專利名稱：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分離的制作方法
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分離技術領域
本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種來源于深海海洋微生物基因組的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分離鑒定，其編碼基因為AroA，通過遺傳轉化的方法，將該基因轉入宿主細胞中，使宿主細胞獲得耐受草甘膦的能力。本發明涉及該基因的核苷酸序列和氨基酸序列。技術背景
N-膦酰甲基甘氨酸，即草甘膦(glyphosate)，是大家熟知的一種內吸傳導型的廣譜滅生性除草劑，具有對人和牲畜低毒，在土壤中殘留量低，使雜草難以產生抗性等特點，基于這些特點，草甘膦在全世界范圍內得到廣泛的應用。
草甘膦能夠抑制植物或微生物體中芳香族氨基酸合成過程中的一種重要的酶的活性，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，這種酶催化莽草酸途徑(shikimatepathway)的倒數第二步，將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酰基部分轉移到莽草酸三磷酸(shikimate-3-phophate)的第5位輕基形成5_烯醇式莽草酸_3_磷酸(EPSP)和無機磷。由于草甘膦與PEP具有相類似的結構，可形成EPSP合成酶d-P 草甘膦復合物，阻遏PEP與酶的結合，阻斷芳香族氨基酸的合成途徑，影響了植物的正常代謝，從而殺死絕大多數的植物，雜草和農作物都不例外。因此，為了能夠在農作物生長的過程中選擇性地除去雜草，農作物就必需獲得抗草甘膦的能力(Dill 2005 ；Sun, Li et al.2006)。
目前研究的草甘膦抗性基因AroA主要分為兩類(He，Yang et al.2001)。I類AroA基因主要來源于植物或微生物，天然對草甘膦敏感，經改造后能夠對一定濃度的草甘膦產生耐受性，但對底物PEP的親和力會受到影響；11類AroA基因主要來源于根癌農桿菌CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和假單胞菌屬PG.2982 (Pesudomonas sp.)等，對底物PEP有高親和力，且天然對草甘膦不敏感，這類基因已在生產實踐中得到應用(參見美國專利453590，4769061，5094945)。這兩類基因序列的氨基酸相同性低于30%。
目前，在生產實踐中應用的草甘膦抗性基因主要是上述的II類AroA基因，對I類AroA基因的研究相對較少，且目前發現的I類AroA基因大多天然對草甘膦敏感，此類研究主要選材于陸地微生物，而對草甘膦抗性較高的AroA基因大多被發掘并申請專利保護，給我國的實際應用造成很大的局限性。為解決這一局限性，本發明選取新的菌種資源，即海洋微生物，此類微生物基因組與陸地微生物基因組存在很大的差異，得到AroA基因與其他同類基因存在很大差異。發明內容
本發明的目的是提供一種來自深 海海洋微生物基因組的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分離鑒定，通過遺傳轉化方法，將該基因轉入宿主細胞中，使宿主細胞獲得耐受草甘膦的能力。
本發明分離克隆的草甘膦抗性基因AroA來自于中國國家海洋局第三研究所篩選得到一株天然深海細菌Janibacter limosus 1C00094(原始菌株1C00094來自中國海洋微生物菌種保藏管理中心，中國國家海洋局第三研究所，福建，廈門，菌株來源地址:WWW.mccc.0rg.cn),該菌株能在含有150mM草甘膦的平板上生長。申請人通過鳥槍法(Osoegawa, Woon et al.1998)構建上述細菌 Janibacter Iimosus 基因組文庫，在含 20mM草甘膦的 M9 培養基(配方=Na2HPO4 6.8g/L，KH2PO4 3.0g/L, NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L,MgSO4 7H20 0.4929g/L，CaCl2 0.lllg/L，葡萄糖 4.0g/L,補充雙蒸水至 1L，滅菌前調 pH至7.4，在115°C下高壓蒸汽滅菌lOmin，備用)上篩得到一株草甘膦抗性菌株，進一步提高草甘膦濃度到IOOmM,該菌株仍能生長。測序結果顯示，本發明分離克隆的基因為AroA基因，申請人將該基因命名為AroAxlim。。