌組分{WhitnaCk，E.等，198 ，而且可選擇誘發保護性抗體和/或保護性免疫反應的個別蛋白質。已應用于本發明的方法是以A族鏈球菌蛋白質或肽與人血清中存在抗體之間的相互作用為基礎的。由人免疫系統產生且存在于人血清中的抗化膿鏈球菌抗體是抗原性蛋白質體內表達以及它們的免疫原性的指征。此外，用預選擇的血清庫通過細菌表面展示表達文庫鑒定的抗原性蛋白質在用單獨選擇或產生的血清進行的第二輪和第三輪篩選中被加工。由此本發明提供了一套有效的、相關的、全面的A族鏈球菌抗原作為藥物組合物，尤其是預防化膿鏈球菌感染的疫苗。在用于鑒定按照本發明的一組全面的抗原的抗原鑒定程序中，用數個血清庫或血漿組分或含其它集合抗體的體液(抗體庫)篩選了至少兩個不同的細菌表面表達文庫。抗體庫來自血清樣品集合，已針對化膿鏈球菌的抗原性化合物對所述集合進行了檢測，諸如全細胞提取物和培養物上清蛋白質等。優選地，使用兩種不同的血清集合1.用非常穩定的抗體所有組分(repertoire)正常成人，臨床健康人群，他們是非攜帶者且克服了先前的遭遇或目前正攜帶化膿鏈球菌但無急性疾病和癥狀的人群，2.由于致病生物體的存在而具有急性誘發抗體的血清集合具不同表現的急性疾病患者(如化膿鏈球菌咽炎、傷口感染和菌血癥)。血清必須與多個A族鏈球菌特異抗原反應反應，以便被認為是超免疫和因此與用于本發明的篩選方法相關。由人免疫系統產生并存在于人血清中的抗鏈球菌抗體是抗原性蛋白質體外表達及其免疫原性的指征。表達文庫用于本發明中時應可以表達所有潛在的抗原，例如，來自化膿鏈球菌所有表面蛋白質的抗原。細菌表面展示文庫用于在細菌宿主膜上許多選定的外膜蛋白上展示一組(全部)A族鏈球菌所表達肽序列的細菌宿主重組文庫代表{Ge0rgi0U，G.，1997 ；Etz, H.等，2001}。使用重組表達文庫的優勢之一在于確定的超免疫血清反應性抗原可通過表達被篩選和選擇且表達超免疫血清反應性抗原的克隆的編碼序列即刻產生，而無需另外的重組DNA技術或克隆步驟。用一輪或多輪另外的篩選進一步分析根據本發明所述程序鑒定的一組全面的抗原。因此利用了抗選定的具免疫原性的肽的單個抗體制劑或抗體。依照優選的實施方案， 用于第二輪篩選的單獨抗體制劑來自A族鏈球菌急性感染患者，尤其是顯示出抗體效價高于一定最低水平的患者，例如抗體效價高于被測試人(患者或健康個體)血清的80個百分點，優選高于90個百分點，尤其是高于95個百分點。在第二輪篩選中應用所述的高效價單獨抗體制劑可以高選擇性的鑒定來自化膿鏈球菌的超免疫血清反應性抗原及其片段。在高通量的篩選步驟之后，如果不能表達于原核表達系統中則可表達為重組蛋白或體外翻譯產物的選定抗原性蛋白或者已被鑒定的抗原性肽(合成產生)在第二輪篩選中用巨大的人血清集合(> 100名未感染者，> 50名患者血清)通過一系列ELISA和蛋白質印跡測定進行檢測評估其免疫原性。重要的是單獨的抗體制劑(也可以是選定的血清)可以從來自第一輪篩選的所有有希望候選者中選擇性的鑒定超免疫血清反應性抗原。因此，在第二輪篩選中應優選至少 10種單獨的抗體制劑(即，來自感染選定病原體的至少10名不同個體的抗體制劑(如血清))用于鑒定這些抗原。當然，還有可能利用少于10種的單獨制劑，不過，利用少數單獨抗體制劑得到的步驟的選擇性可能不是最佳的。另一方面，如果給定的超免疫血清反應性抗原(或其抗原性片段)被至少10種單獨的抗體制劑所識別，優選至少30種，尤其是至少 50種單獨的抗體制劑識別，超免疫血清反應性抗原鑒定的選擇性對于進行正確的鑒定而言也已足夠。當然，超免疫血清反應性可用盡可能多的單獨制劑進行檢測(如，多于100或甚至多于1000)。因此，按照本發明方法的超免疫血清反應性抗體制劑的相關部分應優選至少10 種，更優選至少30種，尤其是至少50種單獨的抗體制劑。備選地(或聯合的)超免疫血清反應性抗原還可用第二輪篩選中所用所有單獨抗體制劑的至少20%、優選至少30%、尤其是至少40%進行鑒定。依照本發明某一優選的實施方案，從其中制備出用于第二輪篩選的單獨抗體制劑的血清(或自身被用作抗體制劑)是根據其抗化膿鏈球菌的效價(如，抗此病原體的制劑， 諸如裂解物、細胞壁組分和重組蛋白)進行選擇的。優選地，當整個生物體(總裂解物或全細胞)被用作ELISA中的抗原時，選擇總IgA效價高于4000U的、尤其是高于6000U的以及 /或IgG效價高于10000U、尤其是高于12000U的那些生物體(U =單位，在給定稀釋度下的 OD405nm讀數計算而得)。人免疫系統所產生且存在于人血清中的抗鏈球菌抗體是抗原性蛋白質體內表達及其免疫原性的指征。抗體對線性表位的識別可能是以短到4-5個氨基酸長的序列為基礎的。當然這并不一定意味著這些短肽能在體內產生所述的給定抗體。為此進一步在動物內 (主要是在小鼠內)檢測所限定表位、多肽和蛋白質在體內誘發抗選定蛋白質的抗體的能力。優選的抗原定位于細胞表面或被分泌且因而易于到達細胞外。抗細胞壁蛋白質抗體預計用于兩個目的抑制粘附并促進胞噬作用。抗被分泌蛋白質的抗體在對其毒素或毒性組分功能的中和作用中是有利的。還已知的是細菌通過分泌蛋白質相互交流。中和抗這些蛋白質的抗體可阻斷鏈球菌種屬之間或之內的生長促進交流對話。生物信息分析(信號序列、細胞壁定位信號、跨膜結構域)被證實對評估細胞表面定位或分泌作用非常有用。實驗方法包括分離具相應表位的抗體和來自人血清的蛋白質，并在小鼠中產生針對通過細菌表面展示篩選所選定的(多)肽的免疫血清。然后將這些血清作為以下檢測的試劑用于第三輪篩選中在不同條件下生長的A族鏈球菌的細胞表面染色(FACS，顯微鏡觀察)，測定中和能力(毒素、粘附)以及促進調理作用和胞噬作用(體外胞噬作用檢測)。為此目的，細菌中的大腸桿菌克隆被直接注射入小鼠中，采集免疫血清并在相應的體外試驗中檢測功能性的調理或中和抗體。或者，特異的抗體可以肽或蛋白質作為底物純化自人或小鼠血清。宿主抗化膿鏈球菌的防衛性主要依賴于先天的免疫機制。通過接種疫苗誘發調理型和中和型的高親和力抗體可幫助先天的免疫系統清除細菌和毒素。這使得按照本發明的方法成為鑒定A族鏈球菌抗原性蛋白質的最適工具。皮膚和黏膜是抗鏈球菌入侵的強大屏障。不過，一旦皮膚或黏膜破裂，非適應性的細胞防衛第一道防線通過補體和巨噬細胞、尤其是多形核白細胞(PMNs)開始聯合作用。這些細胞可被認為是清除入侵細菌的基石。由于A族鏈球菌起初是胞外病原體，所以主要的抗鏈球菌適應性反應來自免疫系統的體液防衛裝備且通過三種主要的機制介導調理作用的促進、毒素中和作用和粘附的抑制。現認為調理作用尤為重要，因為它是有效的胞噬作用所需要的。為了進行有效的調理，微生物的表面必須用抗體和補體因子包被以便PMNs通過受體識別IgG分子的Fc片段或被活化的C3b。經調理作用后，鏈球菌被胞噬并處死。結合細菌細胞表面特異抗原的抗體作為配體用于附著PMNs并促進胞噬作用。與粘附素和其它細胞表面蛋白結合的非常相似的抗體被預期可中和粘附作用并預防定植。本發明所提供的抗原的選擇因此非常適于鑒定在動物模型或人中導致抗感染防衛作用的那些抗原。依照本文所用的抗原鑒定方法，如下所述，特別是，本發明可令人驚訝的提供化膿鏈球菌的一套全面的新核酸和新的超免疫血清反應性抗原及其片段。根據某一方面，本發明特別涉及編碼超免疫血清反應性抗原且具有序列表kq ID No :1-150中所列出序列的核苷酸序列以及序列表kq ID No 151-300所列出的代表超免疫血清反應性抗原的相應編碼氨基酸序列。在本發明的優選實施方案中，提供的核酸分子其全長展示出與^^ ID No 1， 4-8，10-18，20，22，24-32，34-35，38-40，43-46，49-51，53-54，57-61，63，65-71，73，75-77， 81-82，88，91-94和96-150所列核苷酸序列具有70%的同一性。最優選的核酸包含了全長與 kq ID No 1，4-8，10-18，20，22，24-32，34-35，38-40，43-46，49-51，53-54，57-61，63， 65-71，73，75-77，81-82，88，91-94和96-150所列的核酸分子具有至少80%或至少85%同一性的區域。在這點上，特別優選全長與上述序列具有至少90^^91^^92^^93^^94%, 95%或96%同一性的核酸分子。而且，特別優選至少具有97%同一性的那些核酸分子，尤其優選至少98%和至少99%的同一性，更優選至少99%或99. 5%，特別優選100%的同一性。此外，在這方面優選的實施方案是編碼超免疫血清反應性抗原或其片段(多肽)的核酸，所述的超免疫血清反應性抗原或其片段保持與由序列^^ ID No 1,4-8,10-18,20,22, 24-32，34-35，38-40，43-46，49-51，53-54，57-61，63，65-71，73，75-77，81-82，88，91-94 和 96-150所列的所述核酸編碼的成熟多肽基本上具有相同的生物學功能或活性。正如本領域已知且此處所用的，同一性是兩個或多個多肽序列或者兩個或多個多核苷酸序列之間的關系，這是通過比較這些序列確定的。在本領域內，同一性也意味著多肽或多核苷酸序列之間的序列相關程度，情形可能是通過在所述序列行與行之間進行比對確定的。同一性可方便的計算。雖然存在許多方法可以檢測兩個多核苷酸或兩個多肽序列之間的同一性，但此術語對技術熟煉人員而言是眾所周知的(如，分子生物學中的序列分析 Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje，G. ，Academic Press，1987)。優選的測定同一性的方法是設計成能給出待測序列之間最大的匹配程度。確定同一性的方法被編成了計算機程序。測定兩個序列之間同一性的優選計算機程序法包括，但不局限于， GCG 軟件包{Devereux, J.等，1984}、BLASTP、BLASTN 和 FASTA {Altschul，S.等，1990}。依照本發明的另一方面，提供了展示出與kq ID No 64所列出的核酸序列具有至少96%同一性的核酸分子。依照本發明的另一方面，提出了與kq ID No 3，36，47-48，55，62，72，80，84，95 所列出的核酸序列相同的核酸分子。按照本發明的核酸分子可作為與上文所述第一個備選核酸至少基本上互補的第二個備選的核酸分子。用于此處時，互補意味著核酸鏈通過Watson-Crick堿基配對原則與第二條核酸鏈的堿基配對。基本上互補用于此處時意味著堿基配對并非存在于各自鏈的所有堿基之間，而是剩余一定數目或百分比的不配對堿基或錯配堿基。正確配對的堿基百分率優選至少70 %，更優選至少80 %，還更優選至少90 %，最優選高于90 %的任一百分率。應提及的是70%比例的堿基匹配時被認為是同源的且具此程度匹配堿基的雜交被認為是嚴謹的。此類嚴謹雜交的雜交條件參閱分子生物學通用方法Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.，1987)。更具體而言,雜交條件如下·例如，在 5x SSPE、5x Denhardt 氏試劑、0. 1% SDSU00g/mL 剪切 DNA 中于 68°C 進行雜交
·在0. 2xSSC, 0. 1% SDS中于42°C進行中度嚴謹洗滌·在0. lxSSC、0. SDS于68°C進行高嚴謹性洗滌。GC含量為50%的基因組DNA的Tm近似96°C。相對于的錯配而言，Tm下降約 1°C。此外，本文所述的任何別的雜交條件原則上也是適用的。當然，編碼與本發明所鑒定分子相同的多肽分子的所有核酸序列分子都可包含在給定編碼序列的任何部分內，因為遺傳密碼的簡并性是直接可應用于明確測定的且編碼給定多肽分子的所有可能性核酸分子，即使所述的簡并核酸分子的數目可能是高的也是如此。這還可適用于給定多肽的片段，只要該片段編碼多肽適用于疫苗接種即可，如作為主動或被動疫苗。按照本發明的核酸分子可作為第三個備選的核酸分子，它包含核酸分子的一段至少15個堿基與上述按照本發明的第一個和第二個備選核酸分子一致。優選的所述堿基形成鄰近的堿基伸展段(stretch)。不過，由許多堿基分隔開的兩個或多個部分組成的伸展段也在本發明的范圍內。按照本發明的核酸分子也可用作第四個備選的核酸分子，它在嚴謹雜交條件下與符合上述第一、第二和第三備選方案的任一本發明核酸分子退火。嚴謹雜交條件通常是本文所述的條件。最后，按照本發明的核酸分子可用作第五個備選的核酸分子，若非遺傳密碼的簡并性，可與符合上述第一、第二和第三備選方案的任一本發明核酸分子的任一核酸分子雜交。此類核酸分子是指事實，即優選按照本發明的核酸編碼按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段。此類核酸分子可特別用于檢測按照本發明的核酸分子并從而診斷諸如化膿鏈球菌等相應的微生物以及涉及此類微生物的任何疾病或發病狀況。優選地，雜交可在與上述第四個備選方案相關的所述嚴謹條件下發生或完成。本文所用的核酸分子通常指任何核糖核酸分子或脫氧核糖核酸分子，它們可以是未修飾的RNA或DNA或修飾過的RNA或DNA。因此，例如，尤其是，本文所用的核酸分子指單鏈和雙鏈DNA、作為單鏈和雙鏈RNA混合物的DNA以及作為單鏈和雙鏈區域混合物的RNA， 含有DNA或RNA的可能是單鏈或更通常是雙鏈或三鏈的雜合分子或單鏈和雙鏈區域的混合物。此外，用于此處時核酸分子涉及包含RNA或DNA或兼有RNA和DNA 二者的三鏈區域。在所述區域內的鏈可能來自同一分子或來自不同的分子。這些區域可包含所有的一個或多個分子，但更通常是只涉及某些分子的一個區域。三螺旋區域的分子之一常常是寡核苷酸。用于此處時，術語核酸分子包括含有一個或多個修飾堿基的上述DNA或RNA。因此，由于穩定性或其它原因而其骨干被修飾的DNA或RNA是本文提及術語時所指的“核酸分子”。此外， 含諸如肌苷等稀有堿基或諸如三苯甲基化堿基等修飾堿基(只是其中的兩個例子)的DNA 或RNA是該術語用于此處時所指的核酸分子。還應理解的是為了達到許多本領域技術人員已知的有益的目的而對DNA和RNA進行了多種類型的修飾。術語核酸分子用于此處時包含化學、酶促或代謝修飾形式的核酸分子以及病毒和細胞的化學形式DNA和RNA特性，其中包括簡單和復雜細胞。術語核酸分子還包含常常被稱為寡核苷酸的短核酸分子。“寡核苷酸” 和“核酸”或“核酸分子”在此常常交換使用。本發明中所提供的核酸分子還包括許多單獨的片段，長于和短于化膿鏈球菌編碼區序列表中所列出的核酸分子序列都可，它們可通過標準的克隆方法產生。為了達到唯一性，片段必須有足夠長度以將其與其它已知的核酸序列區分開來，通過將任何選定的化膿鏈球菌片段與諸如GenBank等計算機數據庫中的核苷酸序列進行比較可最方便的確定。此外，可以對本發明所包含的核酸分子和多肽進行修飾。例如，可以進行不會影響核酸所編碼多肽的核苷酸替代，因此編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的任何核酸分子都包含在本發明范圍內。而且，可以利用諸如標準的克隆技術等標準技術將編碼本發明所提供超免疫血清反應性抗原或其片段的任一核酸分子與預期的調控序列(無論是化膿鏈球菌調控序列或異源的調控序列都可)、異源前導序列、異源標記序列或異源編碼序列進行功能型連接以產生融合蛋白。本發明的核酸分子可以是通過克隆獲得或通過化學合成技術產生或二者聯合方法獲得的諸如mRNA或cRNA等RNA形式或包括例如cDNA和基因組DNA在內的DNA形式。所述DNA可以是三鏈、雙鏈或單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈，也已知為有義鏈，或者可以是非編碼鏈，也稱為反義鏈。本發明進一步涉及本文上述核酸分子的變體，它們編碼具有序列表中所列出的推斷化膿鏈球菌的氨基酸序列的超免疫血清反應性抗原和其片段的片段、類似物及衍生物。 核酸分子變體可以是天然存在的變體，諸如天然存在的等位基因變體，或者可以是未知天然存在的變體。所述的核酸分子非天然存在變體可以通過誘變技術制備，包括應用于核酸分子、細胞或生物體的那些誘變技術。在變體中這方面的變體是通過核苷酸替代、缺失或添加而不同于上述核酸分子的變體。替代、缺失或添加可涉及一個或多個核苷酸。所述變體可以改變于編碼區內或非編碼區內或二者都有所改變。編碼區的改造可能產生保守或非保守性氨基酸替代、缺失或添力口。優選的是編碼具有序列表中所提化膿鏈球菌序列的變體、類似物、衍生物或片段或者片段的變體、類似物或衍生物的核酸分子，其中數個、一些、5-10個、1-5個、1-3個、2個、1個或無氨基酸以任一組合形式被替代、缺失或插入。其中尤其優選沉默替代、添加和缺失，它們不改變序列表中所列化膿鏈球菌多肽的特征和活性。在這點上還特別優選保守性替代。按照本發明的肽和片段還包括修飾的表位以及編碼所述修飾表位的核酸序列，其中優選給定表位的一個或多個氨基酸根據上述例子中的原則被修飾或置換。同時還清楚的是，通過提高、保留或至少不顯著阻礙所述表位的T細胞活化能力的氨基酸調換來自本發明表位的表位也在按照本發明的表位范圍內。因此本發明的表位還覆蓋了不包含化膿鏈球菌來源的原始序列但觸發相同的或優選提高了的T細胞應答的表位。這些表位被稱為“不規則變化的”，它們需要具有對MHC/HLA分子相似的或優選更大的親合力，還需要具有以相似或優選更強的方式將T細胞受體(TCR)定向于原始表位的能力。不規則變化表位可通過合理的設計獲得，S卩，如{Rammensee，H.等，1999}所述，考慮各個殘基對結合MHC/HLA的貢獻，聯合與TCR潛在相互作用的殘基的系統性交換并用被定向針對原始表位的T細胞檢測所產生序列。這樣的設計對于本領域技術人員而言是可能的而無需過多的實驗。另一可能性包括用定向針對原始表位的T細胞篩選肽庫。優選的方式是合成肽庫的定位掃描。所述方法已詳述于{Hemmer，B.等，1999}和本文所給定文獻中。
除了由本發明來源氨基酸序列表示的表位或不規則變化表位之外，還可應用模擬這些表位的物質，如“肽模擬物”或“反-逆-肽(retro-inverso-p印tides) ”。改良表位設計的另一方面是用增加其刺激T細胞能力的物質進行它們的配制或修飾。這些包括T輔助細胞表位、脂類或脂質體或WO 01/78767中所述的優選修飾。增加表位的T細胞刺激能力的另一方式將它們與免疫刺激物質配制在一起，例如細胞因子或趨化因子樣白介素-2、-7、-12、-18，I類和II類干擾素(IFN)，尤其是γ-IFN、 GM-CSF, α -TNF, flt3 配體及其他。正如本文關于本發明核酸分子檢測所另外論及的，例如，上述本發明核酸分子可用作針對RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針用于分離編碼本發明多肽的全長cDNAs和基因組克隆，以及用于分離與本發明核酸分子具有高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因組克隆。所述的探針通常包含至少15個堿基。優選地，所述探針具有至少20個、至少25 個或至少30個堿基，還可能具有至少50個堿基。尤其優選的探針具有至少30個堿基，和具有50個或少于50個的堿基，諸如30、35、40、45或50個堿基。例如，本發明核酸分子的編碼區可通過用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針篩選有關的文庫而被分離。具有與本發明基因序列互補的序列的已標記寡核苷酸然后被用于篩選cDNA、基因組DNA或mRNA文庫以確定探針與文庫中的哪一個成員雜交。正如本文關于核酸分子試驗所進一步討論的，其中，本發明的核酸分子和多肽可用作試劑和材料用于研發疾病，尤其是人的疾病的治療和診斷。寡核苷酸形式的本發明核酸分子可用于本文所述方法中，但優選用于PCR，以確定此處鑒定的化膿鏈球菌基因是否全部或部分存在于和/或轉錄于諸如血液等受感染組織中。公認的，所述序列還可用于診斷病原體已達到的感染階段和感染類型。為此目的和其它目的，可使用至少包含按照本發明的核酸之一的陣列。按照本發明的核酸分子可用于檢測核酸分子和含這些核酸分子的生物體或樣品。 優選所述檢測是用于診斷的，更優選用于診斷涉及或與化膿鏈球菌的存在或富集有關的疾病。可用各種技術在DNA水平檢測感染了化膿鏈球菌的真核細胞(此處也稱“個體”)， 特別是哺乳動物，尤其是人。用于將化膿鏈球菌從其它生物體中辨別出來的優選候選物是可以獲得的。本發明提供了診斷化膿鏈球菌感染所引起疾病的方法，包括從分離或來自某一個體的樣品中測定具有序列表中所列出的核酸分子序列的核酸分子表達水平的增加。核酸分子的表達可以用任何本領域已知的核酸分子定量方法進行檢測，例如，PCR、RT-PCR、核糖核酸酶保護、RNA印跡、其它的雜交方法以及本文所述的陣列。分離的用于此處是指“人為的”將其從自身的天然狀態中隔離出來，S卩，如果它存在于自然界中，那么它已被改變或從其最初的環境中取走，或二者兼具。當該術語用于此處時，例如，在其天然狀態下天然存在于活的生物體內的天然存在核酸分子或多肽不是“分離的”，但從其天然狀態共存物質中隔離出來的同一核酸分子或多肽就是“分離的”。作為分離的一部分或分離后，所述核酸分子可與諸如DNA等其它核酸分子結合，例如，為了誘變形成融合蛋白，以及為了繁殖或表達于宿主中。分離的核酸分子，獨自或與諸如載體等其它核酸分子結合，可引入培養物或完整生物體的宿主細胞內。該術語用于此處時，當引入培養物中或完整生物體的宿主細胞中時，所述DNA仍然是分離的，因為它們不會是處于其天然存在形式或環境中。同樣的，核酸分子和多肽可存在于組合物中，諸如培養基制劑、將核酸分子或多肽引入例如細胞中的溶液、化學或酶促反應的組合物或溶液，它們不是天然存在的組合物且其中保留了該術語用于此處時所具涵義的分離的核酸分子或多肽。