專利名稱：一種藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及藥物篩選模型領域，具體涉及藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，可應用于藥物口服吸收的預測和篩選。
背景技術：
Caco-2 細胞(the human colon carcinoma cell line，人結腸腺癌細胞系，簡稱 Caco-2)來源于人結腸癌細胞，是目前公認用于預測人體腸道內藥物吸收最為經典的體外模型之一。Caco-2細胞可在培養條件下自發進行上皮樣分化并可以形成緊密聯結，分化出絨毛面和基底面，其形態學、標志酶的功能表達、滲透特征等與小腸上皮細胞相似，因此，此種細胞可以模擬小腸上皮細胞，廣泛用于藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究。
在傳統的Caco-2培養模型中Caco-2能表達許多載體蛋白和多種藥物代謝酶，包括P-糖蛋白(p-glycoprotein，P_gp)、CYP3A4等。傳統Caco-2細胞模型的建立方法為 細胞種板后在基礎培養基上培養21天，前7天隔天換液，后14天每天換液；但是該模型比較明顯的缺陷是需要長達21天的培養時間，使其應用于預測藥物口服吸收時的實驗周期過長，不能應付現今大量先導化合物涌現后所需的高通量篩選。發明內容
本發明的目的是針對傳統的Caco-2培養模型需要較長培養時間的缺陷，提供一種藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，最大限度地縮短細胞培養周期，提高藥物口服吸收預測和篩選的效率。
本方法的原理是利用體外模型與體內吸收的相關性，進行口服藥物吸收的預測。
本發明通過以下技術方案實現上述目的。
一種藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，包括如下步驟(1)WDMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)為基礎培養基培養 Caco-2 細胞， 基礎培養基中含體積分數20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 UmL-1的青霉素和 100 U-πιΓ1的鏈霉素；(2)種板前一天用鼠尾膠原鋪板，即在Transwell板上的每個孔中加入鼠尾膠原，風干過夜；鼠尾膠原的配制方法為取IOOrnl超純水，加入100 μ 1乙酸，高壓滅菌，冷卻后加入 5mg/ml鼠尾膠原anl，使用前用甲醇稀釋，稀釋體積比為甲醇鼠尾膠原=4:1 ；(3)當Caco-2細胞長至覆蓋培養瓶瓶底的80% 90%時，胰酶消化，將Caco-2細胞接種在1TransweIl板上，Transwell板下腔加入基礎培養基；(4)第2、3天每天更換基礎培養基，第4、5、6天加分化培養基，分化培養基為采用上皮細胞分化基礎培養基后添加MIOT制得；一共培養6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。
優選地，步驟(1)中培養Caco-2細胞是將Caco-2細胞放入培養瓶，置于培養箱內進行培養，隔天更換基礎培養基；培養箱的培養條件為溫度37°C，通入5% CO2，相對濕度90%。
優選地，步驟(2)中每個孔中加入上述鼠尾膠原800 μ L。
優選地，步驟(3)的接種密度為5Χ105/孔，Transwell板下腔加入基礎培養基1.5mLo
其中Transwell板為一種具有0.3μπι孔徑的碳酸聚酯膜，起支持Caco-2單層細胞的作用；步驟(4)中的MIOT為MIOT (BD)公司產品，是包括牛胰島素、霍亂菌素等成分的混合物。
在藥物的轉運實驗進行前及結束后，均用細胞電位儀測定跨上皮細胞電阻 (trans印ithelial electrical resistance, TEER)，以確定單層細胞的緊密性與完整性， 符合條件的細胞可用于實驗。
本發明與現有技術相比，具有如下優勢a)提高藥物體外吸收的有效篩選率。本發明模型使藥物經過細胞的吸收、代謝等過程后，取藥進行測定，使得體外篩選的結果與整體實驗數據的基本吻合；另一方面，本發明減少了細胞的培養時間，從而減少了實驗中的不穩定因素，如污染等。因此該快速藥物篩選模型提高了藥物吸收預測和篩選的可靠性，可有效地提高藥物的篩選率；b)簡化了篩選程序。常規的體外Caco-2細胞篩選模型需要長達21天的培養，這大大制約了初期先導化合物體外轉運和吸收篩選的效率。該發明將培養時間減少為6天，篩選速度是傳統培養時間的3倍以上，簡化了篩選程序，節約了大量的人力物力；c)操作方便，節約成本。對比國內外報道的篩選模型，本發明模型的經濟效益較高。關于快速篩選的模型，有報道用纖維膠原鋪板，但其成本較高，成本上消耗比21天培養的傳統模型更甚。本發明利用了鼠尾膠原鋪板，同樣也能達到效果，實現了成本與效率的雙贏， 在成本與效率上都比目前報道的預測模型具有優勢。