將AroApim。基因轉化到大腸桿菌AroA基因缺陷型菌株(轉化過程參見實施例1中轉化的步驟)，得到的重組菌株，申請人將高菌株命名為重組大腸桿菌(Escherichia coli)LZD001,該菌株于2011年12月31日送交湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCCN0:M2011493。經功能互補實驗驗證，該重組菌株LZDOOl能在含IOOmM草甘膦的M9液體培養基中生長。酶學測定結果表明，草甘膦抗性基因AroApim。在pH 8.0時活性最高，為該基因轉入植物中在偏堿性條件下能正常發揮作用提供了條件。草甘膦抗性基因Ar0^linro對其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的Km值為90.7 PM，對莽草酸-3磷酸(S3P)的Km值為138 PM，對草甘膦的半抑制常數IC5tl值為3.115mM，最大反應速度(Vmax)為0.226mmolmin 1Ing、
將上述草甘膦抗性基因AroAj.lim。重組到pGEX_6P_l質粒表達載體(購自美國GEHealthcare公司)并位于GST標簽后，可以在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)(購自Invitrogen公司)中進行異源表達，表達出的含GST標簽的融合蛋白(命名為GST-EPSPS)大小為71.lkDa，去掉GST標簽后的目的蛋白(EPSPS)大小為45.1kDa0
本發明分離克隆的草甘膦抗性基因AroAxlinro的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所示。序列分析結果表明，草甘膦抗性基因AroAxlim。序列全長為1299bp，它編碼432個氨基酸(編碼區位序列表SEQ ID NO:1的第l_1296bp)，將其氨基酸序列與GeneBank上各種AroA氨基酸序列比較,結果顯示，AroAj limo基因序列與從Janibacter spp.HTCC2649菌株(GenBank:EAP99947.1)基因 組序列中預測到的AroA基因序列的核苷酸序列同源性最高值僅為67% (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)。根據草甘膦抗性基因AroAxlinro序列的特點申請人將其歸類為I型，是發現的一種新基因。將該基因轉化到大腸桿菌AroA基因缺陷型菌株(轉化過程參見實施例1中轉化的步驟)，得到的重組菌株命名為重組大腸桿菌(Escherichia coli) LZD001，該菌株于2011年12月31日送交湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO:M2011493。
序列表SEQ ID NO:1是本發明分離的草甘膦抗性基因AroAxlinw的核苷酸序列，序列全長為1299bp,第l-1299bp處為編碼區。
序列表SEQ ID NO:2是本發明分離的草甘膦抗性基因AroAxlinw的氨基酸序列，編碼432個氨基酸。
圖1:本發明技術流程圖。
圖2:Janibacter limosus 基因組 DNA 的酶解過程。
圖中 1.Janibacter limosus 基因組 DNA ;2_7.分別為 5min, lOmin, 15min, 20min,25min,30min的酶解產物；8.DNAMarker ；9.酶解后得到的所需要的片段(4_9kb)。
圖3:用大腸桿菌DE3(BL21)表達的EPSPS蛋白的SDS-PAGE分析。
圖中1.proteins Marker ;2.空載體pGEX_6P_l 未誘導上清；3.空載體pGEX_6P_l誘導上清；
4.pGEX-6p-1-AroAj limo 未誘導上清；5.pGEX-6p-1-AroAj limo 未誘導沉淀；
6.pGEX-6p-1-AroAj limo 誘導上清；7.pGEX-6p-1-AroAj limo 未誘導沉淀。
圖4:從構建的基因組文庫篩選得到的含目的基因的陽性重組克隆子:pUCl 18-1nsert fraction 圖譜。
圖5:含 AroAj.limo 基因的重組質粒 pGEX_6p-1-AroAj.limo 的圖譜。
圖6:含大腸桿菌AroA基因的重組質粒pGEX-6p-l-AroAE。coli的圖譜。
圖7:蛋白質濃度測定標準曲線圖。
圖8:無機磷(KH2PO4)標準曲線圖。
圖9:酶反應最適溫度測定曲線。
圖10:酶反應最適pH測定曲線。
圖11 =Km(PEP)的測定。
