一種產甜葉菊糖基轉移酶ugt76g1的基因工程菌及其應用的制作方法

專利名稱：一種產甜葉菊糖基轉移酶ugt76g1的基因工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的基因工程菌及其應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
甜味劑是食品工業中最廣泛的添加劑，按其來源分為天然甜味劑和人工合成甜味齊U。在天然甜味劑中，應用最多的是蔗糖，但蔗糖是一種高熱量的甜味劑，攝入過多會導致人體肥胖、糖尿病、齲齒等疾病的發牛[1’2’3’4]。人工合成的甜味劑，如甜精(dulin，對-乙氧基苯脲)、環己氨基磺酸鹽(cyclamata)，雖然可以使人們對甜味得到滿足，但相繼被發現有毒副作用而被禁用；糖精(saccharin，鄰磺酰苯甲酰亞胺)，也因被報道有致癌作用而可能被限制使用。尋找無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜味劑一直是科學研究的熱點。甜葉菊(Stevia rebaudiana bertoni)，又名甜菊、糖草，是原產于南美巴拉圭等地的一種野生菊科草本植物，它是目前已知甜度較高的糖料植物之一 [5]。甜菊糖(Steviol glycosides)是從甜葉菊的葉、莖中提取出的一種新型天然甜味劑。它具有高甜度、低熱能的特點，其甜度是蔗糖的150 300倍，熱值僅為蔗糖的1/300[6]。經大量藥物實驗證明，甜菊糖無毒副作用，無致癌物，食用安全，經常食用可預防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥[7’8’9]，是一種可替代蔗糖非常理想的甜味劑。甜菊糖可廣泛應用于食品、飲料、醫藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業[11]，并且較應用蔗糖可節省成本60%。甜菊糖是目前世界已發現并經我國衛生部、輕工業部批準使用的最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑_。 是繼苷蔗、甜菜糖之外第三種有開發價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三糖源”。甜菊葉中三種最主要的糖甙成分在葉片中的含量通常為甜菊甙(stevioside， stevioside)占葉片干重 9· 1 %,萊鮑迪試 A (rebaudioside A, rebaudioside A 試)占 3. 8%，萊鮑迪甙C(rebaudioside C，RC甙)占 0. 6% [12]。市售甜菊糖一般以 stevioside 為主要成分，該組分甜度為蔗糖的200倍左右，其后味略帶甘苦味。而作為甜菊糖的第二主成分，rebaudioside A甙甜度為蔗糖400倍，口味純正，沒有后苦味。因此，提高rebaudioside A甙相對含量是提高甜菊糖品質的關鍵步驟。目前文獻報道提高rebaudioside A甙相對含量的策略有(1)培育rebaudioside A甙高含量的甜菊品種，國內已經嘗試成功通過嫁接方法，獲得rebaudioside A甙含量超過40%品種，但該品種不具備普適性，且品種容易退化，不適宜大面積種植[11];(幻通過純化提高rebaudioside A 與stevioside的比 列，此法由于天然植物中rebaudioside A 甙含量低于stevioside，且二者物理性質極為相近，使得純化工藝難度很大，得率較低。這兩種方法的高成本造成目前市場上高rebaudioside A甙含量的甜菊糖價格很高，含80 % rebaudioside A甙的甜菊糖市價比一般混合型甜菊糖要高出4 5倍。另有報道，可以利用環糊精糖基轉移酶修飾法改進甜菊糖的口感和味質，但是該法嚴重降低甜度，因此也不是最佳的解決方案。總之，目前已有的方法都不適宜推廣。因此，尋求高效的生物酶法轉化途徑已經成為提高rebaudioside A甙相對含量的必然趨勢。糖基轉移酶UGT76G1作為植物糖基轉移酶家族的一員，可以特異性的催化甜葉菊中的stevioside，生成rebaudioside A甙，因此有著重要的研究價值。Richman等從甜葉菊的EST中分離了 3種UGTs基因[13]，UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1。體外活性分析表明， UGT85C2催化甜菊醇到甜菊單甙(steviolmonoside)的反應，UGT74G1主要催化甜菊雙甙 (steviolbioside)的糖基化反應，產生 stevioside。而 stevioside 至Ij rebaudiosideA 試由UGT76G1 —步糖基化反應完成，見圖1。Humphrey等人的實驗結果也證實了此過程[14]。UGT76G1 全稱為 UDP-glycosyltrebaudioside Ansferebaudioside Ase 76G1，其編碼基因(Genbank code :AY345974)全長1616bp，開放讀碼框長度為1374bp，編碼458個氨基酸。有關UGT76G1的相關研究報道非常少，UDP-糖基轉移酶76G1 (UGT76G1)作為糖基轉移酶家族的一員，可以選擇性催化stevioside生成rebaudioside A甙，在甜菊糖生產方面具有潛在的應用價值。