圖1 藥物在Caco-2細胞單層模型中的轉運途徑，其中(I )跨細胞被動轉運 (細胞通透性)；(II )細胞旁轉運；(III)載體介導的轉運(a:攝入，b外排)；(IV)經代謝后的轉運；圖2 :7天Caco-2細胞模型電阻值隨著細胞培養天數的變化； 圖3:熒光黃標準曲線；圖4 熒光黃在Caco-2單層細模型中的透過值(均數士方差，η = 3)； 圖5:普萘洛爾標準曲線；圖6 普萘洛爾在Caco-2單層細模型中的透過值(均數士方差，η = 3)； 圖7 :7天Caco-2細胞模型預測與體外吸收相關性分析； 圖8 :21天Caco-2細胞模型預測與體外吸收相關性分析； 圖9:地高辛標準曲線；圖10:地高辛在21天Caco-2細胞模型中的雙向轉運特點； 圖11 地高辛在7天Caco-2細胞模型中的雙向轉運特點； 圖12 21天Caco-2細胞模型單層的驗證(光斑為細胞核)； 圖13 :7天Caco-2細胞模型單層的驗證(光斑為細胞核)；圖14 21天Caco-2細胞模型中由于種板密度過高出現多層細胞(光斑為細胞核)。
具體實施方式
實施例1模型的建立。
圖1為Caco-2細胞模型中藥物在細胞中的轉運途徑，本發明根據這些轉運途徑建立快速Caco-2細胞單層模型，即上述藥物口服吸收預測和篩選模型，其建立方法具體步驟如下(1)以DMEM(Dulbecco，s modified Eagle medium)為基礎培養基，基礎培養基中含體積分數20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 Umr1的青霉素和100 Umr1的鏈霉素；將Caco-2細胞培養于25 cm2卡式一次性培養瓶中，置于37°C培養箱內，通入5% CO2，相對濕度90%條件下進行培養，隔天更換基礎培養基；(2)種板前一天用鼠尾膠原鋪板。鼠尾膠原的配制方法為取IOOml超純水，加入 100 μ 1乙酸，高壓滅菌，冷卻后加入5mg/ml鼠尾膠原(生友技術有限公司)2ml，使用前用甲醇稀釋，稀釋體積比為甲醇鼠尾膠原=4:1。在12孔Transwel 1板上，每孔加入SOOyL上述鼠尾膠原，風干過夜；(3)當Caco-2細胞長至覆蓋培養瓶瓶底的80% 90%時，胰酶消化，將Caco-2細胞接種在12孔Transwell板上，接種密度約為5 X IO5/孔，Transwell板下腔加入基礎培養基 1. 5 mL ；(4)第2、3天每天更換基礎培養基，第4、5、6天加分化培養基，分化培養基為采用上皮細胞分化基礎培養基后添加MIOT制得；一共培養6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。
在藥物的轉運實驗進行前及結束后，均用細胞電位儀測定跨上皮細胞電阻，以確定單層細胞的緊密性與完整性，符合條件的細胞可用于實驗。
實施例2采用幾種標準的底物或標記物在實施例1建立的藥物口服吸收預測和篩選模型(下面稱為7天細胞模型)中進行轉運實驗，對細胞模型的完整性、通透性、細胞旁路轉運以及 P-糖蛋白(P-gp)的表達進行驗證，以及進一步形態學的考察，并將實驗結果與傳統的21天 Caco-2細胞模型進行比較。
一、細胞模型的完整性細胞電阻值是評價Caco-2細胞模型完整性的指標。在本研究中我們使用細胞電位儀 (EVOM)對快速Caco-2模型的電阻值進行測量在細胞種板前對Transwell板模電阻值進行測量，為空白值Ω 1，收板時測定的電阻值為最終電阻值Ω2，即Ω (TEER) = Ω 1-Ω 2
使用細胞電位儀(EVOM)對實施例1建立的快速Caco-2模型的電阻值進行測量， 結果如圖2所示，細胞電阻值均大于350 Ω。根據文獻報道其電阻值應在150-650 Ω之間， 均在合格范圍之內。
二、細胞旁路轉運熒光黃是評價Caco-2細胞模型旁路透過的經典標記物。本實驗采用熒光分光光度計法測定熒光黃濃度。熒光黃激發波長為420nm，發射波長為520nm。
將20ng/mL熒光黃加于Caco-2細胞單層頂端(A面)，于池后從基底端(B面)取樣進行檢測。
藥物表觀滲透系數(Papp)根據下式計算 Papp= [(dC/dt (V) ]/(AXC0)C0為加藥側的藥物初始濃度，dC/dt為在接受側藥物出現的速率，V為接受側的溶液體積，A為Transwell多聚碳酸酯膜的表面積。
如圖3所示HBSS(Hanks Balanced Salt Solutions，漢克平衡鹽溶液)溶液中熒光黃的標準曲線方程為Y=157. 4Χ-26. 46，r=0. 999 (n=5)。線性范圍為31. 25 2000ng/ml。 其中Y為熒光黃的吸光度值(yg/ml)，X為熒光黃濃度(yg/ML)。如圖4所示可見Caco-2 細胞單層的緊密性良好，熒光黃在21天細胞模型和7天細胞模型中透過值分別0. 176和 0. 159 (10_6cm/s)，結果無統計學差異，7天細胞模型可能由于培養時間減少，不確定因素作用時間減少，方差較小。