圖12:Km (S3P)的測定。
圖13:半抑制劑量IC5tl值的測定。
圖14:生長曲線，即含有AroAxlim。基因的大腸桿菌AroA缺陷型菌株的草甘膦抗性驗證。
具體實施方式
實施例1 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分離、克隆
(I)基因組文庫的構建及測序，獲得抗性基因
從中國國家海洋局第三研究所篩選得到的一株天然深海海洋細菌中選定原始的對草甘勝抗性為150mM的Janibacter limosus 1C00094菌株(又稱泥兩面神菌1C00094)(原始菌株來自中國海洋微生物菌種保藏管理中心，即中國國家海洋局第三研究所，中國福建廈門，WWW.mccc.0rg.cn),按照以下的步驟和方法構建該菌株的基因組文庫:提取深海海洋細菌Janibacter limosus即泥兩面神菌1C00094菌株基因組DNA (具體方法見后述)，部分酶解(酶切位點為Sau3A I)獲得所需要的片段(4-9kb)，再與pUC118載體(購自寶生物工程大連有限公司，該載體自帶酶切位點BamH I)進行連接，然后轉入大腸桿菌(E.coli)DH5a高效感受態細胞。參見下面的具體過程。
通過加有20mM草甘膦的M9培養基篩選得到能生長的克隆子，送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將測序結果與NCBI BLAST數據庫(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)比對后得到目的基因AroA的序列,其編碼的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所不。基因組DNA的提取方法:從劃線平板上挑取上述深海海洋細菌Janibacterlimosus菌株的單菌落，用裝有IOOml 2216液體培養基(培養深海細菌Janibacterlimosus (泥兩面神菌1C00094)的專用培養基:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉浸粉lg/L，乙酸鈉 lg/L，硝酸銨 0.2g/L，NaCl 19.45g/L，MgCl2、MgS04、CaCl2 2 3g/L，KCl 0.55g/L,NaHCO3 0.16g/L,補充雙蒸水至1L,滅菌前調pH至7.6,在121°C下高壓蒸汽滅菌30min,備用)的三角瓶于37°C過夜培養；用2ml離心管收集菌體2次，棄去培養基，加入200 U LlXTE緩沖液(配方:10mM Tris-HCl，lmM乙二胺四乙酸(EDTA)，加雙蒸水至1L，備用)重懸菌體，加入30-50 u L溶菌酶(濃度為50mg/mL)，于37°C放置30min，每隔5分鐘混勻一次。加入300 ii L 裂解液(配方:50mM Tris-HCl，2.5% NaAc，2% 乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，30%十二烷基磺酸鈉(SDS)，8%檸檬酸鈉，20%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，補足雙蒸水至1L，備用)，顛倒混勻；加入150 u L5MNaCl，放入70°C水浴鍋，IOmin0然后放入_20°C冰箱，IOmin0加入苯酚、氯仿/異戊醇(體積比為24: I)各350 yL，在渦旋振蕩器上震蕩30s后，離心IOmin后，吸取上清液。加入氯仿/異戊醇(與上清等體積)，混勻后，離心lOmin，充分除去苯酚，吸取上清；加入上述上清2/3體積的異丙醇，混勻后放-20°C冰箱lOmin，后離心lOmin，棄上清。加入濃度為70%的乙醇700iiL，離心7min，棄上清。置于37°C下烘干后，每管加入30 L雙蒸水溶解。
部分酶解:將提取質量較好的Janibacter limosus基因組DNA進行部分酶解，回收4-9kb大小的片段。所述的酶解體系為30ii L:3ii L 10XHbuffer,luL Sau3A I (稀釋160倍)(購自寶生物工程大連有限公司)，26 y L基因組DNA。先預酶切:體系加好后每5分鐘取L，加入I ii L loading buffer終止反應，依次取樣直到取完。點樣電泳檢測后，確定最佳酶解時間為25min。再大量酶解:按照預酶解的最佳時間，將反應體系擴大到300 y L，酶解后電泳，回收大小為4-9kb的片段。結果如圖2所示。