本專利首要目的是采用基因工程手段，將UGT76G1在Saccharomyces cerevisiae中實現表達，并該酶的催化特性進行研究。其次，考慮到Mccharomyces cerevisiae表達系統與其他表達系統相比，其適度的糖基化修飾過程更適合植物蛋白的表達[15_18]；此外UGT76G1在催化反應時需要加入UDPG 作為糖供體，而Mccharomyces cerevisiae系統可能會比大腸桿菌系統提供更多的天然糖供體而減少催化成本。基于以上考慮，將UGT76G1在&iccharomyces cerevisiae系統中實現表達，可以為利用重組菌進行全細胞催化stevioside生成rebaudioside A甙的工藝奠定基石出。UDPG是一種重要的核苷二磷酸單糖，1950年由Leloir和他的同事在研究半乳糖向葡萄糖轉化過程中首次發現[19]。UDPG是高等植物中活化糖的主要形式，作為葡萄糖基供體參與蔗糖、纖維素、半纖維素、果膠質以及糖脂、糖蛋白的合成代謝。UDPG還是合成其他核苷二磷酸單糖，如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖酸、尿苷二磷酸木糖等的前體。尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成過程如圖2所示。參考文獻[1]舒進珍等，中國甜菊栽培及應用技術[M]，北京中國農業出版社，1989年， 98 107.[2]徐任生主編，天然產物化學[M]，北京科學出版社，2004年，351 377.[3] Lombardo YB, Drebaudioside Ago S，Chicco A，et al. Long-term administrebaudioside Ation of a sucrose-rich diet to normal rebaudioside Ats relationship between metabolic and hormonal profiles and morphological changes in the endocrine pancreas[J] · Metabolism，1996，245 :1527 1532·[4]Ten S,and Maclaren N. Insulin resistance syndrome in children[J]. Clin Endocrinol Metab，2004，89 :2526 2539.[5]Kovylyaeva GI, Bakaleinik GA, Strobykina IYu, et al. Glycosides from Stevia rebaudiana[J]. Chemistry of Naturebaudioside Al Compounds,2007，43 (1) 81 85.[6]陳慕英，于喜水孫玉華，等.中醫藥信息[J]· 2001，18(3) :23.[7]JanM C · Geuns · Phytochemistry[M]，2003，64 :913 ·
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發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一株能夠表達糖基轉移酶UGT76G1的工程菌。
本發明所要解決的第二個技術問題是提供上述工程菌的構建方法。本發明所要解決的第三個技術問題是提供上述工程菌的誘導表達方法。本發明所要解決的第四個技術問題是提供上述工程菌的應用。一種產甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的基因工程菌，它是將UGT76G1編碼基因插入 PYes2載體的EcoRI和BioI酶切位點之間，構建了重組質粒，再將重組質粒導入表達宿主釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；其中，所述的UGT76G1編碼基因為GenBank，No. GenBank :AY345974. 1，該基因序列命名為UGT。上述基因工程菌的構建方法，該方法包括如下步驟1)用限制性內切酶EcoR I和Ml I雙酶切UGT基因片段和PYes2載體，連接UGT 基因片段純化產物與載體，得到重組質粒PYes2-UGT ；2)將重組質粒PYes2_UGT轉化至DH5 α感受態細胞，得到重組大腸桿菌 DH5 α -Phs2_UGT，選取陽性克隆；3)將鑒定后的陽性克隆的質粒導入釀酒酵母&iccharomyces cerevisiaeYPH499 中，得到基因工程菌YPH499-Pks2-UGT。上述基因工程菌的誘導表達方法，以半乳糖為誘導劑誘導基因工程菌產酶。上述基因工程菌的誘導表達方法，具體來說，將基因工程菌按2 5 (ν/ν) %接種量接種到碳源為20g/L葡萄糖的培養基上，培養8 16h，然后收集菌體，將菌體轉移到碳源為20g/L半乳糖的培養基中誘導，誘導時間為48 60h ；所述的碳源為20g/L葡萄糖的培養基配方為6. 