按照本發明的核酸可化學合成。或者，所述核酸可用本領域技術人員已知的方法分離自化膿鏈球菌。依照本發明的另一方面，用此處所述的抗原鑒定方法提供了一套全面的、新的超免疫血清反應性抗原和其片段。在優選的本發明實施方案中，提供了含有此處所述任一核酸分子編碼的氨基酸序列的超免疫血清反應性抗原及其片段。在本發明的另一優選實施方案中，提供了所含氨基酸序列選自 kq ID No 151，154-158，160-168，170，172，174-182， 184-185,188-190,193-196，199-201，203-204，207-211，213，215-221，223，225-227， 231-232,238,241-244和246-300所表示多肽序列的一組新的超免疫血清反應性抗原及其片段。在本發明進一步優選的實施方案中，提供了所含氨基酸序列選自ID No 214中所示多肽序列的超免疫血清反應性抗原及其片段。在本發明更優選的實施方案中，提供了所含氨基酸序列選自 kq ID No 153，186，197-198，205，212，222，230，2；34，245 中所示多肽序列的超免疫血清反應性抗原及其片段。本發明中所提供的超免疫血清反應性抗原及其片段包括序列表中所列出的任何多肽以及與序列表中所提出多肽具有至少70%同一性的多肽，優選與序列表中所提出多肽具有至少80%或85%的同一性、更優選與序列表中所提出多肽具有至少90%的相似性 (更優選至少90 %的同一性)、還更優選與序列表中所提出多肽具有至少95 %、96 %、97 %、 98%、99%或99. 5%的相似性(更優選至少95%、96%、97%、98%、99%或99. 5%的同一性)的多肽，還包括具有該多肽所述部分的所述多肽部分，該多肽的所述部分通常含至少4 個氨基酸，更優選至少8個，還更優選至少30個，更優選至少50個氨基酸，諸如4、8、10、20、 30、35、40、45或50個氨基酸。本發明還涉及這些超免疫血清反應性抗原及其片段的片段、類似物和衍生物。術語“片段”、“衍生物”和“類似物”在涉及其氨基酸序列列于序列表中的抗原時，指基本上保持與所述超免疫血清反應性抗原及其片段相同的生物學功能或活性的多肽。超免疫血清反應性抗原及其片段的片段、衍生物或類似物可能是1)其中一個或多個氨基酸殘基被保守或不保守氨基酸殘基替代(優選保守的氨基酸殘基)且所述的替代的氨基酸殘基可能是或可能不是由該遺傳密碼編碼的，或幻其中一個或多個氨基酸殘基包含一替代基團，或幻其中成熟的超免疫血清反應性抗原或其片段與另一化合物融合，諸如延長超免疫血清反應性抗原及其片段半壽期的化合物(例如，聚乙二醇)，或4)其中附加的氨基酸殘基與成熟的超免疫血清反應性抗原或其片段融合，諸如前導序列或分泌序列或用于純化成熟的超免疫血清反應性抗原及其片段的序列或前蛋白質序列。所述片段、衍生物和類似物被認為對本領域技術人員而言在本發明的范圍內。本發明還涉及不同化膿鏈球菌分離株的抗原。所述的同源物可以此處公開的核酸和氨基酸序列為基礎方便的分離。迄今為止已分清的有80種以上的M蛋白血清型，且此分型是以emm基因5’端的可變區為基礎進行的(參閱，例如Vitali等2002)。因此任一抗原的存在都可針對每一種M血清型來確定。此外還可能按照針對sic基因所述的確定各種M血清型中特殊抗原的可變性(Hoe等，2001)。各種M血清型對其引起疾病種類的影響總結于最近的綜述中(Cunningham，2000)。具體而言，兩組血清型可被區分1)引起咽炎和猩紅熱的血清型(如，M型1，3，5，6，14，18，19，24)2)引起膿皮病和鏈球菌導致的皮膚感染的血清型(如，M型2，49，57，59，60，61)這可作為鑒定用作疫苗或通常用作靶向特定疾病的藥物的適合性的基礎。來自例如 CDC (http://www. cdc. gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes. htm) 主頁的信息給出了顯示各種M血清型關系的系統樹圖。另外的相關文獻有=Vitali 等，Journal of Clinical Microbiology 40:679-681. (2002)(分子 emm 分型方法)， Enright 等，Infection and Immunity 69:2416-2427. (2001)(可供選擇的分子分型方法 (alternative molecular typing method)(MLST)), Hoe 等，The Journal of Infectious Diseases 183 :633-639. Q001)(在許多不同的血清型中某一抗原(sic)變化的例子 (example for the variation of one antigen(sic)in many different serotypes))以及 Cunningham，CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS 13 :470-511. (2000)(關于 GAS 發病機理的綜述(review on GAS pathogenesis)) 0所有的emm型都完整列出并可下載自上述網址。系統樹圖是通過以下軟件的順序使用構建的Wisconsin Package Version 10. 1、Genetics Computer Group (GCG)、Madison programs Pileup, Distances 禾口 Growtree0基本上，信號序列的22個殘基加83個附加N末端殘基被用于包括來自數據庫的選定序列在內的序列比對。選定的序列包括編號103-124的新的emm(如下表中所述)以及它們的最接近的“傳統的”M蛋白匹配序列。盡管此分析局限于C末端是被任意截短的， 這在將不透明因子陽性株系M序列的分支與不透明因子陰性株系M序列分隔開的系統樹圖中仍是一種典型的結果。emm型/先前的命名-GenBank登錄號-在哪一國家被分離-最接近的N末端M蛋白序列匹配程度(％同一性)emml03/st2034U74320PNG, Bra, Egy, Mai, Nep, NZ, US M87(66% )emml04/st2034 AF056300PNG, Egy, Mal，Nep, NZ, US M66(72% )emml05/st4529 AF060227Mal, Nep, NZ, US M5 (45% )emml06/st4532 AF077666Mal, Egy, Iran, N印 M27G(71% )emml07/st4264 AF163686Mal, NZ M25(52% )emml08/st4547 AF052426Mal, Bra, Egy, Ira, NZ M70(84 % )emml09/st3018 AF077667 Mal，Egy, NZ M28(74% )emmll0/st4935 U92492 Ind, Bul，NZ, Rus, US M13(60% )emmlll/st4973 AF128960 Ind, Bra, Nep, US M80(40% )emmll2/stCmukl6 AF091806 Thi, Bra, Rus, US M27L/77(59 % )emmll3/st2267 AF078068 NZ, Thai, Chi M13(50% )emmll4/st2967 U50338 US, Can, Gam, NZ, PNG M73(80% )emmll5/st2980 AF028712 US, Bra, Rus M36(64% )emmll6/st2370 AF156180 US, Nep, NZ M52(60% )emmll7/st436 AF058801 US M13(59% )
emmll8/st448 AF058802 US, Bra, Egy, Nep, NZ M49(79% )emmll9/st3365 AF083874 US, Br, Nep M52(59% )emml20/stll35 AF296181 Egy M56(78% )emml21/stll61 AF296182 Egy M64(64% )emml22/stl432 AF222860 Egy, Rus, N印 M18(40% )emml23/st6949 AF213451 Arg, US, NZM80(68% )stll60/emml24 AF149048 and AF018178Egy, Mai, NZM2 (82% )縮寫Arg，阿根廷；Bra,巴西；Bul，保加利亞；Can，加拿大；Chi，智利；Egy，埃及； Gam，岡比亞Jnd，印度；Ira，伊朗；Mal，馬來西亞；N印，尼泊爾；NZ，新西蘭；PNG,巴布亞新幾內亞；Thi，泰國；Rus，俄羅斯；US，美國。最接近的成熟M蛋白序列與來自血清學表征 Lancefield類型的預測50個成熟N末端殘基相比。emm類型和序列類型在許多情形中emm序列參照株系直接來自Rebecca Lancef ield博士的M類型保藏中心。所述的株系被命名為RCL。以“emm”開始的序列表明用此類型代表的分離株已經過除⑶C鏈球菌實驗室之外的數個對照實驗室分析。emm94至emml24中每一“新的” emm型都是由回收自嚴重發病狀態的多個獨立分離株代表的，是用國際GAS對照實驗室可獲得的所有分型血清貯液都不可分型的M蛋白，并且通過在正常人血液中的繁殖證實了其體外抗噬菌細胞的特性。具有以 “st”(序列類型)開始的emm序列的株系還未被所有參照實驗室完全確認。GAS 遺傳學長期以來已知針對血清不透明因子陽性(S0F+)株系的抗血清以株系特異的方式抑制OF活性。因此，從GAS不透明因子陽性株系中分析出代表至少60種單獨sof基因的 500-2700個堿基的sof (血清不透明因子)基因可變區(有趣的是，通常在OF陰性emml2 分離株和emm/M類型12對照株中找到類似物)。已發現sof基因序列也在不同GAS株系中顯著可變，盡管它們在emm類型中通常是非常保守的。因此重要的株系包括emml，emmlOO， emmlOl，emml02，emml03，emml04，emml05，emml06，emml07，emml08，emml09，emmll，emmllO， emmlll，emmll2，emmll3，emml 14, emmll5，emmll6，emmll7，emmll8，emmll9，emml2, emml20， emml21，emml22，emml23，emml24，emml3L，emml4，emml5，emml7，emml8，emml9，emm2，emm22， emm23， emm24， emm25， emm26， emm27G， emm28， emm29， emm3， emm30， emm31， emm32， emm33， emm34，emm36，emm37，emm38，emm39，emm4，emm40，emm41，emm42，emm43，emm44，emm46，emm47， emm48，emm49，emm5，emm50，emm51，emm52，emm53，emm54，emm55，emm56，emm57，emm58，emm59， emm6，emm60，emm61，emm62，emm63，emm64，emm65，emm66，emm67，emm68，mm69，emm70，emm71， emm72，emm73，emm74，emm75，emm76，emm77，emm78，emm79，emm8，emm80，emm81，emm82，emm83， emm84，emm85，emm86，emm87，emm88，emm89，emm9，emm90，emm91，emm92，emm93，emm94，emm95， emm96，emm97，emm98，emm99，stl389，stl731，stl759，stl815，stl967，stl969，stlrp31， stll014，st2037，st204，st211，st213，st2147，stl207，st245，st2460，st2461，st2463， st2904，st2911，st2917，st2926，st2940，st369，st3757，st3765，st3850，st5282，st6735， st7700， st809， st833， st854， st980584， stck249， stck401， std432， std631， std633， stIL103，stIL62，stns292，stns554，stsl04，stcl400，stcl741，stc36，stc3852，stc5344，stc5345, stc57, stc6979, stc74a, stc839, stglO, stgll, stgl389, stgl66b, stgl750, stg2078, stg3390, stg4222, stg4545, stg480, stg4831, stg485, stg4974, stg5063, stg6, stg62647, stg643, stg652, stg653, stg663, stg840, stg93464, stg97, stL1376, stL1929 和 stL2764。在本發明特別優選的實施方案中有關這方面的是序列表中列舉的超免疫血清反應性抗原，其變體、類似物、衍生物和片段，以及片段的變體、類似物和衍生物。此外，含有所述超免疫血清反應性抗原、其變體、類似物、衍生物和片段以及片段的變體、類似物和衍生物的融合多肽也包括在本發明中。所述的融合多肽和蛋白質以及編碼它們的核酸分子可用標準技術方便的制備，包括用于產生和表達編碼融合蛋白的重組多核苷酸的標準重組技術。優選的變體是那些通過保守氨基酸替換從參照株系改變而來的變體。所述替代是用相似特性的另一氨基酸替代多肽中給定的氨基酸。通常被看做保守替代的是脂肪族氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸相互間的置換，羥基殘基絲氨酸和蘇氨酸之間的交換，酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間的調換，氨基殘基天冬酰胺和谷氨酰胺之間的替代，堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間的交換和芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間的置換。在這方面更特別優選的是具有序列表中列舉的任一多肽的氨基酸序列的變體、類似物、衍生物和片段以及片段的變體、類似物和衍生物，其中數個、一些、5-10個、1-5個、 1-3個、2個、1個或無氨基酸殘基以任何組合方式被替代、缺失或插入。其中特別優選的不改變本發明多肽特征和活性的沉默替代、插入和缺失。在這點上還特別優選的是保守性替代。最優選的是具有序列表中所列舉氨基酸序列而且無替代的多肽。特別適合的氨基酸替代是按照本申請書的序列表中所公開序列的同源物中所包含的那些替代。因此本文所公開的抗原或表位的適當序列衍生物包括存在于一個或多個化膿鏈球菌株系或血清型中的一種或多種變異(優選以所述同源變異為基礎的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸交換)。 所述抗原包含序列可能是天然存在序列或新產生的人造序列。這些優選的抗原變體是以所述的天然存在序列變異為基礎的，例如，形成針對按照本發明的多肽抗原區的“掌控序列”。 所述同源變異或交換的適當例子參閱實施例部分的表5。例如，某一給定的化膿鏈球菌序列可通過涉及所述的一種或多種變異被改進從而產生此給定(天然存在)抗原或表位序列的人造(即，非天然存在)的變體。本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段優選以分離的形式提供，且優選純化至均一。也屬于本發明優選的實施方案的是含有具有序列表中所列舉氨基酸序列的多肽片段以及序列表中所列舉多肽的變體和衍生物片段的多肽。在這方面所述片段是具有與部分而非所有上述超免疫血清反應性抗原和它的片段以及變體或衍生物、類似物及其片段完全相同的氨基酸序列的多肽。所述片段可能是“獨立的”，即，并非其它氨基酸或多肽的一部分或與它們相融合，或者它們可包含于較大的多肽中形成其中的一部分或區域。在本發明的這方面還優選的是通過本發明多肽的結構或功能特性表征的片段，即，含有本發明多肽的α-螺旋和α-螺旋形成區、折疊和折疊形成區、轉角和轉角形成區、卷曲和卷曲形成區、親水區、疏水區、α兩性分子區、β兩性分子區、可變區、表面形成區、底物結合區和高抗原性指示區的片段以及所述片段的組合。優選的區域是介導本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段活性的那些區域。在這點上最優選的是具有本發明超免疫血清反應性抗原及其片段的化學、生物學或其它活性的片段，包括那些具有相似的活性或改良的活性或不合需要的活性有所降低的片段。尤其優選的是含酶受體或結構域的片段，所述酶具有化膿鏈球菌生存或在人體內引發疾病所必需的功能。 更優選的多肽片段是包括或含有動物(尤其是人)中的抗原性或免疫原性決定簇的那些多肽片段。抗原性片段被定義為經鑒定本身可作為抗原或當作為半抗原時可制備抗原的抗原片段。因此，顯示出一個或(對于較長片段而言)只有一些氨基酸交換的抗原或抗原片段也能用本發明激活，條件是具有氨基酸交換的所述片段的抗原能力并未因該交換而嚴重受損即可，即，適于在以此抗原進行免疫接種的個體中引起恰當的免疫反應并用來自個體血清的個體抗體制劑進行鑒定。所述超免疫血清反應性抗原片段的優選例子選自含有表1欄“預測免疫原性氨基酸”和“已鑒定的免疫原性區域的位置”的氨基酸序列、表2血清反應性表位的肽，尤其是含以下區段氨基酸序列的肽Seq ID No 151的第4_44位、57_65位、67_98位、101-107位、 109-125 位、131-144 位、146-159 位、168-173 位、181-186 位、191-200 位、206-213 位、 229-245 位、261-269 位、288-301 位、304-317 位、323-328 位、350-361 位、374-384 位、 388-407 位、416-425 和 1-114 位 Jeq ID No 152 的第 5-17 位、49-64 位、77-82 位、87-98 位、118-125 位、127-140 位、142-150 位、153-159 位、191-207 位、212-218 位、226-270 位、 274-287 位、297-306 位、325-331 位、340-347 位、352-369 位、377-382 位、390-395 和四_2洸位；Seq ID No 153 的第 4-16 位、20-26 位、32-74 位、76-87 位、93-108 位、116-141 位、 148-162 位、165-180 位、206-219 位、221-228 位、230-236 位、239-245 位、257468 位、 313-328 位、330-335 位、353-359 位、367-375 位、394-403 位、414-434 位、437-444 位、 446-453 位、456-464 位、478-487 位、526-535 位、541-552 位、568-575 位、577-584 位、 589-598 位、610-618 位、624-643 位、653-665 位、667-681 位、697-718 位、730-748 位、 755-761 位、773-794 位、806-821 位、823-831 位、837-845 位、862-877 位、879-889 位、 896-919 位、924-930 位、935-940 位、947-955 位、959-964 位、969-986 位、991-1002 位、 1012-1036 位、1047-1056 位、1067-1073 位、1079-1085 位、1088-1111 位、1130-1135 位、 1148-1164 位、1166-1173 位、1185-1192 位、1244-1254 和 919-9 位；Seq ID No 154 的第 5-44 位、62-74 位、78-83 位、99-105 位、107-113 位、124-134 位、161-174 位、176-194 位、 203-211 位、216-237 位、241-247 位、253-266 位、272-299 位、323-349 位、353-360 和 145-305 位；Seq ID No 155 的第 15-39 位、52-61 位、72-81 位、92-97 和 71-81 位；Seq ID No 156 的第 13-19 位、21-31 位、40-108 位、115-122 位、125-140 位、158-180 位、187-203 位、210-223 位、2；35-245 和 173-186 位 feq ID No 157 的第 5-12 位、19-27 位、29-39 位、 59-67 位、71-78 位、80-88 位、92-104 位、107-124 位、129-142 位、158-168 位、185-191 位、 218-226 位、230-243 位、256-267 位、272-277 位、283-291 位、307-325 位、331-344 位、 346-352 和 316-331 位 Jeq ID No 158 的第 6- 位、43-53 位、60-76 位、93-103 和 21-99 itl ；Seq ID No 159 的第 10-30 位、120-1 位、145-151 位、159-169 位、174-182 位、191-196 位、201-206 位、214-220 位、222-232 位、2M-272 位、292-307 位、313-323 位、332-353 位、 361-369 位、389-396 位、401-415 位、428-439 位、465-481 位、510-517 位、560-568 和 9-264位；Seq ID No 160 的第 5- 位、39-45 位、107-1 和 1-112 位 Jeq ID No 161 的第 4-38 位、42-50 位、54-60 位、65-71 位、91-102 和 21-56 位 Jeq ID No 162 的第 4-13 位、19-25 位、41-51 位、54-62 位、68-75 位、79-89 位、109-122 位、130-136 位、172-189 位、192-198 位、 217-224 位、262-268 位、270-276 位、281-298 位、315-324 位、333-342 位、353-370 位、 376-391 和 23-39 位 Jeq ID No 163 的第 6-41 位、49-58 位、62-103 位、117-124 位、 147-166 位、173-194 位、204-211 位、221-229 位、255-261 位、269-284 位、288-310 位、 319-325 位、348-380 位、383-389 位、402-410 位、424-443 位、467-479 位、496-517 位、