酶連:10iiL 酶連體系含 T4DNA Iigase (購自 Transgene 公司)I ii L ;5XT4DNAligase buffer 2 y L ;酶切后的基因組 DNA 片段 0.3pmol ；pUC118 (BamHI/EcoRI)載體(購自寶生物工程大連有限公司)0.03pmol ;補足雙蒸水至IOii L，于4°C下過夜酶連。
轉化:取酶連產物I UL與50 ii L大腸桿菌感受態細胞DH5a(購自Invitrogen公司)混合，加入到預冷的Imm電轉杯(購自BioRad公司)中，用2.1KV電壓電擊；然后迅速加入600 u L液體LB培養基，于37°C復蘇40min ;涂布在含有100 U g/mL氨芐青霉素(Ampicillin,購自北京Transgene公司)的LB平板上,37°C過夜。挑取轉化子,接種到液體LB培養基于37°C震蕩培養，抽取質粒并進行電泳驗證。
質粒的提取:從劃線平板上挑取單菌落，用裝有5mL含IOOii g/mLAmpicillin的LB液體培養基的試管內，37°C震蕩培養過夜。用1.5mL離心管收集菌體，12000rpm離心Imin,棄上清,加入200ii L溶液1(配方:50mM葡萄糖,25mM Tris *HC1,補足雙蒸水至1L,調pH至8.0，備用，IOmM EDAT,調pH至8.0)重懸菌體；混勻，加入400mL溶液II (配方:0.2MNaOH, I % SDS，加水補足至1L，備用)，輕輕顛倒混勻，放置時間不超過5min。加入300mL溶液III (配方:3M KAc,用冰乙酸調至pH4.8,備用)，顛倒混勻。于12000rpm離心IOmin,取上清，加入上清2/3體積的異丙醇，于12000rpm 4°C低溫離心IOmin ;棄上清,沉淀用70%乙醇洗滌后，于12000rpm 4 °C低溫離心lOmin。棄上清，沉淀用30 y L去離子水溶解。取5uL電泳檢測。
序列分析:以pUC118通用引物M13(由南京金斯瑞測序公司提供，正向引物F:5’ TGTAAAACGACGGCCAGT-3’;反向引物 R:5’ CAGGAAACAGCTATGACC-3’ )為測序引物，以重組質粒(pUCl 18-1nsert fraction)為模板，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。
(2) AroAxlim。基因的克隆
根據測序結果，經NCBI BLAST比對得到AroAxlim。基因的序列，設計擴增引物，在引物5’端添加BamHI酶切位點，在3’端添加酶切位點EcoRI，所述的引物對的DNA序列如下所示:
正向引物(5，-AroAj.limo-BamHI):5，-CGCGGATCCATGACCAGTCCTGATTGGCATGC-3，，下劃線部分為酶切位點；
反向引物(3，-AroAjlinro-EcoRI):5’ -CCGGAATTCTCAGCCCTCCGACGCCTCG-3’,下劃線部分為酶切位點。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
以按上述抽提的上述深海細菌即泥兩面神菌基因組DNA為模板，PCR擴增EPSPS。PCR反應體系如下:
5 X TransStart FastPfu buffer (購自北京 Transgene 公司) IOuL;
dNTP (10ml,購自北京 Transgene 公司)I ii L ;
泥兩名神菌基因組DNAIuL;
正向引物(5，-AroAxlim。-BamHI,IOuM)IuL;
反向引物(3’-AroAxlim。-EcoRI,IOuM)IuL;
TransStartFastPfu DNAPolymerase (購自北京 Transgene 公司)I U L ;
加雙蒸水至50iiL;
PCR反應條件:94°C預變性 2min ;94°C變性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 50s ;30 個循環；72°C延伸10min,4°C保存5min結束。
酶解PCR產物和質粒載體pGEX-6p_l構建:將獲得的PCR產物用限制性內切酶BamHI/EcoRI (購自寶生物工程大連有限公司)，酶解體系:100 y L中含82 y L PCR產物或PGEX-6P-1質粒(生物學試驗中常用的質粒,本發明購自美國GE Healthcare公司，該質粒提取方法同實施例1) ；10u L IOXH Buffer ； 4u L BamHI ；4u L EcoRI ;于371:放置過夜。重組質粒pGEX-ep-l-AroAph。的具體構建過程如圖1所示,構建好的重組質粒如圖5所示。