7g/L YNB, 20g/L葡萄糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸， 0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L 組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/ L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸；所述的碳源為20g/L半乳糖的培養基配方為 6. 7g/L YNB, 20g/L半乳糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸， 0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸， 0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。上述基因工程菌在生產萊鮑迪甙A中的應用。即利用全細胞催化法，將甜菊甙轉化為萊鮑迪甙A。具體來說，是以誘導表達后的基因工程菌為全細胞催化劑，通過加入表面活性劑改變細胞的通透性，以甜菊甙和葡萄糖為底物，添加鎂離子以及調節代謝物質，反應得到萊鮑迪甙A。基因工程菌的用量按濕菌體計為2g/L ；甜菊甙的用量為lg/L ；葡萄糖的用量為 20g/L;所述的表面活性劑為普郎尼克F-68，用量為1 10g/L，優選2g/L;鎂離子使用 MgCl2,用量為1 10g/L，優選6g/L。所述的調節代謝物質分別有UMP、丁二酸、乳清酸或檸檬酸，UMP用量為0. 5 3g/ L，優選1. 5g/L ；丁二酸用量為5 10g/L，優選9g/L ；乳清酸用量為為1 5g/L，優選2g/ L ；檸檬酸用量為10 20g/L，優選15g/L。所述的反應在磷酸鉀緩沖液體系中完成，反應pH6. 8 7. 8，優選7. 2，反應溫度 25 42°C，優選37 °C，反應時間12 96h，優選72h。
有益效果本發明在不外加昂貴UDPG的情況下，以廉價碳源葡萄糖為底物，調節酵母體內UDPG的代謝途徑，全細胞催化M甙生成rebaudioside A。其中，添加UMP，最高達到115mg/L ；添加丁二酸，最高達到180mg/L ；添加乳清酸，最高達到270mg/L ；添加檸檬酸，rebaudioside A產量最高達到675mg/L ；說明添加檸檬酸等物質能夠有效促進酵母體內UDPG的合成。另外，在添加檸檬酸的前提下，研究催化反應體系的PH值、反應溫度以及時間，最終獲得最佳反應調節為PH7. 2、反應溫度37°C、反應時間72h，此條件下rebaudioside A產量高達875mg/L。


圖1糖基轉移酶催化甜菊醇生成rebaudioside A甙的途徑。圖2酵母體內的UDP-葡萄糖合成代謝途徑。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 重組酵母菌的構建。1、糖基轉移酶UGT基因的獲取根據AY345974. 1基因序列，進行密碼子優化，優化后的基因序列命名為UGT由南京金思瑞公司完成基因合成。根據UGT基因序列設計引物上游引物(-sense含 EcoRI)為5 ‘ -CGGAATTCAAACAATGTCTGAAAATAAGACTGAAACTACTG-3‘下游游引物(-sense含XhoI)為5 ‘ -CCGCTCGAGTTATAATGATGAAATATAAGAAACCAA-3‘所有引物由上海申能博彩公司合成。基因的PCR條件(50 μ L體系)94°C 變性 5min ；按如下參數循環30次94°C變性30S，60°C退火30s，72°C延伸^iiin ；最后72°C延伸 lOmin。2、重組工程菌 YPH499-PYes2_UGT 獲得以合成的帶有UGT基因的質粒為模板，用引物進行PCR擴增。將UGT基因片段純化產物和PMD18-T Vector載體雙酶切膠回收產物，用T4連接酶16°C進行UGT片段純化產物與PMD18-T Vector的連接，將IOul的連接物產物PMD18-T-UGT熱擊轉化至DH5 α感受態中。轉化物涂布于含有含lOOug/mlAp的平板上，37°C培養過夜，篩選陽性克隆。獲得正確序列的克隆載體PMD18-T-UGT。分別用EcoRI和BioI雙酶切克隆載體PMD18-T-UGT和PYes2。膠回收酶切產物后進行連接反應，構建出表達載體PYes2-UGT。將鑒定后正確的陽性克隆載體PYes2-UGT與 Saccharomyces cerevisiae YPH499感受態混勻，電擊法轉化完畢后，加入ImL冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，將菌體懸液涂布于SC-U篩選培養基平板上至于30°C培養，直至單個菌落出現。
液體培養基的配方如下
完全培養基YPD :10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。
選擇培養基SC-U 6. 7g/L YNB，20g/L碳源(葡萄糖)，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/ L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸， 0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸，20g/L瓊脂(平板)。
實施例2 重組酵母菌的誘導表達。