535-553位、555-565 位、574-581 位、583-591 和 474-489 位 Jeq ID No 164 的第 8_35 位、 52-57 位、66-73 位、81-88 位、108-114 位、125-131 位、160-167 位、174-180 位、230-235 位、 237-249 位、254-262 位、278-285 位、308-314 位、321-326 位、344-353 位、358-372 位、 376-383 位、393-411 位、439-446 位、453-464 位、471-480 位、485-492 位、502-508 位、 523-529 位、533-556 位、558-563 位、567-584 位、589-597 位、605-619 位、625-645 位、 647-666 位、671-678 位、690-714 位、721-728 位、741-763 位、766-773 位、777-787 位、 792-802 位、809-823 位、849-864 和 37-241 位、409-534 位、582-604 位、743-804 位；Seq ID No 165 的第 4-17 位、24-36 位、38-44位、59-67 位、72-90 位、92-121 位、U6-149 位、151-159 位、161-175 位、197-215 位、217-227 位、241-247 位、257-264 位、266-275 位、277-284 位、 293-307 位、315-321 位、330-337 位、345-350 位、357-366 位、385-416 和 202-337 位；Seq ID No 166 的第 4-20 位、22-46 位、49-70 位、80-89 位、96-103 位、105-119 位、123-1 位、 153-160 位、181-223 位、227-233 位、236-243 位、248-255 位、261-269 位、274-279 位、 283-299 位、305-313 位、315-332 位、339-344 位、349-362 位、365-373 位、380-388 位、 391-397 位、402-407 和 1-48 位；Seq ID No 167 的第 18-37 位、41-63 位、100-106 位、 109-151 位、153-167 位、170-197 位、199-207 位、212-229 位、232-253 位、273-297 和 203-217 位；Seq ID No 168 的第 20-26 位、54-61 位、80-88 位、94-101 位、113-119 位、 128-136 位、138-144 位、156-188 位、193-201 位、209-217 位、221-229 位、239-244 位、 251-257 位、270-278 位、281-290 位、308-315 位、319-332 位、339-352 位、370-381 位、 388-400 位、411-417 位、426-435 位、468-482 位、488-497 位、499-506 位、512-521 和 261-273 位；Seq ID Nol69 的第 6-12 位、16-36 位、50-56 位、86-92 位、115-125 位、143-152 位、163-172 位、193-203 位、235444 位、280-289 位、302-315 位、325-348 位、370-379 位、 399-405 位、411-417 位、419-429 位、441-449 位、463-472 位、482-490 位、500-516 位、
536-543位、561-569 位、587-594 位、620-636 位、647-653 位、659-664 位、677-685 位、 687-693 位、713-719 位、733-740 位、746-754 位、756-779 位、792-799 位、808-817 位、 822-828 位、851-865 位、902-908 位、920-938 位、946-952 位、969-976 位、988-1005 位、 1018-1027 位、1045-1057 位、1063-1069 位、1071-1078 位、1090-1099 位、1101-1109 位、 1113-1127 位、1130-1137 位、1162-1174 位、1211-1221 位、1234-1M2 位、1261-U68 位、 1278-1284 位、1312-1317 位、1319-1326 位、1345-1353 位、1366-1378 位、1382-1394 位、 1396-1413 位、1415-1424 位、1442-1457 位、1467-1474 位、1482-1490 位、1492-1530 位、 1537-1549 位、1559-1576 位、1611-1616 位、1624-1641 和 1-414 位、443-614 位、997-1392 itl ； Seq ID No 170 的第 14-42 位、70-75 位、90-100 位、158-181 和 1-164 位 feq ID No 171 的第 4-21 位、30-36 位、54-82 位、89-97 位、105-118 位、138-147 禾口 126-207 位；Seq ID No172 的第 4-21 位、31-66 位、96-104 位、106-113 位、131-142 和 180-204 位；Seq ID No 173 的第 5-23 位、31-36 位、38-55 位、65-74 位、79-88 位、101-129 位、131-154 位、156-165 位、 183-194 位、225-237 位、245-261 位、264-271 位、279-284 位、287-297 位、313-319 位、 327-336 位、343-363 位、380-386 和 11-197 位、204-219 位、258-372 位；Seq ID No 174 的第 4-20 位、34-41 位、71-86 位、100-110 位、113-124 位、133-143 位、150-158 位、160-166 位、175-182位、191-197位、213-223位、233-239位、259-278位、298-322和 195-289位；Seq ID No 175 的第 4-10 位、21-35 位、44-52 位、54-62 位、67-73 位、87-103 位、106-135 位、 161-174 位、177-192 位、200-209 位、216-223 位、249-298 位、304-312 位、315-3 和 12-130 位；Seq ID No 176 的第 10-27 位、33-38 位、48-55 位、70-76 位、96-107 位、119-133 位、 141-147 位、151-165 位、183-190 位、197-210 位、228-236 位、245-250 位、266-272 位、 289-295 位、297-306 位、308-315 位、323-352 位、357-371 位、381-390 位、394-401 位、 404-415 位、417-425 位、427-462 位、466-483 位、485-496 位、502-507 位、520-529 位、 531-541 位、553-570 位、577-588 位、591-596 位、600-610 位、619-632 位、642-665 位、 671-692 位、694-707 和 434-444 位 feq ID No 177 的第 6-14 位、16-25 位、36-46 位、52-70 位、83-111 位、129-138 位、140-149 位、153-166 位、169-181 位、188-206 位、212-220 位、 223-259 位、261-269 位、274-282 位、286493 位、297-306 位、313-319 位、3四_341 位、 343-359 位、377-390 位、409-415 位、425-430 和 360-375 位；Seq ID No 178 的第 4-26 位、 28-48 位、54-62 位、88-121 位、147-162 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位、141-147 位、166-174 和 75-90 位；Seq ID No 196 的第 4-13 位、15-33 位、 43-52 位、63-85 位、98-114 位、131-139 位、146-174 位、186-192 位、198-206 位、227-233 和 69-88 位 Jeq ID No 197 的第 4-22 位、29_；35 位、59-68 位、153-170 位、213-219 位、2M-238 位、240-246 位、263-270 位、285-292 位、301-321 位、327-346 位、356-371 位、389-405 位、 411-418 位、421-427 位、430-437 位、450-467 位、472-477 位、482-487 位、513-518 位、 531-538 位、569-576 位、606-614 位、637-657 位、662-667 位、673-690 位、743-753 位、 760-767 位、770-777 位、786-802 和 96-230 位、361-491 位、572-585 位；Seq ID No 198 的第 4-12 位、21-36 位、48-55 位、74-82 位、121-127 位、195-203 位、207-228 位、247-262 位、 269-278 位、280-289 和 102-210 位；Seq ID No 199 的第 13-20 位、23-31 位、38-44 位、 78-107 位、110-118 位、122-144 位、151-164 位、176-182 位、190-198 位、209-216 位、 219-243 位、251-256 位、289-304 位、306-313 和 240-248 位；Seq ID No 200 的第 5-26 位、 34-48 位、57-77 位、84-102 位、116-132 位、139-145 位、150-162 位、165-173 位、176-187 位、 192-205 位、216-221 位、234-248 位、250-260 和 182-198 位 Jeq ID No 201 的第 10-19 位、 26-44 位、53-62 位、69-87 位、90-96 位、121-127 位、141-146 位、148-158 位、175-193 位、 204-259 位、307-313 位、334-348 位、360-365 位、370-401 位、411-439 位、441-450 位、 455-462 位、467-472 位、488-504 和 41-56 位 feq ID No202 的第 5_21 位、36-42 位、96-116 位、123-130 位、138-144 位、146-157 位、184-201 位、213-228 位、252-259 位、277-297 位、 308-313 位、318-323 位、327-333 和 202-217 位 Jeq ID No 203 的第 6- 位、33-51 位、 72-90 位、97-131 位、147-154 位、164-171 位、187-216 位、231-236 位、260-269 位、275-283 和 1-127 位 Jeq ID No 204 的第 4-22 位、24-38 位、44-58 位、72-88 位、99-108 位、110-117 位、123-129 位、131-137 位、142-147 位、167-178 位、181-190 位、206-214 位、217-223 位、 271-282 位、290-305 位、320-327 位、329-336 位、343-352 位、354-364 位、396-402 位、 425-434 位、451-456 位、471-477 位、485-491 位、515-541 位、544-583 位、595-609 位、 611-6 位、644-656 位、660-681 位、683-691 位、695-718 和四7-458 位 Jeq ID No 205 的第 5-43 位、92-102 位、107-116 位、120-130 位、137-144 位、155-163 位、169-174位、193-213 和 24-1；35 位 Jeq ID No 206 的第 4-25 位、61-69 位、73-85 位、88-95 位、97-109 位、 111-130 位、135-147 位、150-157 位、159-179 位、182-201 位、206-212 位、224-248 位、 253-260 位、287-295 位、314-331 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位、 195-203 位、216-225 位、2；35-247 位、254-264 位、271-279 和 64-72 位 Jeq ID No 217 的第 4-12 位、26-42 位、46-65 位、73-80 位、82-94 位、116-125 位、135-146 位、167-173 位、 183-190 位、232-271 位、274-282 位、300-306 位、320-343 位、351-362 位、373-383 位、 385-391 位、402-409 位、414-426 位、434-455 位、460-466 位、473-481 位、485-503 位、 519-525 位、533-542 位、554-565 位、599-624 位、645-651 位、675-693 位、717-725 位、 751-758 位、767-785 位、792-797 位、801-809 位、819-825 位、831-836 位、859-869 位、 890-897 和 222-362 位、756-896 位；Seq ID No 218 的第 11-17 位、22-28 位、52-69 位、 73-83 位、86-97 位、123-148 位、150-164 位、166-177 位、179-186 位、188-199 位、219-225 位、229443 位、250-255 和 153-170 位；Seq ID No 219 的第 4-61 位、71-80 位、83-90 位、 92-1 位、133-153 位、167-182 位、184-192 位、198-212 和 56-73 位 Jeq ID No 220 的第 4-19 位、26-37 位、45-52 位、58-66 位、71-77 位、84-92 位、94-101 位、107-118 位、120-133 位、156-168 位、170-179 位、208-216 位、228-238 位、253-273 位、280-296 位、303-317 位、 326-334 和 298-312 位；Seq ID No 221 的第 7-13 位、27-35 位、38-56 位、85-108 位、 113-121 位、123-160 位、163-169 位、172-183 位、188-200 位、206-211 位、219-238 位、 247-254 和 141-157 位；Seq ID No 222 的第 23—39 位、45-73 位、86-103 位、107-115 位、125-132 位、137-146 位、148-158 位、160-168 位、172-179 位、185-192 位、200-207 位、 210-224 位、233-239 位、246-255 位、285-334 位、338-352 位、355-379 位、383-389 位、 408-417 位、423-429 位、446-456 位、460-473 位、478-503 位、522-540 位、553-562 位、 568-577 位、596-602 位、620-636 位、640-649 位、655-663 和 433-440 位、572-593 位；Seq ID No 223 的第 4-42 位、46-58 位、64-76 位、118-124 位、130-137 位、148-156 位、164-169 位、175-182 位、187-194 位、203-218 位、220-227 位、241-246 位、2M-259 位、264-270 位、 275-289 位、296-305 位、309-314 位、322-334 位、342-3M 位、398-405 位、419-426 位、 432-443 位、462-475 位、522-530 位、552-567 位、593-607 位、618-634 位、636-647 位、 653-658 位、662-670 位、681-695 位、698-707 位、709-720 位、732-742 位、767-792 位、 794-822 位、828-842 位、851-866 位、881-890 位、895-903 位、928-934 位、940-963 位、 978-986 位、1003-1025 位、1027-1043 位、1058-1075 位、1080-1087 位、1095-1109 位、 1116-1122 位、1133-1138 位、1168-1174 位、1179-1186 位、1207-1214 位、1248-1267 和 17-319 位、417-563 位 feq ID No 224 的第 6-19 位、23-33 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位、457-463 位、494-505 位、514-522 和 183-341 位 Jeq ID No 233 的第 4-27 位、69-77 位、79-101 位、117-123 位、U6-142 位、 155-161 位、171-186 位、200-206 位、213-231 位、233-244 位、258-263 位、269-275 位、 315-331 位、337-346 位、349-372 位、376-381 位、401-410 位、424-445 位、447-455 位、 463-470 位、478-484 位、520-536 位、546-555 位、558-569 位、580-597 位、603-618 位、 628-638 位、648-660 位、668-683 位、717-723 位、765-771 位、781-788 位、792-806 位、 812-822 和 92-231 位、618-757 位 Jeq ID No 234 的第 11-47 位、63-75 位、108-117 位、 119-128 位、133-143 位、171-185 位、190-196 位、226-232 位、257-264 位、278-283 位、 297-309 位、332-338 位、341-346 位、351-358 位、362-372 和 41-170 位；Seq ID No 235 的第 6-26 位、50-56 位、83-89 位、108-114 位、123-131 位、172-181 位、194-200 位、221-238 位、241-259 位、263-271 位、284-292 位、304-319 