酶切產物的回收使用膠回收試劑盒(購自AxyGen公司)，按照該試劑盒的說明書回收電泳產物。具體過程是:在紫外燈下將目的條帶切下后置于1.5mL的離心管中，每IOOmg加入300 ii L的DE-A緩沖液(該試劑盒自帶)，于70°C水浴鍋溫浴lOmin，直到凝膠全部融化。再加入1/2 倍DE-A緩沖液(該試劑盒自帶)體積的DE-B緩沖液(該試劑盒自帶)，將溶膠液加入到2mL吸附管12000rpm，4°C離心lmin，加入500uLWl緩沖液(該試劑盒自帶)離心洗脫lmin,再加入700uLW2緩沖液(該試劑盒自帶)離心洗脫lmin,將緩沖液棄去后再離心Imin盡可能除去乙醇，加入50ii L雙蒸水洗脫收集DNA。電泳結果如圖2所/Jn o
克隆酶連:IOii L連接體系中含有:
經上述過程構建好的含BamHI/EcoRI雙酶切位點的pGEX_6P_l質粒載體0.03nmol ;經 BamHI/EcoRI 雙酶切的目的基因 0.2InmoI ;T4DNAligase (購自 Transgene 公司)liiL ;5XT4DNAligase buffer 2yL;加雙蒸水補至 10 y L，于 4°C 酶連過夜。
將AroA1.limo基因(其核苷酸序列見SEQ ID NO:1所示)插入到pGEX-6P_l載體，將驗證正確的陽性克隆子提取重組質粒，命名為pGEX-6p-l-AroAnim。，其大小為6280bp (見圖5)。
實施例2 EPSPS蛋白的表達、純化與分析
(I)目的蛋白EPSPS的表達
將重組質粒pGEX-ep-l-AroAi；^。轉化到表達宿主細胞大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)。驗證陽性克隆，將鑒定正確的陽性克隆子過夜活化，以體積比I %的接種量轉接至IL含100 ii g/mLAmpicillin的LB液體培養基中，于37°C培養2_3h，直至OD6tltl達到0.6左右，加入誘導劑異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)終濃度至0.5mM,于22°C，180rpm下培養25h。離心收集菌體,然后用Hepes緩沖液(配方:50mM 4_輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes),2mM 二硫蘇糖醇(DTT)，調pH至7.0，補足雙蒸水至1L，備用)將菌體洗滌一遍，再用50mLHepes緩沖液懸浮后用高壓細胞破碎儀(購自GEANiro Soari公司型號:NS10012K)破碎細胞。將細胞破碎液于4°C、12000rpm下離心30min，收集上清。用SDS-PAGE法檢測獲得的上清是否含有目的蛋白。
SDS-PAGE 配方如下:
濃縮膠(5%聚丙烯酰胺)，配方如下:
H2O1.4mL ；
30% Acr-Bis (29: I) 0.33mL ；
IM Tris-HCl, pH6.8 0.02mL ；
10% SDS0.02mL ；
10% 過硫酸銨0.02mL;
四甲基乙二銨(TEMED)0.002mL。
分離膠(12%聚丙烯酰胺)，配方如下:
H2O2.45mL ；
30% Acr-Bis (29: I)3mL ；
IM Tris-HCl, pH8.82.5mL ；
10% SDS0.075mL ；
10% 過硫酸銨0.075mL;
四甲基乙二銨(TEMED)0.003mL。
取80iiL細胞破碎液，加20iiL5X蛋白上樣緩沖液(6mL lmol/L Tris-HCl,pH8.8), 20mL10 % SDS, 50mL50 % 甘油，5mL P -巰基乙醇，ImLl %溴酌 藍，加雙蒸水至IOOmL,備用)，沸水浴5min，然后點樣10 y L電泳檢測，SDS-PAGE電泳檢測結果見圖3。圖3表明，目的蛋白EPSPS在大腸桿菌中得到正確表達，含GST標簽和目的蛋白的融合蛋白，申請人將此融合蛋白命名為GST-EPSPS，其大小約為71.lkDa，去掉GST標簽后的目的蛋白EPSPS為45.lkDa，符合預測結果。
(2)目的蛋白EPSPS的純化
本發明利用還原型谷胱甘肽(GST)親和純化系統純化重組蛋白(Nilsson，Stahl et al.1997)，具體操作步驟(所有操作均在4°C下進行)如下:取2ml柱材料GSHSepharose 4B (購自Amersham-Pharmacia公司)于層析柱中，用50mL Hepes緩沖液洗脫平衡；將細胞破碎液的上清以1.0ml/min的流速過柱；用300mLHepes緩沖液洗脫沒有結合的雜蛋白，流速控制在1.0mL/min以下。再取IOy L濃度為10unit/iiL的3C蛋白酶(購自Merck公司)與ImL Hepes緩沖液混勻,加入層析柱混勻后放4°C酶解12小時。收集上一步驟中經酶解后含目的蛋白EPSPS的Hepes緩沖液至1.5ml的離心管中，再加等體積的甘油混合后分裝，置于-80°C保存(Rippert and Matringe 2002)。