挑取重組工程菌的單菌落到SC-U培養基中，30°C振蕩培養過夜。然后按2%接種量接種到碳源為葡萄糖(終濃度為20g/L)的新鮮培養基上，培養他，此部分為生物量的積累。然后再無菌環境中，集菌棄上清，洗菌并將菌體轉移到碳源為半乳糖(終濃度為20g/L) 的新鮮的篩選培養基中誘導。誘導時間為48h。菌液于6000rpm，4°C離心lOmin，棄上清。
其中，碳源為葡萄糖的培養基配方為6.7g/L YNB，20g/L葡萄糖，0. lg/L腺嘌呤， 0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。
其中，碳源為半乳糖的培養基配方為6.7g/L YNB，20g/L半乳糖，0. lg/L腺嘌呤， 0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。
實施例3 酶活測定方法的確立。
取實施例2中的菌體沉淀，菌體20mg，用磷酸鉀緩沖液(ρΗ7. 0)洗滌兩次，洗滌后的沉淀置液氮中研磨破碎，并用磷酸鉀緩沖液(PH7. 0)洗出，破碎后的菌液于12000rpm， 4°C離心15min。取上清即為粗酶液。精密稱取樣品，配制成1. 4ml體系，其中stevioside的終濃度為lg/L、UDP-葡萄糖為lg/L，并加入2g/L Mgcl2 ； 10mg/L BSA混勻，最后加入400 μ 1 粗酶液并加入磷酸鉀緩沖液(ΡΗ7.0)至體系為1.細1，起始反應。30°C保溫1 后，高溫煮沸終止反應。離心，取上清作為樣品。HPLC方法檢測反應體系中rebaudiosideA甙含量。 實驗結果表明，rebaudioside A的產量最高可到達到750mg/L，說明該重組工程菌能夠表達產酶并且該酶能夠催化stevioside生成rebaudioside A。
HPLC法色譜分析條件如下
色譜柱LichrospherNH2 柱 Q50mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相為乙睛水 (80 20 ；V V)；流速=ImL · mirT1 ；柱溫:40°C ；檢測波長210nm。
實施例4 建立全細胞催化反應體系。
取實施例2中的沉淀轉移至用50ml小三角瓶中，建立全細胞催化反應體系。此反應體系為10ml，其中菌體20mg。底物stevioside lg/L ；20g/L的葡萄糖；MgCl2 4g/L ；通透劑普郎尼克F-685g/L ；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調節為7. 0，200rpm, 30°C，反應4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。通過加入葡萄糖，以此利用酵母代謝途徑產生UDPG作為輔底物的方法，使得rebaudioside A的產量可到達到60mg/L。
實施例5 最佳MgCl2濃度。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L，Mgcl2，通透劑普郎尼克F-68 5g/L，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7.0。按上述方法，取六份平行樣，加入的MgCl2濃度分別為 lg/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L, 30°C，200rpm,反應 48h 后，取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中MgCl2為10g/L時，rebaudioside A產量最低為20mg/ L ；MgCl2 為 lg/L 時，rebaudioside A 的產量為 45mg/L ；MgCl2 為 6g/L 時，rebaudioside A 的產量最高為82mg/L。
實施例5 最佳普郎尼克F-68濃度。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L,Mgcl2 6g/L，通透劑普郎尼克F-68，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7.0。按上述方法，取四份平行樣，加入的普郎尼克F-68 濃度分別為化/1、58/1、1(^/1、158/1，301，200印111，反應4811后，取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中普郎尼克F-68為lg/L時rebaudioside A產量最低為 48mg/L ；普郎尼克F-68為15g/L時，rebaudioside A的產量為65mg/L ；普郎尼克F-68為 10g/L 時，rebaudioside A 的產量最高為 90mg/L。
實施例5 加入代謝調節物質UMP。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入UMP，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7. 0。取三份平行樣，加入的 UMP濃度分別為0. 5g/L、l. 5g/L、3g/L，30°C，200rpm，反應48h后，取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中UMP為0. 5g/L時，rebaudioside A產量最低為56mg/L ； UMP 為 3g/L 時，rebaudioside A 的產量為 91mg/L ；UMP 為 1. 5g/L 時，rebaudioside A 的產量最高為115mg/L。