位、321-335 位、353-358 位、384-391 位、 408-417 位、424-430 位、442-448 位、459-466 位、487-500 位、514-528 位、541-556 位、 572-578 位、595-601 位、605-613 位、620-631 位、634-648 位、660-679 位、686-693 位、 702-708 位、716-725 位、730-735 位、749-755 位、770-777 位、805-811 位、831-837 位、 843-851 位、854-860 位、863-869 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562-568 位、571-582 位、589-594 位、600-608 位、626-635 位、652-669 位、687-702 位、 706-712 位、718-724 位、748-760 位、770-775 和 261-272 位；Seq ID No 242 的第 4-19 位、 30-41 位、46-57 位、62-68 位、75-92 位、126-132 位、149-156 位、158-168 位、171-184 位、 187-194 位、210-216 位、218-238 位、245-253 位、306-312 位、323-329 位、340-351 位、 365-373 位、384-391 位、399-405 位、422-432 位、454-465 位、471-481 位、502-519 位、 530-541 位、550-562 位、566-572 位、576-582 位、593-599 位、620-634 位、637-643 位、 645-651 位、657-664 位、688-701 和 541-551 位；Seq ID No 243 的第 6-11 位、17-25 位、 53-58 位、80-86 位、91-99 位、101-113 位、123-131 位、162-169 位、181-188 位、199-231 位、 245-252 和 84-254 位 Jeq ID No 244 的第 13-30 位、71-120 位、125-137 位、139-145 位、 184-199 和 61-78 位；Seq ID No245 的第 9_30 位、38_53 位、63-70 位、74_97 位、103-150 位、 158-175 位、183-217 位、225-253 位、260-268 位、272-286 位、290-341 位、352-428 位、 434-450 位、453-460 位、469-478 位、513-525 位、527-534 位、554-563 位、586-600 位、 602-610 位、624-640 位、656-684 位、707-729 位、735-749 位、757-763 位、766-772 位、 779-788 位、799-805 位、807-815 位、819-擬6 位、831-855 和 568-580 位 Jeq ID No 246 的第 11-21 位、29-38 和 5-17 位 Jeq ID No 247 的第 2-9 位 Jeq ID ΝοΜ8 的第 4-10 位、 16-28 和 7-18 位、26-34 位；Seq ID No 249 的第 10-16 和 1-15 位；Seq ID No 250 的第 4-11 位 Jeq ID No 251 的第 4-40 位、42-51 和 37-53 位 Jeq ID No 252 的第 4-21 和 22-29 位；Seq ID No 253 的第 2-11 位；9-17 位、Seq ID No 254 的第 32-44 和 1-22 位；Seq ID No 255 的第 19-25 位、27-32 和 15-34 位 feq ID No 256 的第 4-12 位、15-22 和 11-33 位； Seq ID No 257 的第 10-17 位、24-30 位、39-46 位、51-70 和 51-61 位；Seq ID No 258 的第 6-19 位；Seq ID No 259 的第 6-11 位、21-27 位、31-54 和 11-29 位；Seq ID No 260 的第 4-10位、13-45和 11-；35位 Jeq ID No 261 的第4-14位、23-32和 11_；35位 Jeq ID No 262 的第 14-39 位、45-51 和 15- 位 Jeq ID No 263 的第 4-11 位、14- 和 4-17 位 Jeq ID No 洸4 的第 4-16 和 2-16 位 Jeq ID No 265 的第 4_10 位、12-19 位、39-50 和 6_22 位；Seq ID No 266 的第 2-13 位 feq ID No 267 的第 4-11 位、22-65 和 3-19 位 Jeq ID No 268 的第 17-23 位、30-35 位、39-46 位、57-62 和 30-49 位；Seq ID No 269 的第 4-19 和 14-22 位； Seq ID No270 的第 2-9 位；Seq ID No 271 的第 7-18 位、30-43 和 4-12 位；Seq IDNo 272 的第 4-30 位、39-47 和 5-22 位 Jeq ID No 273 的第 6-15 和 14- 位 Jeq ID No 274 的第 4-34 和 23-；35 位 feq ID No 275 的第 4-36 位、44-57 位、65-72 和 14-27 位 Jeq ID No 276 的第 4-18 和 11-20 位 feq ID No 277 的第 5_19 位 Jeq ID No 278 的第 18-36 和 6_20 位 Jeq ID No 279 的第 4-10 位、19-34 位、41-84 位、96-104 和 50-63 位 Jeq ID No 280 的第 4-9 位、19-27 和 8-21 位 Jeq ID No 281 的第 4-16 位、18- 和 22-30 位 Jeq ID No 282 的第 4-15 和 21-；35 位 Jeq ID No 283 的第 4-17 和 3-13 位 feq ID No 284 的第 4-12 和 4-18 位 Jeq ID No 285 的第 4-24 位、31-36 和四_45 位 Jeq ID No 286 的第 12-22 位、 34-49 和 21-32 位 Jeq ID No 沘7 的第 4-17 和 22-32 位 Jeq ID No 沘8 的第 4-16 位、25-42 和 7- 位 Jeq ID No 289 的第 4_10 和 7_20 位 Jeq ID No 290 的第 4_11 位、16-36 位、39-54 和沘-44 位 Jeq ID No 291 的第 5-20 位、29-54 和 14- 位 Jeq ID No 292 的第 24-33 和 10-22o 位 Jeq ID No 四3 的第 10-51 位、54-61 和 43-64 位 Jeq ID No 294 的第 7-13 和 2-17 位 Jeq ID No 295 的第 11-20 和 6_20 位 feq ID No 296 的第 4_30 位、 34-41 和 19-28 位 Jeq ID No 297 的第 11-21 位 feq ID No 298 的第 4-16 位、2H6 和 9-38 位 Jeq ID No 299 的第 4-12 位、15-27 位、30-42 位、66-72 和 10-24 位 Jeq ID No 300 的第 8-17 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ID No 163 的第 475-489 位 Jeq ID No 164 的第 38-56 位 feq ID No 164 的第 583-604 位；Seq ID No 165 的第 202-223 位；Seq ID Nol65 的第 222-247 位； Seq ID No 165 的第 M2-267 位 feq ID No 165 的第洸2-287 位 Jeq ID No 165 的第 282-307 位 feq ID No 165 的第 302-327 位 feq ID No 166 的第 25-48 位 feq ID No 167 的第 204-217 位 feq ID No 168 的第 259-276 位 feq ID No 169 的第 121-139 位；Seq ID No 169 的第洸0-267 位 Jeq ID No 169 的第 215-240 位 feq ID No 170 的第 115-140 位； Seq ID No 172 的第 182-204 位；Seq ID No 173 的第 144-153 位；Seq ID No 173 的第 205-219 位；Seq ID No 174 的第 196-206 位；Seq ID No 174 的第 240-249 位；Seq ID No 174 的第 272-287 位 Jeq ID No 174 的第 199-223 位 feq ID No 174 的第 218-237 位；Seq ID No 175 的第 226-249 位 feq ID No 175 的第沘7_306 位 Jeq ID No 176 的第 430-449 位 Jeq ID No 177 的第 61-375 位 Jeq ID No 178 的第 241-260 位 Jeq ID No 181 的第 483-502 位 feq ID No 182 的第 379-396 位 feq ID No 184 的第 31-51 位 feq ID No 186 的第 1436-1460 位；Seq ID No 186 的第 1455-1474 位；Seq ID No 186 的第 1469-1487 位； Seq ID No 187 的第 215-2 位 feq ID No 187 的第 534-561 位 Jeq ID No 187 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位 feq ID No 213 的第 112-141 位； Seq ID No 215 的第 248-260 位；Seq ID No 216 的第 59-78 位 feq ID No 218 的第 154-170 位；Seq ID No 219 的第 57-73 位；Seq ID No 220 的第四7_314 位；Seq ID No 221 的第 142-157 位 Jeq ID No 222 的第 428-447 位 Jeq ID No 222 的第 573-593 位 Jeq ID No 223 的第 523-544 位 Jeq ID No 223 的第 46-70 位 Jeq ID No 223 的第 65_89 位；Seq ID No 223 的第 84-108 位；Seq ID No 223 的第 122-151 位；Seq ID No 224 的第 123-142 位；Seq ID No 225 的第 903-921 位；Seq ID No 226 的第 119-136 位；Seq ID No 227 的第 142-161 位；Seq ID No 228 的第 258-277 位；Seq ID No 228 的第 272-300 位；Seq ID No 2 的第四5_322 位 Jeq ID No 2 的第 311-343 位 Jeq ID No 2 的第 278-304 位；Seq ID No 230 的第 131-150 位 Jeq ID No 230 的第 195-218 位 Jeq ID No 231 的第 53-70 位；Seq ID No 232 的第 184-208 位；Seq ID No 232 的第 222-246 位；Seq ID No 232 的第 24H65 位 Jeq ID No232 的第洸0_沘4 位 feq ID No 232 的第 279-303 位 feq ID No 232 的第 317-341 位 Jeq ID No 233 的第 678-696 位 Jeq ID No 2；35 的第 88-114 位；Seq ID No 2；35 的第 464-481 位 Jeq ID No 236 的第 153-172 位 feq ID No 236 的第 137-155 位、166-184 位 Jeq ID No 236 的第 215-2 位 feq ID No 237 的第 37-51 位 Jeq ID No 237 的第 53-75 位 feq ID No 237 的第 232-251 位 Jeq ID No 237 的第 318-336 位 Jeq ID No 238 的第 305-315 位 Jeq ID No 238 的第 131-156 位 feq ID No 241 的第 258-275 位；Seq ID No 243 的第 107-137 位；Seq ID No 243 的第 138-162 位；Seq ID No 243 的第 157-181 位 Jeq ID No 243 的第 195-227 位 Jeq ID No 244 的第 62_78 位 feq ID No 245 的第567-584位，以及含所述序列的至少6個、優選8個以上、尤其優選10個以上氨基酸的片段。所有這些片段個別的且各自獨立的形成本發明的優選方面。用一組具有至少10個氨基酸長且有1個氨基酸重疊的肽通過分析蛋白質抗原的完整序列可鑒定某一具體抗原的所有線性超免疫血清反應性片段。隨后，用已表達的全長蛋白質或其結構域多肽通過分析與超免疫血清在一起的蛋白質抗原可鑒定非線性表位。假如某一蛋白質的單獨結構域足以形成不依賴于其天然蛋白質的3D結構，分析與超免疫血清在一起的相應重組或合成產生的結構域多肽可鑒定多結構域蛋白質個別結構域內的構象表位。對于那些其中的結構域具有線性表位以及構象表位的抗原而言，利用對應于線性表位的肽進行的競爭性實驗可用于確認構象表位的存在。其中，應理解本發明還尤其涉及編碼上述片段的核酸分子、與編碼所述片段的核酸分子雜交的核酸分子、尤其是那些在嚴謹條件下雜交的核酸分子以及用于擴增編碼所述片段的核酸分子的核酸分子，諸如PCR引物。在這些方面，如上所述，優選的核酸分子是與優選片段相應的那些核酸分子。本發明還涉及含有本發明的一種或多種核酸分子的載體、含本發明載體的遺傳改造過的宿主細胞和用重組技術生產超免疫血清反應性抗原及其片段。多種表達載體可用于表達按照本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段。通常， 在宿主中適于維持、繁殖或表達核酸從而表達多肽的任何載體都可用于這方面的表達。依照本方面的這一方面，載體可以是，例如，質粒載體、單鏈或雙鏈噬菌體載體、單鏈或雙鏈 RNA或DNA病毒載體。本文所公開的起始質粒可購買獲得、公開獲得或可通過眾所周知的已發表方法的常規應用構建自有用的質粒。在某些方面，載體中優選的是用于表達本發明的核酸分子和超免疫血清反應性抗原或其片段的那些載體。宿主細胞中的核酸構建體可以常規方式用于生產由所述重組序列編碼的基因產物。或者，本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段可通過傳統的肽合成儀合成產生。成熟蛋白質可在適當啟動子的調控下表達于哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中。無細胞翻譯體系還可通過來自本發明DNA構建體的 RNA應用于生產所述蛋白質。宿主細胞可遺傳改造以引入核酸分子并表達本發明的核酸分子。適當宿主的代表性例子包括細菌細胞，諸如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草芽孢桿菌細胞；真菌細胞，諸如酵母細胞和曲霉菌細胞；昆蟲細胞，諸如果蠅S2和Spodoptera Sf9細胞；動物細胞，諸如CHO、COS、Hela, C127、3T3、BHK、293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。本發明還提供了生產化膿鏈球菌超免疫血清反應性抗原及其片段的方法，包括從宿主細胞表達由本發明所提供核酸分子編碼的超免疫血清反應性抗原或其片段。本發明另外提供了生產能表達化膿鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段的細胞，包括用按照本發明的載體轉化或轉染合適的宿主細胞從而使被轉化或轉染的細胞表達由該載體中所含核酸編碼的多肽。多肽可以修飾過的形式表達，諸如融合蛋白，而且不僅可包含分泌信號，還可包含附加的異源功能區。這樣，例如，某一區段的附加氨基酸，尤其是帶電荷氨基酸，可加入多肽的N-或C-末端以便在純化期間或隨后的操作和儲存期間提高其在宿主細胞中的穩定性和持久性。此外，某些區段可加入多肽中以方便純化。所述的區域可在該多肽最終制備步驟前去除。其中，在多肽中添加某部分肽產生分泌物或排泄物以提高穩定性或方便純化是本領域中熟知和常規的技術。優選的融合蛋白包含來自免疫球蛋白且對穩定或純化多肽有效的異源區段。例如，EP-A-O 464533(加拿大副本2045869)公開了含免疫球蛋白分子恒定區多個部分以及另一蛋白質或其部分的融合蛋白。在藥物開發中，例如，為了高通量篩選檢測的目的將蛋白質與抗體Fc部分融合以鑒定拮抗劑。參閱，例如，{Bennett，D.等，1995} 和{Johanson, K.等，1995}。化膿鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段可通過眾所周知的方法回收和純化自重組細胞培養物，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、羥磷灰石層析和外源凝集素層析。按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段可通過化學合成以及生物技術手段產生。后者包括用含有按照本發明的核酸的載體轉染或轉化宿主細胞并在本領域技術人員已知的條件下培養已被轉染或已被轉化的宿主細胞。生產方法還可包括純化步驟以純化或分離待制備的多肽。在優選實施方案中的載體是按照本發明的載體。