(3)目的蛋白EPSPS的濃度定量測定
采用定量Bradford法(Bradford 1976)測定純化的目的蛋白EPSPS的濃度。具體步驟如下:用Bradford蛋白定量試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)測定目的蛋白EPSPS的濃度，按照試劑盒的說明書操作。具體步驟為:取20 u Llmg/mL蛋白標準品牛血清蛋白(購自上海生工生物工程技術有限責任公司)加Ifepes緩沖液稀釋至lOOyL，使終濃度為0.2mg/mL。取稀釋后的標準品按0，1，2，4，6，8，10，15 y L分別加到96孔板中，力口Hepes緩沖液補足到20 u L，每孔蛋白含量分別為0.0,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6, 2.0mg/mL。每組設計3個平行試驗。每孔加入200 V- L Bradford Reagent (Bradford蛋白定量試劑盒自帶)，混勻，室溫放置5min后用預熱的酶標儀(Thermo Scientific公司)測定0D595值,繪制標準曲線，得到如圖7所示的蛋白質濃度測定標準曲線，計算樣品的蛋白濃度。
(4)目的蛋白EPSPS的活性測定
目的蛋白EPSPS活性測定參照文獻(Lanzetta, Alvarez et al.1979)報道的無機磷的測定方法。具體步驟如下:
無機磷標準曲線的制作:配制IOmM的無機磷標準溶液(稱取0.2282gK2HPO4 *3H20,用Ifepes緩沖液溶解定容至IOOmL)，取30mL標準溶液用Ifepes緩沖液稀釋10倍，分別取0、5、10、20、30、40 (ii L)于I 5mL離心管中，每管無機磷濃度分別為0、0.1、0.2、0.4,0.8mM ;分別加入適量Ifepes緩沖液補足至50 y L，于28V反應3min后加入0.8mL MAT溶液(現配現用:0.045%孔雀石綠75mL，4.2%鑰酸銨用IOmL濃鹽酸溶解后定容至25mL，混合后過濾，加入200 ii L Tritonx-100,備用)，室溫放置lmin后加入0.1mL 34%朽1檬酸鈉溶液，放置30min后取200 ii L于96孔板中測定OD66tl值。設計三個實驗組(Jin，Lu etal.2007) 0以無機磷濃度為橫坐標，以OD66tl為縱坐標作圖得到無機磷標準曲線圖(見圖8)。
最適溫度測定:反應體系同上述pH測定體系。體系加好后于不同溫度(0、10、20、30、40、50、60°C)下反應3min，加入0.8mL MAT溶液，lmin后加入0.lmL34%檸檬酸鈉溶液，室溫放置30min后，取200 ii L于96孔板中，用預熱的酶標儀測定OD66tl值(對照組不加莽草酸三磷酸(S3P)，設計3個實驗組)。以溫度為橫坐標，以相對活性為縱坐標作圖，得到如圖9所示的最適溫度測定曲 線。
最適pH測定:50 V- L反應體系:lmM莽草酸三磷酸，ImM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),加入IuL純化的EPSPS蛋白，加不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、ll) W Hepes緩沖液補足到50 u L0 28°C反應4min，加入800iiLMAT溶液，Imin后加入100iiL34%檸檬酸鈉(SC)溶液，室溫放置30min后，取200 ii L于96孔板中，用預熱的酶標儀測定OD66tl值。對照組不加莽草酸三磷酸，設計3個實驗組。以pH值為橫坐標，以相對活性為縱坐標作圖，得到如圖10所示的最適PH測定曲線。
Km(PEP)測定:將體系中莽草酸三磷酸(S3P)的濃度固定為ImM，在不同PEP濃度(0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mM)下按上述50 y L反應體系測定酶反應速度(Sun,Chen et al.2005)，以PEP濃度為橫坐標，以反應速度V(U/mg)為縱坐標作圖，得到如圖11所示的Km(PEP)的測定結果。
Km(S3P)測定:將體系中磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的濃度固定為ImM，在不同莽草酸三磷酸(S3P)濃度(0,0.02,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8、1.0mM)下按上述50 y L反應體系測定酶反應速度，以S3P濃度為橫坐標，以反應速度V (U/mg)為縱坐標作圖，得到如圖12所示的Km(S3P)的測定結果。