實施例6 加入代謝調節物質丁二酸。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入5. 4g/L NaOH，丁二酸，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7. 0。取六份平行樣，加入的丁二酸濃度分別為 5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L，30°C，200rpm，S 應4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中丁二酸為5g/L時， rebaudioside A產量最低為 105mg/L ；丁二酸為 10g/L時，rebaudioside A的產量為 175mg/ L ；丁二酸為 9g/L 時，rebaudioside A 的產量最高為 180mg/L。
實施例7 加入代謝調節物質乳清酸。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中， 加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克F_68 10g/L，并加入乳清酸；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7.0。取五份平行樣，加入的乳清酸濃度分別為lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，30°C，200rpm，反應48h后，取樣品離心， 將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中乳清酸為5g/L時，rebaudioside A產量最低為80mg/L ；乳清酸為lg/L時，rebaudioside A的產量為203mg/L ；乳清酸為2g/L時，rebaudioside A 白勺/^ ! 270mg/L。
實施例8 加入代謝調節物質檸檬酸。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L，MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入檸檬酸；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7. O。取五份平行樣，加入的檸檬酸濃度分別為10g/L、12g/L、15g/L、18g/L、20g/L，30 °C，200rpm,反應4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中檸檬酸為10g/L時，rebaudioside A產量最低為45%ig/L ；檸檬酸為20g/L時，rebaudioside A的產量為625mg/L ；檸檬酸為15g/ L rebaudioside A 白勺/^ ! 675mg/L。
實施例9:最佳反應PH。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, MgCl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入檸檬酸15g/L，用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，按上述方法共做五個平行樣，其中PH分別調至6. 8、7. 0、7. 2、7. 5、7. 8。于30°C，200rpm進行催化反應，反應48h后， 取樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中pH為7. 8時，rebaudioside A 的產量最低，為306mg/L ；pH為6. 8時，rebaudioside A的產量為698mg/L ；pH為7. 2時， rebaudioside A的產量達到最高，為705mg/L。
實施例10 最佳反應溫度。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, Mgcl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L，并加入檸檬酸15g/L ；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7. 2。按上述方法取五份平行樣分別于不同溫度下進行反應，251、301、371、421，200印111，反應4 后，取樣品離心，將上清樣品被存在-20°C備于液相分析。其中25°C時，rebaudiosideA的產量最低為 78mg/L ；42°C時，rebaudioside A 的產量為 750mg/L ；37°C時，rebaudiosideA 的產量達到最高，為835mg/L。
實施例11 最佳反應時間。