按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段可用于檢測樣品中的某種或幾種生物體，所述樣品含這些生物體或其來源多肽。優選這樣的檢測是用于診斷的，更優選用于疾病的診斷，最優選用于診斷與革蘭氏陽性細菌的存在或富集相關或有聯系的疾病，尤其是包括鏈球菌、葡萄球菌和乳酸菌在內的細菌類型。更優選地，微生物可選自無乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae)、月市炎鏈球菌禾口變異鏈球菌(Streptococcus mutans)類型， 尤其是所述微生物為化膿鏈球菌。本發明還涉及諸如定量測定等診斷檢測法和用于檢測細胞和組織中本發明超免疫血清反應性抗原及其片段水平的診斷檢測中，包括正常和異常水平的測定。因而，例如， 依照本發明用于檢測較正常對照組織樣品而言過表達的多肽的診斷檢測法可用于檢測感染的存在，并識別正被感染的生物體。可用于確定宿主來源樣品中多肽水平的檢測技術是本領域技術人員眾所周知的。這樣的檢測方法包括放射免疫檢測法、競爭性結合檢測法、蛋白質印跡分析和ELISA檢測法。其中，ELISA是常常優選的。ELISA檢測最初包括制備特異于所述多肽的抗體，優選單克隆抗體。此外，通常制備與所述單克隆抗體結合的報道抗體。 該報道抗體與可檢測試劑附著，諸如放射性試劑、熒光試劑或酶促試劑，諸如辣根過氧化物酶。按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段還可用于陣列的目的或與連同陣列使用。更具體而言，可將至少一個按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段固定于支持物上。所述支持物通常包含各種超免疫血清反應性抗原及其片段，憑此通過使用一種或數種按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段和/或不同的超免疫血清反應性抗原及其片段可建立多樣性。所述陣列的特征性質，也是一般而言任何陣列的特征性質，是單獨的多肽固定于所述支持物或其表面的單獨的或預定區域或位置。因此，陣列的單獨位置或區域的任一活性可能都與某一特殊的多肽相關。固定于支持物上的不同超免疫血清反應性抗原及其片段的數目可以從少到10個多到數千個不同的超免疫血清反應性抗原及其片段之間變化。在優選的實施方案中每Cm2的超免疫血清反應性抗原及其片段的密度少到每 cm210個肽/多肽至每cm2至少400個不同的肽/多肽且更單獨的是每cm2至少1000個不同的超免疫血清反應性抗原及其片段。所述陣列的制備是本領域技術人員已知的，例如，參閱美國專利5，744，309。陣列優選包含一個平坦、多孔或非多孔且具有至少第一個表面的固體支持物。如本文所公開的超免疫血清反應性抗原及其片段被固定于所述的表面上。其中，優選的支持物材料是玻璃或纖維素。用于本文所述任一診斷應用中的陣列也在本發明的范圍內。除了按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段之外，按照本發明的核酸分子也可用于上述陣列的產生中。本申請也適用于抗體構成的陣列，其中抗體優選此處所述的單克隆抗體。另一方面，本發明涉及針對按照本發明的任一超免疫血清反應性抗原及其片段、 衍生物或其片段的抗體。本發明包括，例如，單克隆和多克隆抗體，嵌合的、單鏈的和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達文庫的產物。也屬于本發明范圍內的是抗體可能是嵌合的，即，其不同部分來源自不同物種或至少各自的序列取自不同的物種。針對相應于本發明序列的超免疫血清反應性抗原及其片段產生的抗體可通過將超免疫血清反應性抗原及其片段直接注射入動物中或通過將超免疫血清反應性抗原及其片段施用于動物，優選非人動物而獲得。由此獲得的抗體然后與超免疫血清反應性抗原及其片段自身結合。如此，即使只編碼超免疫血清反應性抗原及其片段的片段的序列也可用于產生結合完整天然超免疫血清反應性抗原及其片段的抗體。所述的抗體然后可用于從表達那些超免疫血清反應性抗原及其片段的組織中分離超免疫血清反應性抗原及其片段。為了制備單克隆抗體，本領域已知提供連續細胞系培養所產生抗體的任何技術都可使用。(如，最初在{K0hler，G·等，1975}中所述的。)用于單鏈抗體產生所述的技術(美國專利文件4，946，778)可適用于生產針對按照本發明超免疫血清反應性抗原及其片段的單鏈抗體。此外，轉基因小鼠，或諸如其它哺乳動物等其它生物體可用于表達針對按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的人源化抗體。或者，噬菌體展示技術或核糖體展示可應用于選擇對超免疫血清反應性抗原及其片段具結合活性的抗體基因，它們可來自為具有相應靶抗原而篩選的人淋巴細胞PCR擴增 ν-基因的全部組分或來自天然的文庫{McCafferty，J.等，1990} ； {Marks, J.等，1992}。這些抗體的親合力也可通過鏈的改組得到提高{ClaCkS0n，T.等，1991}。如果存在兩個抗原結合結構域，各結構域可直接針對不同表位-被稱為“雙特異性的”抗體。上述抗體可應用于分離或鑒定表達超免疫血清反應性抗原及其片段的克隆或通過將抗體附著于固體支持物上進行親和層析分離和/或純化而純化本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段。因此，特別地，針對本發明超免疫血清反應性抗原及其片段的抗體可應用于抑制和/或治療感染，尤其是細菌感染，更尤其是由化膿鏈球菌引起的感染。超免疫血清反應性抗原及其片段包括形成本領域特殊的一個方面的抗原性、表位性或免疫學等價衍生物。術語“抗原等價衍生物”用于此處時包含被確定抗體特異識別的超免疫血清反應性抗原及其片段或其同等物，在用按照本發明的蛋白質或超免疫血清反應性抗原及其片段接種免疫后，所述抗體干擾了病原體和哺乳動物宿主之間的相互作用。術語“免疫學等價衍生物”用于此處時包含肽或其等價物，當將它們用于適當制劑中以在脊椎動物中產生抗體時，所述抗體發揮了干擾病原體和哺乳動物宿主之間相互作用的功能。超免疫血清反應性抗原及其片段，諸如抗原性或免疫學等價衍生物或它們的融合蛋白可用作抗原來免疫小鼠或諸如大鼠或小雞等其它動物。融合蛋白可使超免疫血清反應性抗原及其片段具有穩定性。抗原可以通過例如偶聯與例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋白(KLH)等免疫原性載體蛋白聯合。或者，包含多拷貝所述蛋白質或超免疫血清反應性抗原及其片段或抗原性或免疫學等價的超免疫血清反應性抗原及其片段的抗原性肽對于提高免疫原性而言可能已具有足夠的抗原性，從而避免了載體的使用。優選的對抗體或其衍生物進行修飾使其在個體中的免疫原性降低。例如，如果所述個體是人，則抗體可能最好被人源化，其中雜交瘤衍生抗體的互補性決定區被移植入人的單克隆抗體內，參閱{Jones, P.等，1986}或{Tempest, P.等，1991}。本發明多核苷酸在遺傳免疫中的應用優選采用合適的運送方法，諸如將質粒DNA 直接注射入肌肉中、運送具特異蛋白質載體的DNA復合物、DNA與磷酸鈣共沉淀、將DNA封裝入各種形式的脂質體中、微粒轟擊{Tang, D.等，1992}，{Eisenbraun, Μ.等，1993}以及用克隆的逆轉錄病毒載體進行體內感染{Seeger，C.等，1984}。
另一方面，本發明涉及與按照本發明的任一超免疫血清反應性抗原及其片段結合的肽，以及制備所述肽的方法，由此該方法的特征在于按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的應用，而基本的步驟則是本領域技術人員所已知的。所述肽可依照本領域不同情形下利用不同的方法產生，諸如噬菌體展示或核糖體展示。假使用噬菌體展示，基本上肽庫是以噬菌體的形式產生的，且將此類文庫與靶分子(在本情形中按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段)接觸。隨后從各自的反應液中洗下與靶分子結合的肽，優選作為與靶分子在一起的復合物被洗下。結合特征，至少一定程度上，取決于具體實行的實驗安排，諸如鹽濃度等等，這是本領域技術人員所已知的。在將以較高的親和力或較大的勢能與靶分子結合的那些肽從文庫中未結合的成員中分隔出來后，以及任選的同樣在將靶分子從靶分子和肽的復合物中取出后，可隨后對相應的肽進行定性。4在定性前可任選的進行擴增，諸如，通過培養肽編碼噬菌體。所述定性優選包括對靶結合肽進行測序。基本上，所述的肽不局限于其長度，不過， 優選以相應的方法獲得長度為大約8-20個氨基酸的肽。文庫的大小可能在大約IO2-IO18種不同的肽，優選IO8-IO15種不同的肽，不過，并不局限于此。結合超免疫血清反應性抗原及其片段的具體形式靶分子是德國專利申請DE 19742706中所述的所謂“抗促成素”。另一方面，本發明涉及與按照本發明的任一超免疫血清反應性抗原及其片段相互作用的的功能性核酸，以及制備所述功能性核酸的方法，因此該方法的特征在于按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的應用，而基本的步驟則是本領域技術人員所已知的。功能性核酸優選為適體和spiegelmers。適體是單鏈或雙鏈且特異與靶分子相互作用的D-核酸。適體的制備和選擇參閱， 例如歐洲專利EP 0533838。基本上采用了以下步驟。首先，提供核酸的混合物，即，可能的適體，因此各核酸通常包含一區段數個、優選至少8個連續的隨機核苷酸。此混合物隨后與靶分子接觸從而使所述核酸與靶分子結合，這是基于與候選混合物相比，該混合物對靶分子的親和力有所增加或對其具有更大的勢能。結合的核酸(一個或多個分子)隨后從留下的混合物中分離出來。任選的，用例如聚合酶鏈式反應擴增由此獲得的核酸。這些步驟可重復數次得到具有特異結合靶分子的較高比率核酸的混合物，然后任選的從中選擇最終結合的核酸。這些特異結合的核酸被稱為適體。顯而易見在產生或鑒定單個核酸混合物的適體樣品的方法的任一階段都可用標準技術測定其序列。可通過例如引入本領域技術人員已知產生適體的預定化學基團使適體穩定，這也在本發明的范圍內。這樣的修飾可能，例如， 位于核苷酸的糖基部分2’位置處引入一氨基。適體目前被用作治療劑。不過，由此選擇或產生的適體可用于靶分子的確認和/或用于先導物質被開發成藥物，優選以小分子為基礎的藥物開發，這也在本發明的范圍內。這事實上是通過競爭性試驗完成的，其中靶分子和適體之間的相互作用被候選藥物通過從靶分子和適體的復合物中置換出適體而被抑制，假設各個候選藥物可特異的抑制靶分子和適體之間的相互作用，且如果相互作用是特異的，所述的候選藥物就，至少在原則上，適于封閉靶分子并因此降低其在含所述靶分子的相應體系中的生物利用度或活性。由此獲得的小分子可然后被進一步的衍生和修飾以使它物理、 化學、生物學和/或醫學特性，諸如毒性、特異性、生物降解性和生物利用度最優化。Spiegelmer及其產生或制備是基于相似的原理。spiegelmer的制備參閱國際專利申請WO 98/08856。Spiegelmer是L型核酸，這意味著它們是由L型核苷酸而非象適體那樣由D型核苷酸組成的。Spiegelmer實際上的特征在于與適體相比，它們在生物學體系中具有非常高的穩定性，特異地與它們所針對的靶分子相互作用。在spiegelmer產生過程中，建立了一組異源D-核酸，將所述的那組異源D核酸與靶分子的旋光對映體接觸，在本情形中例如按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的天然存在L型對映體的D對映體。隨后，分隔開不與靶分子的旋光對映體相互作用的那些D核酸。而那些與靶分子旋光對映體相互作用的那些D核酸被分離、任選的測定和/或測序并隨后基于獲自D核酸的核酸信息合成相應的L核酸。這些L核酸在序列形式上與跟靶分子的旋光對映體相互作用的上述D核酸相同，將特異的與天然存在的靶分子而非其旋光對映體相互作用。與適體產生方法類似，也可能數次重復多個步驟并因此富集與靶分子的旋光對映體特異相互作用的那些核酸。另一方面，本發明涉及與按照本發明的核酸分子相互作用的功能性核酸，以及用于制備所述功能性核酸的方法，其中該方法的特征在于使用了按照本發明的核酸分子及其相應序列且基本步驟是本領域技術人員所已知的。功能性核酸優選是核酶、反義寡核苷酸和 siRNA。核酶是優選由RNA組成且基本上包含兩部分的催化活性核酸。第一部分顯示出催化活性，而第二部分負責與靶核酸的特異相互作用，在本情形中靶核酸是編碼按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的核酸。基于靶核酸與核酶第二部分之間的相互作用， 通常是通過雜交和在兩條雜交鏈上基本上互補的堿基伸展段的Watson-Crick堿基配對， 催化活性部分可被活化，即，如果所述核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性，那么它在分子內或分子間催化靶核酸。隨后，靶核酸可能進一步降解，這最后導致了靶核酸以及來源與所述靶核酸的蛋白質的降解。核酶、其用途和設計原則是本領域技術人員所已知的，可參閱 {Doherty, Ε.等，2001}和{Lewin, Α.等，2001}。用于藥物制備及作為診斷劑的反義寡核苷酸的活性和設計分別基于相似的作用模式。基本上，反義寡核苷酸基于堿基互補與靶RNA雜交，優選與mRNA雜交，從而激活RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯二者偶聯的DNA激活。不過，磷酸二酯偶聯的DNA被細胞核酸酶快速降解，而硫代磷酸酯偶聯的DNA則不會。這些抗性、非天然存在DNA衍生物通過與RNA雜交而不抑制RNase H。換而言之，反義多核苷酸只作為DNA RNA雜交復合物有效。其中，這類反義寡核苷酸的例子參閱美國專利5，849，902和US 5，989，912。換言之，基于靶分子的核酸序列，即，在本案例中是針對按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的核酸分子，或來自相應核酸序列原則上可從中推導出來的靶蛋白，或通過同樣的了解所述核酸序列，尤其是mRNA，可基于堿基互補的原則設計適當的反義寡核苷酸。尤其優選的是具有硫代磷酸酯的短伸展段的反義寡核苷酸(3-9個堿基)。最短3 個DNA堿基是細菌RNase H活化所需要的，而最短5個堿基是哺乳動物RNase H活化所需要的。在這些嵌合寡核苷酸中存在形成RNase H底物的中心區，兩側是由不會形成RNase H 底物的修飾過的核苷酸組成的雜交“臂”。嵌合寡核苷酸可被諸如2' -0-甲基或2'-氟代等修飾。備選的方案是在所述的臂中使用磷酸甲酯或氨基磷酸酯鍵。在本發明實踐中有效的反義寡核苷酸的別的實施方案是P-甲氧基寡核苷酸、部分的P-甲氧基寡脫氧核糖核苷酸或P-甲氧基寡核苷酸。
對于本發明而言特別相關和有效的是如以上提及的兩個美國專利中所更具體描述的那些反義寡核苷酸。這些寡核苷酸包含非天然存在的5' -3'-連接核苷酸。更確切的說，寡核苷酸具有兩種類型的核苷酸2'-脫氧硫代磷酸酯，它激活RNase H，以及 2'-修飾的核苷酸，它不激活RNaseH。2'-已修飾的核苷酸之間的鍵可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸二酯。RNase H的活化是通過含3_5個2’脫氧硫代磷酸酯核苷酸的鄰近RNase H-活化區激活細菌的RNase H以及含5_10個2 ‘-脫氧硫代磷酸酯核苷酸的鄰近RNase H-活化區激活真核的、尤其是哺乳動物的RNase H而完成的。防止降解的保護作用是通過形成5'和3'末端堿基高度核酸酶抗性以及任選的通過安置3'末端封閉基團而完成。更具體而言，所述的反義寡核苷酸包含-5'末端和-3'末端；和11-59個獨立選擇自2’-修飾磷酸二酯核苷酸和2’-修飾P-烷氧基磷酸三酯核苷酸的5' -3'-連接核苷酸；且其中5'-末端核苷附著于3-10個毗連硫代磷酸酯連接脫氧核糖核苷酸的RNase H-活化區，且其中所述寡核苷酸的3'-末端選自反向的脫氧核糖核苷酸、1-3個硫代磷酸酯2’ -修飾核糖核苷酸的毗連伸展段、生物素基團和P-烷氧基磷酸三酯核苷酸。還可使用其中不是5'末端核苷附著于RNase H-活化區而是3'末端核苷如上所述附著于RNase H-活化區的反義寡核苷酸。此外，5'末端選自不同于所述寡核苷酸3‘末端的特殊基團。按照本發明的核酸以及超免疫血清反應性抗原及其片段可用作或用于制備藥物組合物，尤其是疫苗。優選所述的藥物組合物、優選疫苗是用于預防或治療化膿鏈球菌引起、涉及或相關的疾病。在此范圍內，本發明的另一方面涉及在個體、尤其是哺乳動物內引起免疫應答的方法，它包括用按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段或其片段或變體接種個體，足以產生抗體以保護所述個體不受感染，尤其是鏈球菌感染，最具體而言是化膿鏈球菌感染。本發明的另一方面涉及在個體中誘發免疫應答的方法，它包括，通過基因治療或其它方法運送功能性編碼超免疫血清反應性抗原及其片段或其片段或變體的核酸，以便在體內表達超免疫血清反應性抗原及其片段或其片段或變體，從而誘導免疫應答產生抗體或細胞介導的T細胞應答(產生細胞因子的T細胞或細胞毒性T細胞)，以保護所述的個體免受疾病的侵襲，無論該疾病是已存在于個體內的或未存在其中的。施加基因的一個方式是將其包被在顆粒或其它物質上加速進入預定細胞中。本發明的另一方面涉及免疫學組合物，所述組合物在引入能在其中誘發免疫應答的宿主時在該宿主中誘發免疫應答，其中的組合物包含編碼和表達按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的抗原的重組DNA。免疫學應答可用于治療或預防，且可采用抗體免疫性或細胞免疫性的形式，諸如由CTL或CD4+T細胞產生的免疫性。本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段或其片段可與輔助蛋白質融合，所述輔助蛋白質可能自身不產生抗體，但能穩定上述第一種蛋白質并產生具有免疫原性和保護特性的融合蛋白。這種融合的重組蛋白質優選進一步包含抗原性輔助蛋白，諸如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或半乳糖苷酶，穩定蛋白質并方便其產生和純化的相對大的輔助蛋白。此外，輔助蛋白在提供免疫系統全身性刺激的意義上可用作佐劑。輔助蛋白可附著于第一種蛋白質的氨基或羧基末端。
此外，本發明提供了在化膿鏈球菌感染的動物模型的所述遺傳免疫接種實驗中使用所述的核酸分子或其特殊片段的方法。所述片段對于鑒定能引起預防或治療免疫應答的蛋白質表位是特別有效的。此方法可隨后從成功抵抗或清除感染所必需的器官內產生特殊意義的單克隆抗體，用于哺乳動物、尤其是人體內化膿鏈球菌預防劑或治療方法的研發。超免疫血清反應性抗原及其片段可作為抗原用于宿主的疫苗接種從而產生特異抗體保護宿主抵抗細菌入侵，例如，通過阻斷細菌在受損傷組織的粘附。組織損傷的例子包括由例如機械、化學或熱損傷或留置裝置的植入造成的皮膚或結締組織傷口，或諸如口腔、 乳腺、尿道或陰道等黏膜中的傷口。本發明還包括含與適當載體在一起的免疫原性重組蛋白質的疫苗制劑。由于蛋白質在胃中可分解，因此優選非腸道施用，包括，例如，皮下、肌肉內、靜脈內或皮內施用。適于非腸道施用的制劑包括以下各項的水性和非水性無菌注射液抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與個體的體液(優選血液)等滲的溶質，以及可包含懸浮劑或增稠劑在內的水性和非水性無菌懸浮液。制劑可以單位劑量或多劑量包裝出現，例如，封裝在安瓿和小瓶中，且可以凍干狀態儲存，只需在臨用前加入無菌液態載體即可。疫苗制品還可包括用于增強制品免疫原性的佐劑體系，諸如水包油體系和本領域已知的其它體系。劑量取決于疫苗的特異活性且可用常規實驗方便的測定。另一方面，本發明涉及包含了本發明所提供針對化膿鏈球菌而言的超免疫血清反應性抗原或其片段的藥物組合物。所述藥物組合物可包含抗化膿鏈球菌的一個或多個超免疫血清反應性抗原或其片段。任選的，所述的化膿鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段還可與抗其它病原體的抗原組合于聯合藥物組合物中。優選地，所述的藥物組合物是用于預防或治療化膿鏈球菌和/或其它病原體引起的感染的疫苗，針對所述病原體的抗原已包含于該疫苗中。依照另一方面，本發明涉及包含如上所鑒定針對化膿鏈球菌的編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的核酸分子的藥物組合物。所述的藥物組合物可包含編碼針對化膿鏈球菌的超免疫血清反應性抗原或其片段的一個或多個核酸分子。任選的，所述編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的化膿鏈球菌核酸分子還可與編碼針對其它病原體的抗原的核酸分子組合于聯合型藥物組合物中。優選地，所述的藥物組合物是用于預防或治療化膿鏈球菌和/或其它病原體引起的感染的疫苗，針對所述病原體的抗原已包含于該疫苗中。藥物組合物可包含任何適當的輔助物質，諸如緩沖物質、穩定劑或更進一步的活性成分，尤其是已知與藥物組合物和/或疫苗產生有聯系的成分。對于按照本發明的超免疫血清反應性抗原、其片段或其編碼核酸分子而言優選的載體和/或賦形劑是用于進一步刺激免疫應答產生超免疫血清反應性抗原、其片段或其編碼核酸分子的免疫刺激化合物。優選的在按照本發明的藥用制劑中的免疫刺激化合物選自聚陽離子物質，尤其是聚陽離子肽、免疫刺激核酸分子，優選免疫刺激脫氧核苷酸、明礬、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、神經刺激化合物，尤其是人生長激素，或它們的組合。也在本發明范圍內的是，藥物組合物、尤其是疫苗除了按照本發明的超免疫血清反應性抗原、其片段和/或其編碼核酸分子之外還包含生物學或制藥學活性的其它化合物。優選地，所述組合物包含至少一種聚陽離子肽。依照本發明使用的聚陽離子化合物可能是顯示出符合WO 97/30721的特征性作用的任何聚陽離子化合物。優選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機聚陽離子、堿性聚氨基酸或它們的混合物。這些聚氨基酸應具有至少 4個氨基酸殘基的鏈長(W0 97/30721)。尤其優選的是類似聚賴氨酸、聚精氨酸和多肽的物質或它們的混合物，其中在8個以上氨基酸的范圍內、尤其是20個以上氨基酸殘基的范圍內含20%以上、尤其是50%以上堿性氨基酸。其它優選的聚陽離子和它們的藥物組合物參閱TO 97/30721 (例如，聚乙烯亞胺)和WO 99/38528。優選這些多肽包含20-500個之間的氨基酸殘基，尤其是在30-200個殘基之間。這些聚陽離子化合物可化學或重組產生或可來自天然來源。陽離子(多)肽還可以是具有如綜述{GanZ，T.，1999}中所述的抗微生物特性。這些(多)肽可能是原核的或動物的或植物來源的或可化學或重組產生(W0 02/13857)。肽還可以屬于防衛素類型(W0 02/13857)。所述肽的序列可發現于，例如，以下網址的抗微生物序列數據庫http://www. bbcm. univ. trieste. it/ tossi/pag2. html所述宿主防御肽或防御工具也是優選形式的按照本發明的聚陽離子聚合體。通常，允許作為優選由APC(包括樹狀細胞)介導的適應性免疫系統活化(或下調)終產物的化合物被用作聚陽離子聚合體。在本發明中尤其優選用作聚陽離子物質的是cathelicidin來源抗微生物肽或其衍生物(在此收編作為參考的國際專利申請WO 02/13857)，尤其是來源于哺乳類 cathelicidin、優選來自人、牛或小鼠的抗微生物肽。天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT (來自陽離子肽、觸角 (antennapedia)肽、殼聚糖或幾丁質的其它衍生物)或通過生化或重組產生的來源于這些肽或蛋白質的其它肽。其它優選的聚陽離子化合物是cathelin或cathelin的相關或衍生物質。