專利名稱：禽網狀內皮組織增生癥病毒gp90蛋白的線性中和表位多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗原表位多肽及其應用，尤其涉及一種針對禽網狀內皮組織增生癥gp90蛋白的中和性抗原表位多肽。屬于分子檢測領域。
背景技術：
禽網狀內皮組織增生癥是由禽網狀內皮組織增生癥病毒 (Retieuloendotheliosis Viruse, REV)群引起的火雞、雞、鴨、鶴鵓和我鳥等以淋巴-網狀細胞增生為特征的一組綜合癥(Witter R L，Fadly A Μ· Reticuloendoetheliosis. In Disease of Poultry,Ilth edn，2003，517-535. Edited by Y M Saif, H J Barnes, J R Glisson，et al.Ames，IA, USA Iowa State Press.)，這些綜合征包括急性網狀細胞腫瘤形成、生長抑制綜合癥、淋巴組織和其它組織的慢性腫瘤形成。目前REV群包括缺陷型T株、雛雞合胞體病毒、鴨傳染性貧血病毒、脾壞死病毒和其他來自火雞、雞、鴨、雉和鵝的非缺陷型分離株。REV—般感染低日齡雞，特別是新孵出的雛雞及胚胎，感染后引起嚴重的免疫抑制或免疫耐受。而高日齡雞免疫系統發育完善，感染后一般不出現或僅出現一過性病毒血癥。Bagust等研究證明，REV可以直接或間接傳播(Bagust T，Grimes T， Dennet D，et al. Infection studies on a retieloendotheIiosis contaminant of a commercial marek’s diseasevaccine. Aust Vet J，1979，55 :153-157.)。石開究結果表明， 污染REV的商業禽用疫苗也是其傳播的一個重要因素，通過給雞接種REV污染的馬立克氏病疫苗、禽痘疫苗，亦可引起人工傳播(McDougall J, Shilleto RiBiggs P M. Experimental infection of chickens with an Australian strain of retieuloendotheliosis virus in the turkey. Avian Pathol，1981，10 :163-169 ;Brunovskis P，Velicer LThe Marek’s disease virus unique short region alpha herpes virus homologs,fowlpox virus homologs, and Marekr s disease virus-specific genes.Virology,1995,206 324-338 ；Theodros T，Willie M. Detection of specific retieuloendotheliosis virus sequence and protein from REV-integrated fowlpox virus strains. Journal of virological Methods，2003，110 :99-104.) 另外，REV與雞痘病毒和馬立克氏病毒重組現象的發生，也必將成為造成REV臨床發病率增高的一個重要因素(Kim T，Tripathy N. Reticuloendoetheliosis virus integration in the fowl poxvirus genome not a recent event. Avian Dis，2001，45 :663-669 ;Cui Z，Zhuang Q，Xu X，et al. Molecular and biological characterization of a Marek’ s disease virus field strain with retieuloendotheliosis virus LTR insert.virus genes，2010，40 :236-43)。禽網狀內皮組織增生癥病毒屬于正反轉錄病毒亞科Y反轉錄病毒屬的成員， 其核酸是單股正鏈線性RNA(ssRNA)的二聚體，即其基因組核酸是雙倍體正股RNA，完全復制 REV 的基因組大約為 8. 3kb (Barbosa T，Zavala G，Cheng S，et al. Full genome sequence and some biological peoperties of retieuloendotheliosis virus strainAPC—566 isolated from endangered Attwater s prairie chickens. Virus Res，2007， 124 :68-77 ；Lin C，Chen C，Wang C，et al. Isolation，identification and complete genome sequence of an avian retieuloendotheliosis virus isolated from geese. Veterinary Microbiology，2009，136 (3-4) :246-249.)，不完全復制型(或缺陷型)T 株的基因組僅有約 5. 7kb (Cohen M，Rein R，Stephens C，et al. Baboon endogenous virus genome. III. non-Molecular cloning and structural characterization of defective viral genomes from the DNA of ababoon cell strain. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A， 1981,78 :5207-5211.), REV全基因組編碼相應蛋白的順反子圖譜是5 ' -pl2_ppl8/pp2 0-p30-pl0-pol-gp90-gp20-p2 (E) -3r，這些蛋白成熟后根據其功能又可分為酶蛋白、囊膜蛋白和核心蛋白。囊膜蛋白(env)是糖蛋白，包括env基因編碼的2個糖蛋白gp90和 gp20兩條肽鏈，較小的gp20貫穿病毒的囊膜，稱為穿膜蛋白(TM)，較大的gp90通過二硫鍵和氫鍵與TM相連，暴露于囊膜之外，稱之為表面蛋白(SU)，TM和SU是env基因編碼的前體蛋白經水解后產生的(Tsai ff, Copeland T, Oroszlan S, et al. Purification and chemical and immunological charaterization of avian retieuloendotheliosis virus gag-gene-encoded structural proteins. Virology, 1985,140 :289-312.)