半抑制劑量(IC5tl)測定:在上述反應體系中添加不同濃度(10_5、10_4、10_3、10_2、10' 10°、101、100、IOOOmM)的草甘膦，所得數據以草甘膦濃度為橫坐標，采用對數坐標，以反應速度V(U/mg)為縱坐標作圖，得到如圖13所示的半抑制劑量IC5tl值的測定結果。
實施例3:遺傳轉化實驗(功能互補驗證)
將重組質粒pGEX-6p-l-Ar0AT.lim。轉化到AroA基因缺陷型大腸桿菌感受態細胞(轉化過程參見上述實施例1中轉化過程。該菌株不含AroA基因，能夠排除一般大腸桿菌中帶有的AroA基因的干擾)(Vaithanomsat and Brown 2007),分別轉接到含0mM、50mM、IOOmM草甘膦的M9液體培養基中，測定生長曲線。
(I)設定對照
引物的設計與合成。根據GENEBANK公布的大腸桿菌E.coli K_12 AroA基因(命名為AroAE.Mli)核苷酸序列(登錄號:NP_415428.1)，設計合成如下引物對:
正向引物(5，-AroAE.col1-BamHI):
5，-CGCGGATCCATGGAATCCCTGACGTTACAACCCATCGCTCGTG-3 ’，下劃線部分為 BamHI酶切位點；
反向引物(3’-AroAE.col1-XhoI):
5’ -CCGCTCGAGTCAGGCTGCCTGGCTAATCCGCGCCAGCT-3’，下劃線部分為 XhoI 酶切位點。該引物對由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
構建pGEX-6p-l-AroAE.coli重組質粒，具體步驟和構建方法同上述實施例2中pGEX-6p-l-AroAj limo重組質粒的構建，pGEX-6p-1-AroAe coli重組質粒圖譜如圖6所示。
(2)生長曲線的測定
將構建好的重組質粒pGEX-6p-1-AroA1.limo和pGEX-6p-l-AroAE.coli分別轉化到感受態細胞大腸桿菌AroA缺陷型菌株AB2829，將轉化子分別接種到含有含0mM、50mM、IOOmM草甘膦的M9液體培養基中(含100 ii g/mL Ampicillin)，于37°C震蕩培養40h。每組設計三個平行實驗，每IOh取200 ii L培養液測定細胞濃度，即OD6tltl值。以培養時間為橫坐標，以OD6tltl值為縱坐標作圖，得到的生長曲線如圖14所示。
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權利要求
1.一種5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。
2.—種5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因，其編碼的蛋白質的序列如序列表SEQ IDNO:2所述。
3.一株包含表達5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因重組質粒的大腸桿菌LZD001，保藏在中國典型 培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO:M2011493。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種抗草甘膦基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分離鑒定，所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所述。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因是從深海細菌Janibacter limosus菌株的基因組文庫中克隆得到，包含該基因質粒的重組大腸桿菌LZD001保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM2011493。經過生物學實驗驗證，證明該基因對草甘膦具有一定的耐受性。
文檔編號C12N9/12GK103194465SQ20121000689
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者劉子鐸, 趙艷, 林擁軍, 邵宗澤 申請人:華中農業大學