例如，小鼠的cathelin是具有氨基酸序列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKL VPQPE -COOH的肽。相關或衍生cathelin物質包含cathelin的全部或具有至少15-20個氨基酸殘基的部分。衍生可包括用不在20個標準氨基酸之內的氨基酸進行的天然氨基酸替代或修飾。此外，更多的陽離子殘基可引入所述cathelin分子中。這些cathelin分子優選與抗原組合。這些cathelin分子令人驚訝的顯示出也可有效的作為抗原的佐劑而無需添加另外的佐劑。因此可能利用所述cathelin分子作為疫苗制品中的有效佐劑，可以有或沒有另外的免疫活化物質。可依照本發明使用的另一優選的多陽離子物質是含有由3-7個疏水氨基酸組成的接頭隔開的至少2個KLK-基序的合成肽(國際專利申請W002/3M51，結合于此作為參考)。本發明的藥物組合物可進一步包含免疫刺激核酸。免疫刺激核酸是，例如，含有核酸的中性或人造CpG，所述核酸是來自非脊椎動物的核酸短伸展段或者是在某一堿基段含非甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤雙核苷(CpG)的短寡核苷酸形式(ODNs)(例如，參閱WO 96/02555)。或者，如W001/93903中所述基于肌苷和胞苷的核酸或含脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的脫氧核酸(參閱WO 01/93905和PCT/EP 02/05448，結合于此作為參考)也可優選用作本發明的免疫刺激核酸。優選地，不同免疫刺激核酸的混合物可依照本發明使用。也屬于本發明范圍的是任一上述聚陽離子化合物與任一上述免疫刺激核酸組合。 優選地，所述的組合是與結合于此作為參考的以下文獻之一所述的一致的W0 01/93905、WO 02/3245UW0 01/54720,WO 01/93903,WO 02/13857 和 PCT/EP 02/05448 以及奧地利專利申請 A 1924/2001。另外或備選的所述疫苗組合物除了包含按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段以及它們的編碼核酸之外，還可包含刺激神經組織的化合物。優選地，刺激神經組織的化合物是人生長因子，如WO 01/24822中所述。同樣優選的是，刺激神經組織的化合物與上述任一聚陽離子化合物和/或免疫刺激核酸組合。本發明的另一方面涉及藥物組合物。所述的藥物組合物是，例如，本文所述的疫苗。藥物組合物還是包含以下任一種化合物或其組合的藥物組合物按照本發明的核酸分子、按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段、按照本發明的載體、按照本發明的細胞、按照本發明的抗體、按照本發明的功能性核酸以及諸如抗促成素等按照本發明的結合肽、本文所述的任何激動劑和拮抗劑。與之有關的是任一這些化合物都可與針對細胞、組織或器官的未消毒或消毒載體(一種或多種)組合使用，諸如適于施用于某受試者的藥用載體。所述組合物包括，例如，培養基添加劑或治療有效量的本發明超免疫血清反應性抗原及其片段和藥用可接受載體或賦形劑。所述載體可包括，但不局限于鹽、緩沖鹽、葡萄糖、水、 甘油、乙醇及它們的組合。該制劑應與施用模式相配。藥物組合物可以任一有效的、方便的形式施用，其中包括，例如，局部、口、肛門、陰道、靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、鼻內或皮內途徑施用。在治療中或作為預防藥，活性試劑可作為可注射組合物施用于個體，例如，作為無菌水分散液，優選等滲的。或者組合物可制備成局部應用的，例如以藥膏、霜、洗液、眼膏、滴眼液、滴耳液、漱口水、浸漬敷料和縫合線和氣霧劑形式，且可包含合適的常規添加劑，包括，例如，防腐劑、 幫助藥物滲透的溶劑以及在藥膏和霜中的潤膚劑。這樣的局部制劑還可包含兼容的常規載體，例如霜或軟膏基質、以及用于洗液的乙醇或油醇。所述的載體組成可占制劑重量的約 1% _98%，更通常的是組成高達制劑重量的約80%。除了上述治療之外，本發明組合物通常還可用作傷口處理劑以防止細菌粘附于傷口組織中暴露的基質蛋白質上，且可作為抗生素預防療法的另一備選方案或與其結合使用于牙科治療的預防性應用中。疫苗組合物便利的是以可注射形式。常規的佐劑可用于增強免疫應答。疫苗接種的適當單位劑量是0. 05-5 μ g/kg抗原，這樣的劑量優選施用1-3次且間隔1-3周。采用指定的劑量范圍，應不會觀察到本發明化合物的毒理學副作用，如果有就將停止它們施用于適當個體。在另一實施方案中，本發明涉及包含了填充有一種或多種本發明上述組合物成分的一個或多個容器的診斷和藥物包裹和試劑盒。所述成分可以有效量、劑量、制劑或組合存在。與所述容器相關的是管理制藥的政府機構規定形式的說明書、藥品或生物產品的用途或銷售，反映出制藥機構同意該產品的應用或銷售是針對人進行施用的。與本發明有關且涉及本文所述用途(例如，藥物組合物或疫苗的應用)的任何疾病具體而言是由鏈球菌、更優選化膿鏈球菌引起、連接或相關的疾病或疾病狀況。與此有關應注意的是化膿鏈球菌包含本文所述那些菌株在內的數個菌株。涉及依照本發明待預防和 /或治療的細菌感染、尤其引起或與其相關的疾病除了包括細菌性咽炎之外，還包括人的猩紅熱、膿皰病、風濕熱、壞死性筋膜炎和膿毒病。在另一實施方案中，本發明涉及利用按照本發明的任一超免疫血清反應性抗原或核酸的篩選方法。篩選方法對于本領域技術人員而言同樣是已知的，且可設計成篩選激動劑或拮抗劑的。優選在抑制或阻礙按照本發明的任一超免疫血清反應性抗原及其片段與相互作用配體的結合的情況下篩選拮抗劑。所述的相互作用配體可以是天然存在的相互作用配體或非天然存在的相互作用配體。本發明還提供了篩選方法用于鑒定化合物是否增強(激動劑)或阻斷(拮抗劑) 本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段或核酸分子的功能，諸如它們與結合分子的相互作用。篩選方法可涉及高通量。例如，為了篩選激動劑或拮抗劑，分別按照本發明的核酸分子和核酸的相互作用配體可能是合成的反應混合物、細胞區室(諸如膜、細胞被膜或細胞壁)或它們中任一種的制劑，可從表達結合本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的分子的細胞中制備。在可能是激動劑或拮抗劑的候選分子缺乏或存在的條件下將所述制劑與標記好的超免疫血清反應性抗原及其片段一起溫育。候選分子與結合分子結合的能力反映在被標記配體的結合有所下降。無償結合的分子，即，不誘發超免疫血清反應性抗原及其片段的功能性作用的分子，最有可能是好的拮抗劑。可很好結合且引起與超免疫血清反應性抗原及其片段相同或非常接近的功能作用的分子是良好的激動劑。潛在激動劑和拮抗劑功能作用可通過，例如，在候選分子與細胞或適當細胞制劑相互作用后測定報道體系的活性來檢測，且將此效用與本發明超免疫血清反應性抗原及其片段或所引起作用與超免疫血清反應性抗原及其片段相同的分子的效用進行比較。這方面可用的報道體系包括但不局限于轉換成產物的標記底物的比色分析、對超免疫血清反應性抗原及其片段功能活性中的變化作出響應的報道基因以及本領域已知的結合試驗。檢測拮抗劑的另一例子是在適于進行競爭性抑制試驗的條件下將本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段和具有膜結合分子、重組結合分子、天然底物或配體或底物或配體模擬物的可能拮抗劑結合。超免疫血清反應性抗原及其片段可被諸如放射性或比色分析化合物標記，從而可準確測定與結合分子結合或轉換成產物的超免疫血清反應性抗原及其片段的分子數目以評估可能性拮抗劑的效力。可能性的拮抗劑包括與本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段結合并從而抑制或消除其活性的小有機分子、肽、多肽和抗體。可能的拮抗劑還可以是結合于結合分子的同一位點且不會誘導產生本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的功能活性的小有機分子、肽、諸如緊密相連的蛋白質或抗體等多肽。可能的拮抗劑包括結合并占領超免疫血清反應性抗原及其片段的結合位點因此阻礙其與細胞結合分子結合從而使正常生物學活性被抑制的小分子。小分子的例子包括但不局限于小的有機分子、肽或肽類似分子。其它的可能性拮抗劑包括反義分子。其它的可能性拮抗劑包括反義分子(參閱{0kanO，H.等，1991}；作為基因表達反義抑制物的寡脫氧核苷酸(0LIG0DE0XYNUCLE0TIDES AS ANTI SENSE INHIBITORS OF GENE EXPRES SI ON) ；CRC 出版社，Boca Ration，FL (1988)，以描述這些分子)。優選的可能性拮抗劑包括本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的衍生物。用于此處時，按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的活性是它們與其任一相互作用配體結合的性能或與自身的或任何相互作用配體結合的所述性能的程度。在某一具體方面，本發明提供了本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段、核酸分子或抑制劑在干預病原體和被造成感染后遺癥的哺乳動物宿主之間最初的物理學相互作用中的應用。具體而言本發明的分子可用于i)防止化膿鏈球菌對留置裝置上的哺乳動物胞外基質蛋白質或傷口處的胞外基質蛋白質的粘附；ii)封閉通過例如啟動哺乳動物酪氨酸激酶的磷酸化作用而介導哺乳動物細胞侵入的蛋白質{Rosenshine，I.等，1992}； iii)阻斷哺乳動物胞外基質蛋白質和介導組織損傷的細菌蛋白質之間的細菌粘附；iv)阻斷除了通過留置裝置植入或通過其它外科技術之外的方式引起的感染中發病的進程。本文所提供的各個DNA編碼序列可用于抗菌化合物的探索和開發中。表達后的編碼蛋白質可用作抗菌藥物篩選的靶目標。此外，編碼所述編碼蛋白質氨基末端區域的DNA 序列或相應mRNA的Siine-Delgarno或其它方便翻譯的序列可用于構建反義序列以控制目的編碼序列的表達。拮抗劑和激動劑可用于，例如，抑制鏈球菌、尤其是化膿鏈球菌引起的疾病，諸如
膿毒病。另一方面，本發明涉及親和力裝置，所述的親和力裝置包括至少一種支持材料和附著在支持材料上的任一按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段。由于按照本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段對其靶細胞或靶分子或其相互作用配體的特異性，如果符合結合條件，超免疫血清反應性抗原及其片段可從加到支持物的任一種樣品中選擇性的除去它們的相互作用配體。樣品可以是生物學或醫學樣品，包括但不局限于，發酵液、細胞碎片、細胞制劑、器官制劑、血液、尿、淋巴液、流體等。超免疫血清反應性抗原及其片段可以共價或非共價方式附著于基質上。適當的支持材料是本領域技術人員所已知的且可選自纖維素、硅、玻璃、鋁、順磁珠、淀粉和右旋糖苷。通過以下圖、實施例和序列表對本發明進行了進一步的描述，其中可見更多的特征、實施方案和優勢。應理解這些實施例只是以例證方式給出而不是對內容的局限。與本發明有關
圖1顯示了化膿鏈球菌特異人血清的特性。圖2顯示了來自化膿鏈球菌SF370/M1的小片段基因組文庫LSPy-70的特性。圖3顯示了用生物素化的人IgGs通過MACS選擇細菌細胞。圖4顯示了用已確定抗原進行基因分布研究的例子。圖5顯示了用流式細胞計著色的細胞表面。圖6顯示了已確定的重組化膿鏈球菌抗原的預防用途。表1顯示了用基因組化膿鏈球菌文庫和人血清進行的所有篩選的概況。表2顯示了有關人血清的表位血清學。表3顯示了針對50個化膿鏈球菌菌株中已確定抗原的基因分布分析概況。表4總結了用于免疫接種實驗中的抗原蛋白的有關信息。表5顯示了在6個不同化膿鏈球菌菌株中抗原蛋白的可變性。
本說明書中可提及的圖詳述如下。 圖1顯示了用ELISA檢測的人血清對化膿鏈球菌的鑒定。
圖2顯示了化膿鏈球菌SF370/M1小片段基因組文庫LSPy-70的片段大小分布。測序后576個隨機選擇克隆序列被修整以消除載體殘基，并對克隆數目和多種基因組片段大小作圖。(B)化膿鏈球菌染色體上LSPy-70的同一套隨機測序克隆的分布圖解。藍圈表示在+/+方向上與所注解ORF匹配的序列。紅色矩形代表在+/+方向上與非編碼染色體序列完全匹配的克隆。綠色菱形標出了具互補性或嵌合序列的所有克隆的位置。堿基對中的數字間隔標示于各個環形基因組上用于定位。在圖的底部給出了文庫中多個克隆組分配的數目和百分比。圖3A顯示了用生物素化人IgG進行的MACS選擇。在第一輪中用10 μ g、第二輪中用1 μ g生物素化的人血清(P4-IgG)篩選pMAL9. 1中的LSPy-70文庫。作為陰性對照，在用于篩選的文庫細胞中不添加血清。針對各輪選擇均顯示了在第一和第二輪洗脫后選擇的細胞數。圖3B顯示了通過細菌表面展示根據用人血清(P4-IgG)進行的蛋白質印跡分析而分離的特異克隆(1-52)的反應性，所述人血清以1 3，000的稀釋度供MACS選擇。作為負荷對照，用1 5，000稀釋度且直接針對平臺蛋白LamB的抗體分析相同的印跡。LB，來自表達LamB且無外源肽插入的克隆的提取物。圖4A顯示了針對基因分布研究分析的化膿鏈球菌的emm類型。圖4B顯示了用相應寡核苷酸對基因Spy(^69的基因分布進行的PCR分析。預計的PCR片段的大小是 1，OOObp0 1-50，在A下列舉的化膿鏈球菌菌株；N，未加入基因組DNA ；P,來自化膿鏈球菌 SF310的基因組DNA，用作文庫構建的模板。圖5用流式細胞計進行的結合于A族鏈球菌細胞表面的特異抗體的檢測。在圖 5A中將免疫前小鼠血清和針對化膿鏈球菌裂解物產生的多克隆血清與化膿鏈球菌菌株 SF370/M1 一起溫育并用流式細胞計進行分析。對照代表二抗對化膿鏈球菌細胞表面的非特異結合水平。圖5B和5C的柱狀圖顯示分別針對兩個平臺蛋白LamB和!^huA而言與對照血清相比，由于抗-Spy0012(B)或抗_Spyl315和抗_Spyl798 (C)抗體的特異結合而使熒光增強。圖6用3個連續劑量的重組蛋白質(50yg/劑)間隔兩周分別于0、14和觀天免疫NMRI小鼠。作為陰性對照，在佐劑的存在下用PBS免疫小鼠。Ml蛋白(Spy2018)被用作陽性對照用于攻擊實驗。用5xl07個化膿鏈球菌APl細胞靜脈注射進行細菌的攻擊并對小鼠的生存狀況分別觀察A) 18天，B) 21天和C) 19天。表1 用細菌表面展示鑒定的免疫原性蛋白質。A，用 IC3-IgG(1588)鑒定的 IamB 中的 LSPy-70 文庫，B,用 IC3_IgA (1539)鑒定的IamB中的LSPy-70文庫，C，用IC6_IgG(1173)鑒定的IamB中的LSPy-70文庫，D，用 P4-IgG (1138)鑒定的 IamB 中的 LSPy-70 文庫，E，用 P4_IgA (981)鑒定的 IamB 中的 LSPy-70 文庫，F，用 IC3-IgG(991)鑒定的 btuB 中的 LSPy-150 文庫，G，用 IC6_IgG (1036)鑒定的btuB 中的 LSPy-150 文庫，H，用 P4_IgG (681)鑒定的 btuB 中的 LSPy-150 文庫，I，用 IC3_IgG (559) 鑒定的fhuA中的LSPy-400文庫，K，用IC6-IgG(543)鑒定的fhuA中的LSPy-400文庫，L， 用P4-IgGQ0)鑒定的fhuA中的LSPy-400文庫，*，長于5個氨基酸的抗原序列的預測用軟件 ANTIGENIC{Kolaskar，A.等，1990}進行。表2 關于人血清的表位血清學。顯示了代表用個別人血清選定表位的個別合成肽的免疫反應性。反應性范圍是圖案/灰色編碼；白色-(< 50U)，灰色:+(50-119U)，斜線++(120-199U)，對角交叉線 +++(200-1000U)以及垂直交叉++++( > 1000U)。在背景校正后從OD545nm的讀數和血清稀釋度計算ELISA單位(U)。得分，所有反應性的總和(所有+數目的相加)；Pl至PlO血清來自急性咽炎患者而附至NlO血清來自健康成人。P和N用作內在對照。肽名稱SP00012，注釋為ORF SpyOO 12 ；SPA0450, Spy0450選擇性讀碼框架中的潛在新ORF ；SPC0406, Spy0406互補鏈上的潛在新ORF ；SPN0001，非編碼區中的潛在新0RF。表3 化膿鏈球菌菌株中的基因分布。用特異于相應抗原編碼基因的寡核苷酸通過PCR檢測圖4A中所示的50個化膿鏈球菌菌株。對某一選定PCR片段的PCR片段進行測序以證實正確DNA片段的擴增。*，與化膿鏈球菌SF370(M1)相比菌株M89中的氨基酸替代的數目。#，因為基因不存在于M89中而用于測序的備選菌株。表4 用于NMRI小鼠中免疫接種實驗的重組蛋白質。如實驗步驟中所述用重組抗原進行免疫接種以及用致病的化膿鏈球菌APl攻擊。 A，給出了與全長蛋白質相比的用于動物免疫接種實驗的重組蛋白質中所含的相應抗原的氨基酸。B，生存率的百分比表示為保護狀態且圓括號中插入語描述了陰性對照(PBS免疫) 的保護狀態的百分比，隨后是陽性對照(Spy2018)保護狀態的百分比。C，由于盡管在觀察結束時所有小鼠都死了，但小鼠仍顯示出較好的生存狀態這一事實而選擇Spy(^69。這通過檢測如下的平均生存時間可以反映出來:14. 6 (Spy0269)U 1.6 (PBS)和19. 3天(Spy2018)。表5 來自化膿鏈球菌的抗原蛋白的序列變異。針對在實驗步驟下所列舉的6個不同化膿鏈球菌中的氨基酸交換分析抗原蛋白質。殘基編號指示該氨基酸在全長蛋白質中的位置。以Spyl666為例，列舉了相對于肺炎鏈球菌TIGR4(SP0334)中同源基因的變化，因為基因在化膿鏈球菌以及肺炎鏈球菌中是高度保守的。A，來自化膿鏈球菌SF370的蛋白質中的氨基酸殘基；B，如果不同于化膿鏈球菌 SF370，可能存在于來自另5個化膿鏈球菌菌株的任一被分析基因中的氨基酸殘基；C，催化活性中所涉及的Spy0416殘基。預期這些殘基的變化以使所述酶失活并因此在實驗上用丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸交換甘氨酸以產生酶失活的重組蛋白質。實施例實施例1 從人血清制備抗體人免疫體系產生且存在人血清中的抗A族鏈球菌抗體是抗原蛋白質體內表達及其免疫原性的的指征。這些分子是在本發明所述方法中個別抗原的鑒定所必需的，它是以特異的抗鏈球菌抗體及其相應的化膿鏈球菌肽或蛋白質之間的相互作用為基礎的。為了得到相應的抗體全部組分，從以下來源收集人血清I.急性化膿鏈球菌感染患者，諸如咽炎、傷口感染和菌血癥(通過醫學微生物學檢測顯示出化膿鏈球菌是病原體)，II.未感染的健康成人，由于A族鏈球菌感染是常見的，抗體作為天然免疫的結果存在于先前接觸了鏈球菌的個體中。用一系列ELISA和免疫印跡檢測針對抗化膿鏈球菌抗體鑒定血清。數種鏈球菌抗原已用于顯示所檢測的效價不是交叉反應抗體的總和結果。為此目的使用了兩種不同的抗原制劑從過夜培養(穩定期)于THB (Todd-Hewitt肉湯)生長培養基中的化膿鏈球菌SF370/M1中制備全細胞提取物或培養物上清蛋白質。IgG和IgA兩種抗體水平均被測定。 以針對兩種抗原制劑的總抗體滴度為基礎通過免疫印跡選擇血清以供進一步的分析。在反應為線性的給定稀釋度比較所述滴度(圖1)。將血清按針對多種鏈球菌組分的反應性進行排列，選用那些反應性最高的血清進行進一步的免疫印跡分析。此廣泛的抗體表征方法已使抗鏈球菌超免疫血清得以明確的鑒定。最近，據報道不僅是IgG，還有IgA血清抗體可被PMN的FcRlII受體識別并促進調理作用{Phillips-Quagliata，J.等，2000 ;Shibuya，Α.等，2000}。IgA 抗體的首要任務是起中和作用，主要在黏膜表面。血清IgA的水平反映了二聚體分泌IgA的質量、數量和特異性。為此原因，不只分析血清集合的抗鏈球菌IgG，還可分析其IgA水平。在ELISA檢測法中使用了高度特異的二級試劑來檢測高親和力類型的抗體，諸如IgG和IgA，而消除了 IgM。 IgM抗體的產生出現于初級適應性體液應答期間并產生了低親和力抗體，而IgG和IgA抗體已經過親和成熟且在抗擊或預防疾病中更有價值。實驗步驟肽合成用SyroII 合成儀(Multisyntech，ffitten, Germany)在 Rink 酰胺樹脂上 (PepChem, Tubingen, Germany)通過標準F-moc化學法小量合成肽(^ig樹脂，平行最多合成 288mg)。序列裝配好后，用Fmoc- ε -氨基已酸(作為接頭)和生物素(Sigma, St. Louis, MO ；象正常氨基酸一樣被激活)延伸肽。利用93% TFA、5%三乙基硅烷和2%水作用1小時將肽從樹脂上分離下來。將肽從乙腈/水(1 1)中真空干燥并凍干三次。用質譜技術在Reflex III MALDI-TOF(Bruker，Bremen Germany)上證實正確質量的存在。所述的肽直接使用而無需進一步純化。酶聯免疫檢測法(ELISA).對于血清鑒定而言用稀釋于包被緩沖液(0. IM碳酸鈉pH 9. 2)的5_10 μ g/ml 總蛋白包被ELISA平板(Maxisorb，Millipore)。在PBS-BSA中制備了三種稀釋度的血清 (2，000XU0, 000X、50, 000X)。對于肽血清學而言依照制造商的說明書以10μ g/ml的濃度將生物素標記的肽包被于鏈霉親和素ELISA平板(EXICON)上。在兩個稀釋度檢測血清，200X和1，000X。依照制造商的建議(稀釋度1，000χ)使用高特異性的辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯的抗人IgG或抗人IgA 二抗(Southern Biotech)。基于自動ELISA讀數儀(TECAN SUNRISE)中的OD4tl5nm讀數通過檢測底物(ABTS)向顯色產物的轉換從而對抗原-抗體復合物進行定量。在人工包被后，用內置讀數儀(GENI0S，TECAN)通過Gemini 160ELISA自動儀 (TECAN)對肽平板進行處理和分析。免疫印跡法從體外培養的化膿鏈球菌SF370/M1中制備總細菌裂解產物和培養物上清樣品。 用BioRad Mini-Protean 3 Cell電泳體系通過SDS-PAGE分離10-25 μ g總蛋白/泳道并將蛋白質轉到硝酸纖維素膜(ECL，AmerSham Pharmacia)上。在5%的牛奶中過夜封閉后， 加入2，OOOx倍稀釋的抗血清，并將HRPO標記的抗小鼠IgG用于檢測。細菌抗原提取物的制備總細菌裂解產物重復凍融裂解細菌溫育于干冰/乙醇混合物中直至凍結(1分