。其中，gp90 作為病毒的囊膜外糖蛋白，其C-末端表位位于感染細胞表面，其上有許多糖基化位點，在自然狀態下可結合多糖；而且因gp90含有順序和構象表位，所以它是REV的免疫顯性蛋白， 且具有病毒的型特異性；另外，其C-末端抗原簇具有受體結合的功能，可誘導宿主機體產生補體介導的細胞毒性反應(Davidson I, Yang H, Witter R, et al. The immunodominant proteins of retieuloendotheliosis virus. Vet Microbo,1995,49 :273-284 ;Chen I,Cui Z, Lee L, et al. Serologic difference among nondefective retieuloendotheliosis virus. Arch Virol, 1987,93 :233-246.)。gp90還是誘導宿主產生中和抗體的主要蛋白質, 它非常容易發生變異，REV抗原的高度變異性主要體現在這一蛋白上。分析和確定病毒保護性抗原表位，已成為病毒診斷和開發表位疫苗的重要基礎性研究工作。對于病毒的治療方面，也將更多地依賴于功能性抗原表位尤其是中和活性表位的篩選與鑒定。傳統的抗原表位分析方法，即抗體篩選重疊合成肽法，需預先明確抗原的氨基酸序列，再合成大量的肽段進行篩選，成本高，操作比較復雜，對于糖基化抗原及構象型抗原表位的篩選其局限性更明顯。噬菌體隨機肽庫展示技術是將隨機合成的一定長度的DNA插入噬菌體外殼蛋白III或VIII的基因中表達，從而在噬菌體表面展示出隨機肽， 這種隨機肽庫容量很大，可用于研究分子間的相互作用，尤其適于篩選生物活性大分子的配體，應用該技術已成功地篩選到多種病毒抗原(HPV，HBV, HIV和HCV等)及多種腫瘤抗原的表位或模擬表位，并證實其中一些噬菌體呈現的短肽具有很強的免疫原性，所激發的抗體能識別天然抗原(Smith G. P.，and Petrenko V. A. , 1997, Phage display, Chemical Reviews,97(2) :391-410 ;Daniels D.A., Lane D.P.,1996, Phage peptide libraries, Methods Enzymol,9 :494-507 ；Zozulya S. , Lioubin M. , Hill R.J. , Abram C. , and Gishizky M. L. ,1999,Mapping signal transduction pathways by phage display,Nature Biotechnology, 17 :1193-1198.)。該技術彌補了傳統方法的不足，使得經抗體途徑分析和鑒定病毒保護性的抗原表位成為可能，對于病毒感染中的臨床診斷和篩選疫苗候選分子具有重要的借鑒作用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種禽網狀內皮組織增生癥病毒gp90蛋白的線性中和表位多肽，本發明所述的線性中和表位多肽其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。本發明還提供了編碼所述的線性中和表位多肽的核苷酸序列。進一步的，本發明提供了所述的線性中和表位多肽在制備檢測或診斷禽網狀內皮組織增生癥病毒的試劑中的用途。及所述的核苷酸序列在制備檢測或診斷禽網狀內皮組織增生癥病毒的試劑中的用途。本發明的一種檢測或診斷禽網狀內皮組織增生癥病毒的試劑，其特征在于所述試劑中包括本發明所述的線性中和表位多肽。為了達到以上所述的目的，本發明采用的技術手段為本發明采用M13噬菌體隨機12肽庫(Ph. D. -12 )，對一株禽網狀內皮組織增生癥 gp90蛋白的(具有中和活性的)單克隆抗體A9E8進行3輪生物淘選，獲得8個噬菌體陽性克隆，均能與A9E8發生特異性結合反應。繼而對陽性克隆的融合12肽進行序列測定和序列比對，分析出A9E8所識別的表位肽基序為SVQYHPL (SEQ ID NO. I所示)，位于gp90的第 213 219位氨基酸之間。將gp90蛋白213SVQYHPl219序列及其逐一截短序列插入pGEX-6p-l 載體進行融合表達及western blot分析，確定了單克隆抗體A9E8識別禽網狀內皮組織增生癥gp90蛋白的線性B細胞表位，該序列位于gp90蛋白213SVQYHPl219位氨基酸。將此基序與GenBank中已公布的所有非缺陷型禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV-A)、缺陷型禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV-T)、四株鴨脾壞死病毒(SNV)及一株雞合胞體病毒的gp90氨基酸序列進行比對后發現，該基序在禽網狀內皮組織增生癥病毒群間高度保守，由此推斷， A9E8表位可能是禽網狀內皮組織增生癥病毒群特異性表位。本發明為基于表位的基因工程診斷試劑的研制和多肽疫苗的設計提供依據。
圖I為單克隆抗體A9E8與8個噬菌體克隆特異結合的ELISA檢測結果；圖2為表位基序與GenBank中所有REV群氨基酸序列比對結果；圖3為目的蛋白的表達與分析；圖4為融合表達多肽與單克隆抗體A9E8反應的Western blot分析。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。單克隆抗體和生化試劑(I)分泌抗禽網狀內皮組織增生癥病毒gp90蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株 (A9E8)由本實驗室制備；其微生物保藏號是CGMCC NO 4143 ;保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2010年9月3日。該菌種已在發明名稱為“抗禽網狀內皮組織增生癥gp90蛋白的單克隆抗體及其應用”的專利申請中保藏，該專利的申請號為 201010518065. 7，專利
發明者崔紅玉, 王云峰, 王玫, 石星明, 趙妍 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所