三、細胞通透性普萘洛爾是評價Caco-2細胞通透性的經典標記物。本實驗首先建立檢測生物樣品中普萘洛爾的HPLC方法。采用色譜柱為HypersilBDSC18(I.D. 4. 6mmX150mm，5ym)不銹鋼柱(大連依利特公司生產)；流動相為25mM磷酸二氫鉀緩沖液乙腈(60:40)，用磷酸調pH 至2. 5 ；流速1. Oml/min ；檢測波長290nm ；進樣量20 μ L ；采用維拉帕米150 μ g/mL作為內標。將100 μ mol/L熒光黃加于Caco-2細胞單層頂端(A面)，于Ih后從基底端(B面)取樣進行檢測。
如圖5所示HBSS溶液中普萘洛爾的標準曲線方程為Y=O. 098X-0. 246, r=0. 995 (n=5)。線性范圍為1 200 μ mol/L。結果如圖6所示可見Caco-2細胞單層的通透性良好，普萘洛爾在21天細胞模型和7天細胞模型中透過值分別為31. 36和32. 44( 10_6cm/ s)，結果無統計學差異，與熒光黃透過值一致，7天細胞模型中普萘洛爾透過值方差較小。
四、人體口服吸收利用度與藥物在細胞中透過值的相關性分析根據藥物在Caco-2細胞模型中的透過結果，結合已報道藥物在人體口服吸收利用度， 進行相關性分析。
由相關性分析圖7、圖8所示，普萘洛爾與熒光黃在Caco-2細胞單層中的透過值和人體口服吸收利用度相關性良好。而且7天細胞模型與21天細胞模型的的預測結果幾乎一致，結果如表1，表2所示。
表1 熒光黃體內外相關性分析m I^e I Ammmm F—iXiOWO Μ A ni i it) ^RII“卜… 01W天 Cl IM ■!■■ 0 OW 0表2 普萘洛爾體內外相關性分析
權利要求
1.一種藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，其特征在于包括如下步驟(1)以DMEM為基礎培養基培養Caco-2細胞，基礎培養基中含體積分數20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 U-πιΓ1的青霉素和100 U-πιΓ1的鏈霉素；(2)種板前一天用鼠尾膠原鋪板，即在Transwell板上的每個孔中加入鼠尾膠原，風干過夜；鼠尾膠原的配制方法為取IOOml超純水，加入100 μ 1乙酸，高壓滅菌，冷卻后加入 5mg/ml鼠尾膠原anl，使用前用甲醇稀釋，稀釋體積比為甲醇鼠尾膠原=4:1 ；(3)當Caco-2細胞長至覆蓋培養瓶瓶底的80% 90%時，胰酶消化，將Caco-2細胞接種在1TransweIl板上，Transwell板下腔加入基礎培養基；(4)第2、3天每天更換基礎培養基，第4、5、6天加分化培養基，分化培養基為采用上皮細胞分化基礎培養基后添加MIOT制得；一共培養6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。
2.如權利要求1所述的藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟(1)中培養Caco-2細胞是將Caco-2細胞放入培養瓶，置于培養箱內進行培養，隔天更換基礎培養基；培養箱的培養條件為溫度37°C，通入5% CO2，相對濕度90%。
3.如權利要求1所述的藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟(2)中每個孔中加入鼠尾膠原800μ L。
4.如權利要求1所述的藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟(3)的接種密度為5ΧIO5/孔。
5.如權利要求1所述的藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟 (3) Transwell板下腔加入基礎培養基1. 5 mL。
全文摘要
本發明涉及一種藥物口服吸收預測和篩選模型的建立方法，是在前期已建立的21天Caco-2細胞模型預測化合物吸收的基礎上，進一步建立、優化和驗證7天Caco-2細胞模型預測方法，并對該模型的檢測指標及細胞形態學進行優化和驗證，以得到最適合的藥物口服吸收高通量篩選的Caco-2細胞模型。本發明能大大減少細胞模型培養的時間，而減少培養時間能大大降低細胞在21天長期培養中出現污染的可能性，減少勞動強度，以應對現今出現的大量先導化合物的口服吸收預測和篩選。
文檔編號C12Q1/02GK102533927SQ20121002314
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月2日 優先權日2012年2月2日
發明者畢惠嫦, 胡晉卿, 蔡伊科, 蔡大可, 黃民 申請人:中山大學