54鐘)，然后融解于37°C (5分鐘)；重復3次。隨后超聲波降解并離心收集上清(3，500rpm, 15 分鐘，4°C )。培養物上清液除去細菌后，用冰冷的乙醇(100% )沉淀過夜培養的細菌培養物上清液1份上清液/3份乙醇于-20°c放置過夜。離心收集沉淀(2，600g, 15分鐘)并干燥。將干的沉淀或者溶解于PBS以備ELISA，或者溶解于尿素和SDS樣品緩沖液中以備 SDS-PAGE和免疫印跡。用Bradford檢測法檢測樣品的蛋白質濃度。純化抗體以備基因組篩選。基于篩選步驟中所用血清集合的總抗鏈球菌滴度選擇來自患者以及未感染組的5份血清。通過將熱滅活血清與所有樣品中的大腸桿菌細胞 φΗδα，用pHIEll轉化，在與細菌表面展示同樣的條件下培養)一起保溫去除抗大腸桿菌蛋白質的抗體。依照制造商的說明書(UltraLink Immobilized Protein G，Pierce)通過蛋白G親和層析從收集的缺乏血清中產生高度富集的IgG制品。IgA抗體也是通過親和層析利用固定于鏈霉親和素-瓊脂糖(GIBCO BRL)上的生物素標記抗人IgA(Southern Biotech) 進行純化。通過SDS-PAGE、蛋白質印跡、ELISA和蛋白質濃度檢測檢查缺失和純化的效率。實施例2 化膿鏈球菌的高度隨機且框架選定的小片段基因組DNA文庫的產生實驗步驟鏈球菌基因組DNA的制備。將化膿鏈球菌SF370/M1從凍存穿刺斜面接種于50ml Todd-Hewitt Broth培養基中并在37°C通風振蕩培養18小時。然后收獲培養基，1，600x g離心15分鐘去上清。細菌沉淀用PBS洗3次并小心重懸于0. 5ml溶菌酶溶液(IOOmg/ ml)中。加入0. Iml的10mg/ml熱處理RNase A和20U的RNase Tl，小心混和并將此溶液在37°C保溫1小時。加入0.2ml的20 % SDS溶液和0. Iml的蛋白酶K(10mg/ml)后將此試管在55°C保溫過夜。然后加入1/3體積的飽和NaCl并將該溶液在4°C保溫20分鐘。在微量離心管中沉淀提取物(13，OOOrpm)并將上清轉移至一新的試管中。用Wi0H/CHC13/ IAA (25 24 1)和CHC13/IAAQ4 1)抽提該溶液。加入0. 6倍體積的異丙醇室溫沉淀 DNA，用消毒的巴斯德移液管從所述溶液中將DNA纏繞在上面并轉移入含80%冰凍乙醇的試管中。10-12，OOOx g離心沉淀回收DNA，然后空氣干燥并溶于ddH20中。小基因組DNA片段的制備。將基因組DNA片段用杯狀鉆頭狀超聲波儀(裝備了 BB5 杯狀鉆頭的Bandelin Sonoplus UV 2200超聲波儀，10秒脈沖，100%功率輸出)機械切割成大小150_300bp之間的片段或通過溫和的DNase I處理(Novagen)切割成大小50_70bp 范圍內的片段。可觀察到當將DNA斷裂成150-300bp大小范圍內的片段時，超聲波降解法產生了密集得多的片段大小分布。不過，盡管DNA廣泛暴露于超聲波誘導的流體力學剪切力中，并不能同時有效和重復的達到減小片段大小的目的。因此，50-70bp大小的片段通過溫和的DNase I處理利用Novagen的鳥槍裂解試劑盒獲得。制備試劑盒所提供的DNaseI 的1 20稀釋液并在MnCl2存在的條件下于60 μ 1的體積中在20°C消化5分鐘以保證雙鏈都被酶所切割。用2ul的0. 5M EDTA終止反應且在2% TAE-瓊脂糖凝膠上評估片段化效率。此處理導致基因組DNA全部斷裂成近似50-70bp的片段。然后在各種dNTP各100 μ M 存在的條件下用T4DNA聚合酶將片段末端補平以保證末端的有效對齊。片段可立即用于連接反應或凍存于_20°C備用。載體的描述。在pASK-IBA主鏈{Skerra，A.，1994}上構建載體pMAL4. 31，用β -內酰胺酶(bla)基因調換卡那霉素抗性基因。此外將bla基因克隆入多克隆位點。編碼成熟β -內酰胺酶的序列之前有ompA的前導序列以使其能有效分泌穿過細胞質膜。而且編碼成熟β -內酰胺酶的頭12個氨基酸的序列(間隔序列)接著ompA前導肽序列之后以避免序列直接在前導肽酶切割位點之后融合，因為，例如，此區域的正電荷氨基酸簇會減少或完全破壞穿越細胞質膜的遷移{KajaVa，A.等，2000}。SmaI限制性位點是用于文庫插入的。用于回收選定片段的上游FseI位點和下游NotI位點在SmaI位點兩側。所述的三個限制性位點在編碼所述的12個氨基酸間隔序列的序列之后插入，插入方式是bla基因轉錄于-1 閱讀框架，導致在NotI位點之后15bp產生了一個終止密碼子。+Ibp插入恢復了 bla ORF 從而產生了 β內酰胺酶蛋白并隨之獲得了氨芐青霉素抗性。通過將IamB基因克隆入pEHl的多克隆位點構建載體 pMAL9. l{Hashemzadeh-Bonehi, L.等，1998}。隨后，在第巧4位氨基酸之后將含限制位點 FseI、SmaI和NotI的序列插入IamB中。此插入的閱讀框架以此方式構建，即，通過用FseI 和NotI消化從質粒pMAL4. 31切下框架選定的DNA片段進行轉移產生了 IamB的連續閱讀框架以及各自的插入片段。通過將btuB基因克隆入pEHl的多克隆位點構建載體pMALlO. 1。隨后，在第236 位氨基酸之后將含限制位點FseIJbaI和NotI的序列插入btuB中。此插入的閱讀框架以此方式構建，即，通過用FseI和NotI消化從質粒pMAL4. 31切下框架選定的DNA片段進行轉移產生了 btuB的連續閱讀框架以及各自的插入片段。通過將fhuA基因克隆入pEHl的多克隆位點構建載體pHIEll。隨后，在第405位氨基酸之后將含限制位點FseIJbaI和NotI的序列插入fhuA中。此插入的閱讀框架以此方式選擇，即，通過用FseI和NotI消化從質粒pMAL4. 31切下框架選定的DNA片段進行轉移產生了 fhuA的連續閱讀框架以及各自的插入片段。有關框架選擇的文庫克隆和評估。將化膿鏈球菌基因組DNA片段在SmaI位點連接入載體PMAL4. 31中。使重組DNA通過電穿孔進入DHlOB電感受態大腸桿菌細胞(GIBC0 BRL)并將轉化子鋪于補充了卡那霉素(50μ g/ml)和氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB瓊脂上。 平板在37°C保溫過夜并收集菌落供大量提取DNA。貯藏并保留一個有代表性的平板以便收集菌落供菌落PCR分析和大規模測序。最初用簡單菌落PCR檢測確定大致的片段大小分布以及插入效率。結合插入位點的完整性以及框架選擇的精確性(3n+l準則)從測序資料評估片段的大小。有關細菌表面展示的文庫克隆和評估。用限制性酶FseI和NotI WpMAIA 31載體上切下含化膿鏈球菌文庫的基因組DNA片段。然后將全部片段群轉移入已用FseI和NotI 消化的質粒 PMAL9. 1 (LamB)、pMAL10. 1 (BtuB)或 pHIEll (FhuA)。利用這兩種識別 8bp 富 GC 序列的限制性酶，在各個平臺載體中保持PMAL4. 31載體中選定的閱讀框架。然后通過電穿孔將所述質粒文庫轉化入大腸桿菌DH5 α細胞中。細胞鋪于補充了 50 μ g/ml卡那霉素的大LB瓊脂平板上并以產生清晰可見單菌落的密度在37°C培養過夜。然后將細胞從這些平板表面刮下，用新鮮LB培養基漂洗并以等份試樣貯存于-80°C以備文庫篩選。結果用于框架選擇的文庫。在pMAL4. 31載體中產生了大小分別約為70、150* 300bp 的三個文庫(LSPy70、LSPyl50和LSPy300)。對于每個文庫而言，大約1 μ g pMAL4. 31質粒 DNA和50ng片段化的基因組化膿鏈球菌DNA的連接和隨后的轉化在框架選擇后產生了虹105-2x IO6個克隆。為了評估文庫的隨機性，對大約600個隨機選擇的LSPy70克隆進行測序。生物信息分析顯示這些克隆中只有極少的克隆出現了一次以上。此外，還顯示出90% 的克隆大小落在大小16-61bp之間的范圍內，平均大小為34bp (圖2)。所有序列遵從3n+l 原則，顯示出所有克隆均為正確的框架選擇。細菌表面展示文庫。大腸桿菌表面的肽展示要求將來自LSPy文庫的插入片段從框架選擇載體PMAL4. 31轉移至展示質粒pMAL9. 1 (LamB)、pMALlO. 1 (BtuB)或 pHIEll (FhuA)。用FseI和NotI限制酶切割基因組DNA片段并將5ng插入片段與0. 1 μ g 質粒DNA連接并隨后轉化入DH5 α細胞，產生2- IO6個克隆。將克隆從LB平板上刮下并凍存而無需進一步擴增。實施例3 用細菌表面展示基因文庫和人血清鑒定來自化膿鏈球菌的高免疫原性肽序列實驗步驟MACS篩選.將來自給定文庫的約2. 5x IO8個細胞在補充了 50 μ g/ml卡那霉素的 5ml LB培養基中于37°C培養2小時。通過加入ImM IPTG 30分鐘誘導表達。用新鮮的LB培養基漂洗細胞兩次并將大約h IO7個細胞重懸于100 μ 1 LB培養基中并轉移至Eppendorf管中。將純化自血清的10 μ g生物素化人IgG加入細胞中并將此懸浮液在4°C溫和搖動保溫過夜。加入900 μ 1 LB培養基，將懸浮液混和并隨后在4°C 6，OOOrpm離心10分鐘(對于IgA篩選而言，使用了 10 μ g的純化IgA并用生物素化的抗人IgG 二抗捕捉它們)。用 Iml LB漂洗細胞一次，然后重懸于100 μ 1 LB培養基中。加入與鏈霉親和素偶聯的MACS微珠(Miltenyi Biotech,Germany) 10 μ 1并在4°C繼續保溫20分鐘。之后加入900 μ 1 LB培養基并將MACS微珠細胞懸浮液加到固定于磁鐵上且已平衡好的MS柱(Miltenyi Biotech, Germany)上。(所述MS柱通過用Iml 70%乙醇洗滌一次和^iil LB培養基洗滌兩次被平衡。)然后用:3ml LB培養基洗柱三次。去除磁鐵后，用^iil LB培養基洗脫細胞。用3ml LB培養基洗柱后，將2ml洗脫液再次加到同一根柱子上并重復洗脫步驟。第三次進行上樣、 洗滌和洗脫操作，產生最終的洗脫液加1。第二輪篩選進行如下。離心收集最終的洗脫液中的細胞并重懸于補充了 50 μ g/ml 卡那霉素的Iml LB培養基中。將培養基在37°C保溫90分鐘然后用ImM IPTG誘導30分鐘。隨后收集細胞，用Iml LB培養基洗滌一次并重懸于10 μ 1 LB培養基中。由于體積減少，加入1 μ g生物素化的人IgG并在懸浮液在4°C溫和搖動保溫過夜。所有其它步驟完全與第一輪篩選相同。將兩輪篩選后的細胞鋪于補充有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上并于37°C培養過夜。通過測序和蛋白質印跡分析評估選定的克隆.將選定的克隆在37°C于補充有50 μ g/ml卡那霉素的:3ml LB培養基中培養過夜以便用標準方法制備質粒DNA。在 MWG(Germany)或與 TIGR (U. S. A.)協作完成測序。為了進行蛋白質印跡分析，用10% SDS-PAGE分離大約10_20 μ g總細胞蛋白并印 HybondC II (Amersham Pharmacia Biotech, England) ±。 ffit^J 1 5，000 ##的入
血清作為一抗和1 5，000稀釋的偶聯至HRP的抗人IgG或IgA抗體作為二抗檢測LamB、BtuB 或 FhuA 融合蛋白。用 ECL 檢測試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech, England)完成檢測。或者，用兔抗i^huA或小鼠抗LamB抗體作為一抗與偶聯至HRP的相應二抗聯合檢測融合蛋白。結果使用生物素化的Igs通過磁性活化細胞分選術(MACQ篩選細菌表面展示文庫。 用來自患者血清或健康人血清的生物素化人IgG和IgA集合篩選pMAL9. 1中的LSPy70、 pMALlO. 1中的LSPyl50和pHIEll中的LSPy300 (參閱實施例1 從人血清制備抗體)。如下實驗流程所述完成選擇步驟。圖3A顯示了用LSPy-70文庫和P4_IgG進行篩選的一個代表性的例子。正如從MACS篩選的第一輪選擇后的菌落數中可見的，最終回收到的細胞總數從 3x IO7個細胞急劇下降到大約切IO4個細胞，而不加入抗體進行的選擇則顯示下降到大約 hio3個細胞(圖3A)。第二輪選擇后，用P4-IgG回收到相似數目的細胞，而當不加入來自人血清的IgG時回收到的細胞少于10個，清楚的證明了選擇依賴于化膿鏈球菌特異抗體。 為了評估篩選的效果，隨機挑選大約50個選定的克隆并用相同的集合的血清進行蛋白質印跡分析(圖3B)。此分析表明70%的選定克隆顯示出對存在于相關血清中的抗體的反應性而表達LamB且無化膿鏈球菌特異性插入片段的對照菌株則不與同一種血清反應。通常， 觀察到的反應比例在35-75%范圍內。菌落PCR分析顯示所有的選定克隆都含有預期大小范圍內的插入片段。隨后對大量隨機挑選的克隆(每次篩選600-1200個克隆)進行測序，鑒定用于篩選的人血清所特異識別的基因和相應的肽或蛋白質序列。特異克隆被選擇的頻率至少在部分程度上反映了用于選擇的血清中識別該克隆所呈遞表位的特異抗體的豐度和/或親和力。在這點上令人吃驚的是，來自某些ORF(例如Spy0433、Spy2025)的克隆被選擇次數超過80次，證明了它們的高度免疫原性特性。表1總結了獲自所有15個已完成篩選的資料。 表1中的所有克隆已通過蛋白質印跡分析用來自單個克隆的全細胞提取物來顯示與各個篩選中所用人血清集合的指征反應性而得以證實。正如從表1中可見的，已鑒定ORF的單獨區域被識別為是免疫原性的，因為大小不定的蛋白質片段通過平臺蛋白質展示其表面。更值得關注的是，通過細菌表面展示篩選所鑒定的大部分基因編碼附著于化膿鏈球菌表面和/或被分泌的蛋白質。這與化膿鏈球菌毒性中表面附著或分泌蛋白質的預期任務是一致的。實施例4 高度免疫原性肽序列對個體人血清的反應性的評估。分析中包括大約100名患者和60名健康成人。在選定克隆的生物信息分析之后， 設計并合成相應的肽。如果表位長度超過觀個氨基酸殘基，就制備重疊肽。用N末端生物素標簽合成所有的肽并將其用作鏈霉親和素包被ELISA平板上的包被試劑。分析分兩步進行。首先，基于它們對個別血清的反應性選擇肽，所述個別血清包括在用于制備供細菌表面展示的IgG和IgA篩選試劑的血清集合內(5個個體血清)。未呈現陽性反應的肽不包括在進一步更詳細的試驗中。其次，針對顯示出對篩選血清具有特異的高反應性的肽檢測來自急性咽炎患者或鏈球菌感染后疾病患者或來自健康成人和兒童的大量非預定個體血清。通過ELISA檢測抗體水平并通過基于陽性血清數目和反應性程度計算的各肽得分進行比較。表2顯示了代表來自20份人血清(代表5種血清的4個不同集合)的化膿鏈球菌表位的174個肽的血清反應性用于抗原鑒定的實例。所述的肽的范圍包括高度反應性和廣泛反應性的肽至弱陽性的肽。在最具有反應性的肽中包括已知的抗原， 其中一些還在有關鼻咽攜帶的動物攻擊模型中起保護作用(如Cfe肽酶和M蛋白)。實施例5 用鑒定自化膿鏈球菌的高度免疫原性蛋白質進行的基因分布研究。通過PCR進行A族鏈球菌抗原的基因分布研究。理想的疫苗抗原應是存在于該疫苗所定向的所有或絕大部分靶生物體株系內的抗原。為了確定編碼已鑒定的化膿鏈球菌抗原是否廣泛存在于化膿鏈球菌菌株內，用特異于目的基因的引物對一系列獨立的化膿鏈球菌分離株進行PCR。如圖4A中所示，所獲得的化膿鏈球菌覆蓋了最頻繁出現于患者中的 emm類型。如果有可能覆蓋所有的已鑒定免疫原性表位，就針對所有已鑒定的ORF設計作為引物的寡核苷酸序列，產生的產物大約為l，000bp。如實施例2中所述制備所有的化膿鏈球菌菌株的基因組DNA。按制造商的說明書(Invitrogen，The Netherlands)用Taq聚合酶(IU)、200nM dNTPs、寡核苷酸各IOpMol和試劑盒在25 μ 1反應體積內進行PCR。作為標準，進行30個循環(Ix 5分鐘，95°C，30x :30秒95°C，30秒56°C，30秒72°C，Ix 4分鐘.720C )，除非條件需修改以適合個別引物對。結果用PCR檢測編碼免疫原性蛋白質的所有已鑒定基因是否存在于50個不同的化膿鏈球菌菌株中(圖4A)。例如，圖4B顯示了對于Spy0269而言所有指定50個菌株的PCR反應。正如明顯可見的，基因存在于所有被分析的菌株中。對來自第8號菌株(M89)的PCR 片段進行測序顯示，與化膿鏈球菌Ml菌株SF310相比，917bp中只有2bp是不同的，導致這兩個分離株中只有一個氨基酸的差異。在總共96個被分析基因中，有70個存在于所有被測試的菌株中，而22個基因在被測試的50個菌株中的10個以上菌株中缺乏(表幻。數個基因(Spy0433、Spy0681)顯示出大小的差異且不存在于所有的分離菌株。某些基因顯示出了大小的變化，但卻不同的保存于所有的被測試菌株中(如Spyl371)。對某一菌株的PCR片段進行測序并隨后與Ml 菌株比較證實了 DNA片段的正確擴增并顯示了表3中所指出的序列差異程度。重要的是， 所有的已鑒定抗原的序列和大小在所有菌株中都是很保守的且因此是預防A族鏈球菌感染的新候選疫苗。實施例6 從來自化膿鏈球菌并展示于大腸桿菌表面的高度免疫原性蛋白質/肽所免疫的小鼠中獲得的免疫血清的鑒定。從小鼠中產生免疫血清將含有編碼與化膿鏈球菌肽融合的平臺蛋白的質粒的大腸桿菌克隆在補充有 5(^8/!111卡那霉素的1^培養基中于371培養。1 10稀釋過夜培養物，培養至0D_為 0. 5并用0. 2mM IPTG誘導2小時。將細菌細胞沉淀懸浮于PBS緩沖液中并在冰上通過超聲波降解法分解，產生了粗細胞提取物。根據0D_檢測值，將相當于切107個細胞的等分試樣靜脈注射入NMRI小鼠中，2周后加強免疫一次。第二次注射1周后提取血清。通過肽 ELISA檢測表位特異的抗體水平。抗原的體外表達通過免疫印跡檢測體外培養的化膿鏈球菌SF370/M1的抗原表達。測試不同的生長培養基和培養條件以便檢測總裂解產物和細菌培養上清液中抗原的存在。當檢測到相當于預計分子量和電泳遷移率的特殊條帶時認為表達被證實了。
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細胞表面染色流式細胞術分析進行如下。細菌在根據免疫印跡顯示導致抗原表達的培養條件下生長。細胞在Hanks平衡鹽溶液(HBSQ中漂洗兩次并將細胞密度調整到IOOul HBSS，0. 5% BSA中大約為IX 106CFU。與50-100倍稀釋的抗血清一起在4°C保溫30-60分鐘后，在過量 HBSS，0.5%BSA中離心洗去未結合抗體。將用熒光素(FITC)特異標記的山羊抗小鼠二抗 (F(ab' )2片段與細胞一起在4°C保溫30-60分鐘。漂洗細胞后，用2%多聚甲醛固定抗體。 用Becton Dickinson FACScan流式細胞儀檢測被結合的抗體并用計算機軟件CELLQuest 進一步分析數據。對照血清包括小鼠免疫前血清和用制備自IPTG誘導的大腸桿菌細胞的裂解產物產生的小鼠多克隆血清，所述大腸桿菌是用編碼基因IamB或fhuA且無化膿鏈球菌基因組插入片段的質粒轉化的。調理噬菌作用檢測在以FACS為基礎的檢測法中檢測表位特異免疫血清誘發調理噬菌作用的活性。 血清被熱滅活，然后通過與完整的大腸桿菌細胞(3x) —起保溫去除抗大腸桿菌抗體。在 2-10%免疫血清存在且以2%倉鼠血清作為補充來源的條件下預調理IO7個Alexa 488標記的化膿鏈球菌細胞，然后加入IO6個噬菌細胞(RAWM6.7或P388.D1小鼠單核細胞系) 中。將細胞混合物在37°C保溫30分鐘。時間、IgG濃度和細菌的補體依賴型吸收表現為用熒光活化細胞分選器檢測的噬菌細胞的平均熒光強度。殺菌(處死)試驗將小鼠巨噬細胞(RAWM6.7或P388.D1)和細菌保溫并通過菌落計數測定60分鐘后可生存細菌的損失。簡而言之，細菌用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗兩次并將細胞密度調整到50 μ 1 HBSS中大約IX 105CFU。將細菌與小鼠血清(高達25% )和豚鼠補體(高達5%)以總體積ΙΟΟμΙ于4°C保溫60分鐘。將預調理的細菌與巨噬細胞(小鼠細胞系 RAW264. 7或P388. Dl ；每100 μ 1 2Χ IO6個細胞)以1 20的比例混合并于37°C旋轉搖床上500rpm保溫。將各樣品的等分試樣稀釋于無菌水中并室溫保溫5分鐘以裂解巨噬細胞。然后將系列稀釋液鋪到Todd-Hewitt Broth瓊脂平板上。將平板在37°C保溫過夜，并用Coimtermat閃射計數器(IUL Instruments)對菌落進行計數。對照血清包括小鼠免疫前血清和用制備自IPTG誘導的大腸桿菌的裂解產物產生的小鼠多克隆血清，所述大腸桿菌是用含有基因IamB或fhuA而無化膿鏈球菌基因組插入片段的質粒轉化的。結果體外表達和細胞表面染色。通過利用所培養的抗大腸桿菌克隆的血清在體外分析化膿鏈球菌SF370/M1中的抗原蛋白質的表達，所述大腸桿菌克隆含有編碼與化膿鏈球菌肽融合的平臺蛋白的質粒。為了通過FACS分析評估多肽的表面表達，將此分析作為測定蛋白質是否完全表達的第一步。預期不是所有的蛋白質都會在體外條件下表達的，但利用蛋白質印跡分析在全部細胞裂解物中檢測到了數種蛋白質(例如Spy0012、Spy0112、 Spy0416、Spy0437、Spy0872、Spyl032、Spyl315、Spyl798 ；數據未顯示)。隨后用基于流式細胞術的檢測法證實了數種抗原蛋白質的細胞表面可接觸性。將鏈球菌與免疫前的和抗化膿鏈球菌裂解產物或大腸桿菌克隆的多克隆小鼠血清一起保溫，所述大腸桿菌克隆含有與化膿鏈球菌肽融合的平臺蛋白的編碼質粒，然后用熒光素標記二抗進行檢測。如圖5A中所示，針對化膿鏈球菌裂解產物培養的抗血清引起了化膿鏈球菌SF370/M1細胞群熒光的漂移。用針對抗原Spy0012(圖5B)、Spyl315和Spyl798(圖5C)的肽培養的多克隆血清觀察到化膿鏈球菌SF370/M1細胞的相似細胞表面染色，盡管只有該細菌的一個亞群被染色，正如用兩個峰的檢測所指出的。這一現象可能是細菌生長期間基因產物分化表達或由其它表面分子引起的抗體結合的部分抑制作用的結果。這些實驗證實了生物信息的預測，S卩，這些蛋白質由于其信號肽序列而被輸出且還顯示出它們錨定于化膿鏈球菌SF370/M1的細胞表面。它們還證實了這些蛋白質可被人抗體識別并使它們成為抗A族鏈球菌疾病疫苗開發的有價值候選分子。實施例7 基于重組抗原免疫接種的抗A族鏈球菌感染的保護性免疫應答。實驗步驟編碼抗原蛋白質的基因的克隆用基因特異引物通過PCR擴增反應擴增來自化膿鏈球菌SF370基因組DNA的目的基因或DNA片段。除了基因特異序列之外，引物在5’端含有由限制性位點組成幫助擴增的PCR產物定向克隆的額外堿基。引物的基因特異序列長度范圍在15-M個堿基之間。所包含的PCR產物用適當的限制性酶消化并克隆入適當的已消化pET28b(+)載體 (N0VAGEN)中。重組質粒的構建被證實后，轉化用作表達宿主的大腸桿菌BL21 STAR 細胞 (INVITR0GEN)。將這些細胞最優化以有效表達pET28b質粒所編碼的目的基因。大腸桿菌中的抗原表達將含重組質粒的大腸桿菌BL21 STAR 細胞在補充有50 μ g/ml卡那霉素的LB培養基中37°C培養至對數期。一旦OD6tltlnm達到0. 8，培養物用ImM IPTG在37°C誘導3小時。 離心收獲這些細胞，通過凍融方法及隨后通過用來自N0VAGEN的Bug-buster 試劑破壞細胞聯合裂解細菌。裂解產物通過離心分離成可溶性(上清液)和不溶性(沉淀)部分。來自大腸桿菌的重組蛋白質的純化根據蛋白質的定位，采取不同的純化策略。通過在細胞被破壞后將細胞裂解產物的上清液與鎳-瓊脂糖珠(Ni-NTA-Agarose , QIAGEN)結合來純化可溶性組分里的蛋白質。由于在被表達蛋白質的C末端、N末端或兩個末端都存在的五組氨酸(HIS)，所述蛋白質與鎳-瓊脂糖結合而其它雜質蛋白質通過洗滌緩沖液從柱子上洗去和清除掉。用含有溶于適當緩沖液中的IOOmM咪唑的溶液洗脫所述蛋白質。濃縮洗脫液，用Bradford檢測蛋白質濃度并通過SDS-PAGE和蛋白質印跡法進行分析。通過沉淀在含8M尿素的適當緩沖液中的增溶作用純化不溶性部分的蛋白質。在用同一材料變性的條件下(在含8M尿素的緩沖液中)進行純化，步驟與上述針對可溶性蛋白質的步驟一樣。濃縮洗脫液并以漸進或逐步的方式透析除去所有尿素。濃縮最終的蛋白質溶液，通過SDS-PAGE進行分析并用Bradford 方法進行檢測。當檢測到相當于預計分子量和電泳遷移率的特異條帶時認為表達得以證實。對于在透析階段由于變性試劑尿素的去除而沉淀的蛋白質而言，可將不溶性包含體漂洗數次并直接用于小鼠的免疫接種。用重組蛋白質免疫NMRI小鼠并用化膿鏈球菌APl攻擊利用NMRI小鼠和作為感染試劑的化膿鏈球菌菌株APl在實驗動物模型中檢測蛋白質的免疫原性。用50 μ g/劑的重組蛋白質每2周免疫一次7-8周大的雌性NMRI小鼠，總共3次。最初施用的劑量以完全弗氏佐劑輔助，而余下的兩劑用不完全弗氏佐劑輔助。免疫接種結束后將小鼠放血以檢查抗體效價，隨后靜脈注射(i.v.)致死劑量的化膿鏈球菌API (5x IO7個致病菌)激發免疫。在激發免疫后對小鼠的生存狀況記錄18-21天。結果重組蛋白質的表達和純化在選定用于重組蛋白質表達的31種蛋白質之中，四種蛋白質在大腸桿菌中產生的水平可足以純化。而某些蛋白質可作為可溶性蛋白質產生(見表4)，某些蛋白質轉變成不溶性的(如Spy416B、Spy0872)或由于透析而沉淀，它們在諸如Spy0031、Spy0292,Spy720 等不溶性蛋白質的增溶作用后試圖去除變性試劑尿素。在這些情形中被漂洗的包含體直接被注射入小鼠中進行免疫接種。通常，親和純化產生了至少85%純度的重組蛋白質制劑。在NMRI小鼠中用重組蛋白質免疫后的免疫應答表4列舉了那些抗原，它們在小鼠中被測試并在實驗動物內顯示出某種程度的保護作用。同樣在動物菌血癥模型中檢測到但在所述實驗中未顯示出任何水平的保護作用的重組蛋白質在此未列舉，但包括諸如Spy0012、Spyl063和Spyl494等蛋白質。當致病細菌被直接注射入血液中時，上述菌血癥模型評估了針對入侵疾病的候選疫苗的保護性意義。所誘導抗體能起到針對所述A族鏈球菌感染的保護作用的重組蛋白質被認為是用于研發抗A 族鏈球菌疾病的疫苗的有價值候選分子。與先前顯示出提供了針對化膿鏈球菌攻擊的保護作用的陽性對照Spy2018(Ml蛋白)相比較而言，在18-21天后(表4)評估激發實驗的終點時許多抗原表現出相似程度的保護作用(Spy0416、Spyl607或Spy(^92)。其它的蛋白質只顯示出部分的保護效果(Spy0720、Spy0872)，但當與其它抗原聯合時可被證實非常有效 (圖 6)。令人吃驚的是，抗原篩選已鑒定了主要在兩種較大蛋白質Spy0416和Spyl972前半部分的免疫原性表位。因此可推斷保護區還可能包含于蛋白質的N末端部分。以Spy0416 為例，抗原的兩部分都作為重組蛋白質(Spy0416A和Spy0416B ；見表4)產生并測試于動物實驗中。實驗顯示在動物模型中只有蛋白質Spy0416(表4;Spy0416A)的前半部分提供了保護作用，而蛋白質的后半部分(Spy0416B)根本無保護效果，明顯勾畫出作為候選疫苗的是蛋白質內的較小區域。對于抗原Spyl972而言，只有全長蛋白質的前半部分被作為重組蛋白質產生并在動物模型中進行測試。實施例8 編碼多種血清型化膿鏈球菌中抗原蛋白質的基因的可變性實驗步驟PCR片段的測序和生物信息學分析化膿鏈球菌菌株的PCR分析參閱實施例5。PCR片段的測序提供了對基因可變性的一個估計，結果概述于表3中。來自五種化膿鏈球菌菌株(SF370 =Ml ；MGAS8232 :M18 ； SSI-I :M3 ；MGAS315 :M3 ；Manfredo :M5)的基因組序列的可用性使得我們可以進一步的評估所述抗原的可變性。將所有序列與來自化膿鏈球菌SF370的相應抗原序列和經鑒定不同于化膿鏈球菌SF370抗原蛋白質氨基酸殘基的那些氨基酸殘基進行序列比對。在某些抗原蛋白質中檢測到了插入或缺失序列，但不包括在此分析中。結果表5顯示了經鑒定在四種化膿鏈球菌菌株(MGAS8232 :M18 ；SSI-I :M3 ；MGAS315 M3 ；Manfredo :M5)之一或用于PCR擴增片段測序的菌株(見表3)中指定的抗原內可變的所有位置。生物信息分析顯示，一些抗原蛋白質非常保守，在6種血清型株系Ml、M3、M5、M18和M89中的任一種都無單一氨基酸交換。屬于此類的蛋白質包括Spy0103和Spyl536，而在較大蛋白質內的其它抗原蛋白質中的交換數目比在較小蛋白質內的要大，正如從其大小差異所預期的一樣。盡管分析了各種菌株，但幾乎從未觀察到單個殘基在其它菌株中被改變成一個以上的其它氨基酸。對更大數目不同血清型菌株中相應基因序列、臨床指征或地理定位的進一步分析可肯定地確認在所列舉的那些氨基酸殘基或另外的殘基中可能發生的變化。通過6個基因序列比對分析的抗原蛋白質中只有一個顯示出大小有相當程度的變化(Spyl!357 :SF370_217 氨基酸；MGAS8232-245 氨基酸；SSI_1_3^ 氨基酸；MGAS315_3^ 氨基酸；Manfredo-279氨基酸)。因此顯而易見，大部分被評估的抗原在序列以及大小上是非常保守的，且為疫苗研發提供了有希望的候選對象。參考文獻Altschul, S.，等(1990). Tournal of Molecular Biology 215 :403-10.Bennett, D.，等(1995). T Mol Recognit 8 :52-8.Bessen, D.，等(1988). Infect Immun 56 :2666-2672.Bisno,Α.，等(1987) · Infect Immun 55 :753-7.Bronze, Μ.，等(1988). T Immunol 141 :2767-2770.Clackson, Τ.，等(1991). Nature 352 :624-8.Cone, L.，等(1987). New Engl T Med 317 146-9.Cunningham, Μ. (2000). Clin Microbiol Rev 13:470—511.Devereux, J.，等(1984). Nucleic acids research 12 :387-95.Doherty, E.，等。001) · Annu Rev Biophys Biomol Struct 30 :457-475.Eisenbraun，M.，等(1993). DNA Cell Biol 12 :791-7.Enright M.，等(2001) Inf. Immun. 69 :2416-27Etz, H.，等 QOOl). J Bacteriol 183 :6924-35.Fenderson, P.，等(1989). J Immunol 142 :2475-2481.Fischetti, V. (1989). Clin Microbiol Rev 2 :285-314.Ganz, T. (1999). Science 286 :420-421.Georgiou, G. (1997). Nature BiotechnoloRY 15 :29-34.Guzman, C.，等(1999). J Infect Dis 179 :901-6.Hashemzadeh-Bonehi，L.，等(1998). Mol Microbiol 30 :676-678.Heinje, von G, (1987) e. g.分子生物學中的序列分析 Sequence Analysis in Molecular Biology, Acedimic Press Hemmer, B.，等(1999). Nat Med 5 :1375-82.Hoe N.，等(2001).1. Inf. Pis. 183 :633-9Hope-Simpson, R. (1981). J Hyr(Lond)87 :109-29.Ji，Y·，等(1997). Infect Immun 65:2080-2087·Johanson, K.，等(1995). J Biol Chem 270 :9459-71.Jones, P.，等(1986). Nature 321 :522-5.Kaiava, A.，等(2000) · J Bacteriol 182:2163-9.
Kohler，G.，等(1975). Nature 256 :495-7.Kolaskar,Α.，等(1990). FEBS Lett 276 172-4.Lee, P. K. (1989). T Clin Microbiol 27 :1890-2.Lewin，A·，等(2001). Trends Mol Med 7 :221-8.Marks, J.，等(1992). Biotechnology(N Y) 10 :779-83.McCafferty,J.，等(1990). Nature 348 :552-4.Okano, H.，等(1991). T Neurochem 56 :560-7.作為基因表達反義抑制物的寡脫氧核苷酸Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ；CRC Press, Boca Ration, FL(1988)用來描述這些分子Phillips-Quagliata, J.，等(2000). T Immunol 165 :2544-55.Rammensee, H.，等(1999). Immunogenetics 50 :213-9.Rosenshine, I.，等(1992). Infect Immun 60 :2211-7.Seeger, C.，等(1984). Proc Natl Acad Sci U S A 81 :5849-52.Shibuya, A.,等(2000). Nature Immunology 1 :441-6.Skerra, A. (1994). Gene 151 :131-5.Stevens, D. (1992). Clin Infect Dis 14 :2-11.Tang, D.，等(1992). Nature 356 :152-4.Tempest, P.，等(1991). Biotechnology(N Y)9 :266-71.Tourdot, S.，等(2000). Eur T Immunol 30 :3411-21.ffhitnack, Ε.，等(1985). J Exp Med 162 1983-97.Wiley, J. (1987)Current Protocols in Molecular BiologyVitali, L.，等(2002) Τ· Clin. Microbiol 40 :679-681表1 :通過細菌表面展示鑒定的免疫原性蛋白質
權利要求
1.一種用于治療或預防化膿鏈球菌(S. pyogenes)感染的藥物組合物，其包含至少一種抗原并且任選地包含藥用載體或賦形劑，所述抗原是一種超免疫血清反應性化膿鏈球菌抗原，其與來自具有化膿鏈球菌感染的人的血清具有免疫反應性，所述抗原包含分離的化膿鏈球菌肽片段，其中所述肽片段由kq ID No 166的氨基酸序列4-20、22-46、49-70、 80-89、96-103、105-119、123-129、153-160、181-223、227-233、236-243、248-255、261-269、 274-279、283-299、305-313、315-332、339-344、349-362、365-373、380-388、391-397、 402-407,1-48,25-48 或 22-410 組成。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述肽片段由kqID Nol66的氨基酸序列 22-410組成并且在免疫接種后引發對A族鏈球菌感染的保護性免疫應答。
3.權利要求1的藥物組合物，其中所述超免疫血清反應性抗原包含前導或分泌序列、 用于純化的序列或前蛋白質序列。
4.權利要求1的藥物組合物，其中所述抗原包含選自以下的氨基酸取代A214D、 Y309S、T317N、V318C、K319Q，其中所指的氨基酸殘基引用在kq ID No 166中的位置。
5.根據權利要求1所述的藥物組合物，其進一步包含免疫刺激物質。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述免疫刺激物質是聚陽離子聚合體、免疫刺激性寡脫氧核苷酸(ODN)、包含至少兩個Lys-Leu-Lys基序的肽、刺激神經組織的化合物、明礬或弗氏完全或不完全佐劑。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其中所述聚陽離子聚合體是聚陽離子肽。
8.根據權利要求1所述的藥物組合物，其為疫苗。
9.抗體或它的免疫學活性片段，其對于權利要求1所述的抗原是免疫學特異的，其中所述免疫學活性片段是Fab片段。
10.根據權利要求9所述的抗體，其為單克隆抗體。
11.根據權利要求9所述的抗體，其為人抗體或人源化抗體。
12.根據權利要求9、10或11所述的抗體在制備用于診斷動物體內化膿鏈球菌感染的診斷劑中的應用，其中所述診斷劑與在所述動物的組織或生物體液中的包含多肽或片段的化膿鏈球菌抗原具有反應性。
13.權利要求1所述的抗原在制備用于診斷動物體內化膿鏈球菌感染的診斷劑中的應用，其中所述診斷劑與在所述動物的組織或生物體液中的抗體具有反應性，并且所述抗體對化膿鏈球菌抗原是免疫學特異的。
14.一種用于治療或預防化膿鏈球菌感染的藥物組合物，其包含一種或多種根據權利要求9、10或11所述的抗體并且任選地包含藥用載體或賦形劑。
15.根據權利要求14所述的藥物組合物在制備用于治療動物體內化膿鏈球菌感染的藥物中的應用。
16.根據權利要求8所述的疫苗在制備用于使動物對化膿鏈球菌感染具有免疫力的藥物中的應用。
17.根據權利要求8所述的疫苗在制備用于刺激動物體內對化膿鏈球菌的免疫應答的藥物中的應用。
18.根據權利要求16所述的應用，其中所述藥物進一步包含免疫刺激物質。
19.根據權利要求18所述的應用，其中所述免疫刺激物質是聚陽離子聚合體、免疫刺激性寡脫氧核苷酸(ODN)、包含至少兩個Lys-Leu-Lys基序的肽、刺激神經組織的化合物、 明礬或弗氏完全或不完全佐劑。
20.根據權利要求19所述的應用，其中所述聚陽離子聚合體是聚陽離子肽。
21.根據權利要求17所述的應用，其中所述藥物進一步包含免疫刺激物質。
22.根據權利要求21所述的應用，其中所述免疫刺激物質是聚陽離子聚合體、免疫刺激性寡脫氧核苷酸(ODN)、包含至少兩個Lys-Leu-Lys基序的肽、刺激神經組織的化合物、 明礬或弗氏完全或不完全佐劑。
23.根據權利要求22所述的應用，其中所述聚陽離子聚合體是聚陽離子肽。
24.根據權利要求12所述的應用，其中所述動物是人。
25.根據權利要求13所述的應用，其中所述動物是人。
26.根據權利要求15所述的應用，其中所述動物是人。
27.根據權利要求16所述的應用，其中所述動物是人。
28.根據權利要求17所述的應用，其中所述動物是人。
29.一種用于治療或預防化膿鏈球菌感染的藥物組合物，其包含至少一種編碼抗原的核酸并且任選地包含藥用載體或賦形劑，所述抗原是一種超免疫血清反應性化膿鏈球菌抗原，其與來自具有化膿鏈球菌感染的人的血清具有免疫反應性，所述抗原包含分離的化膿鏈球菌肽片段，其中所述肽片段由kq ID No 166的氨基酸序列4-20、22-46、49-70、 80-89、96-103、105-119、123-129、153-160、181-223、227-233、236-243、248-255、261-269、 274-279、283-299、305-313、315-332、339-344、349-362、365-373、380-388、391-397、 402-407,1-48,25-48 或 22-410 組成。
30.用于生產根據權利要求9至11中任一項所述的抗體的方法，其特征在于以下步驟 通過將如在權利要求1至4任一項中所定義的超免疫血清反應性抗原或其片段施用于非人動物來引發所述動物體內的免疫應答， 從所述動物中取出包含抗體的體液，以及 通過將所述包含抗體的體液進行進一步的純化步驟而生產所述抗體。
31.用于生產根據權利要求9至11中任一項所述的抗體的方法，所述抗體是單克隆抗體，所述方法的特征在于以下步驟 通過將如在權利要求1至4任一項中所定義的超免疫血清反應性抗原或其片段施用于非人動物來引發所述動物體內的免疫應答， 從所述動物體內取出脾臟或脾細胞， 產生所述脾臟或脾細胞的雜交瘤細胞， 選擇并克隆對所述超免疫血清反應性抗原或其片段特異的雜交瘤細胞， 通過培養所述被克隆的雜交瘤細胞和任選地進一步的純化步驟生產所述抗體。
全文摘要
本發明公開了編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子以及來自化膿鏈球菌的超免疫血清反應性抗原或其片段、分離所述抗原的方法和它們的特殊應用。
文檔編號C12Q1/68GK102512670SQ20121000428
公開日2012年6月27日 申請日期2004年3月2日 優先權日2003年3月4日
發明者A·邁因克, B·溫克勒, D·格爾布曼, E·納吉 申請人:英特塞爾股份公司