取實施例2中的菌體沉淀20mg，按照實例4的方法，轉移至用50ml小三角瓶中，加入終濃度為20g/L的葡萄糖，底物stevioside lg/L, Mgcl2 6g/L，通透劑普郎尼克 F-6810g/L,并加入檸檬酸15g/L ；用磷酸鉀緩沖液定容至10ml，pH調至7. 2。于37°C， 200rpm進行催化反應，分別于反應12h、Mh、36h、48h、60h、72h、84h、96取樣，樣品離心，將上清樣品被存在_20°C備于液相分析。其中在1 時，rebaudioside A產量最低，為178mg/ L ；48h 時，rebaudioside A 的產量為 867mg/L ；72h 時，rebaudioside A 的產量達到最高，為 875mg/L。
權利要求
1.一種產甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的基因工程菌，其特征在于它是將UGT76G1編碼基因插入Phs2載體的EcoRI和BioI酶切位點之間，構建了重組質粒，再將重組質粒導入表達宿主釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；其中，所述的UGT76G1編碼基因為GenBank，No. GenBank :AY345974. 1，該基因序列命名為 UGT。
2.權利要求1所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)用限制性內切酶EcoRI和Ml I雙酶切UGT基因片段和PYes2載體，連接UGT基因片段純化產物與載體，得到重組質粒PYes2-UGT ；2)將重組質粒PYes2_UGT轉化至DH5α感受態細胞，得到重組大腸桿菌 DH5 α -Phs2_UGT，選取陽性克隆；3)將鑒定后的陽性克隆的質粒導入釀酒酵母&iccharomycescerevisiaeYPH499中， 得到基因工程菌YPH499-Phs2-UGT。
3.權利要求1所述的基因工程菌的誘導表達方法，其特征在于，以半乳糖為誘導劑誘導基因工程菌產酶。
4.根據權利要求3所述的基因工程菌的誘導表達方法，其特征在于，將基因工程菌按 2 5%接種量接種到碳源為20g/L葡萄糖的培養基上，培養8 16h，然后收集菌體，將菌體轉移到碳源為20g/L半乳糖的培養基中誘導，誘導時間為48 60h ；所述的碳源為20g/ L葡萄糖的培養基配方為6. 7g/L YNB，20g/L葡萄糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. Ig/ L半胱氨酸，0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸；所述的碳源為20g/L半乳糖的培養基配方為6. 7g/L YNB, 20g/L半乳糖，0. lg/L腺嘌呤，0. lg/L精氨酸，0. lg/L半胱氨酸， 0. lg/L亮氨酸，0. lg/L賴氨酸，0. lg/L蘇氨酸，0. lg/L色氨酸，0. 05g/L天冬氨酸，0. 05g/L 組氨酸，0. 05g/L異亮氨酸，0. 05g/L甲硫氨酸，0. 05g/L苯丙氨酸，0. 05g/L脯氨酸，0. 05g/L 絲氨酸，0. 05g/L酪氨酸，0. 05g/L纈氨酸。
5.權利要求1所述的基因工程菌在生產萊鮑迪甙A中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，利用全細胞催化法，將甜菊甙轉化為萊鮑迪甙A。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，以誘導表達后的基因工程菌為全細胞催化劑，通過加入表面活性劑改變細胞的通透性，以甜菊甙和葡萄糖為底物，添加鎂離子以及調節代謝物質，反應得到萊鮑迪甙A。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，基因工程菌的用量按濕菌體計為2g/L； 葡萄糖的用量為20g/L ；甜菊甙的用量為lg/L ；所述的表面活性劑為普郎尼克F-68，用量為 1 10g/L ；鎂離子使用MgCl2,用量為1 10g/L。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的調節代謝物質為UMP、丁二酸、乳清酸或檸檬酸，UMP用量為0. 5 3g/L，丁二酸用量為5 10g/L，乳清酸用量為1 5g/L，檸檬酸用量為10 20g/L。
10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的反應在磷酸鉀緩沖液體系中完成，反應pH6. 8 7. 8，反應溫度25 42°C，反應時間1 96h。
全文摘要
本發明公開了一種產甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的基因工程菌，它是將UGT76G1編碼基因插入PYes2載體的EcoRI和XhoI酶切位點之間，構建了重組質粒，再將重組質粒導入表達宿主釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeYPH499中得到的工程菌；其中，所述的UGT76G1編碼基因為GenBank，No.GenBankAY345974.1，該基因序列命名為UGT。本發明還公開了上述基因工程菌的構建方法及在生產萊鮑迪甙A中的應用。本發明在不外加昂貴UDPG的情況下，以廉價碳源葡萄糖為底物，調節酵母體內UDPG的代謝途徑，全細胞催化St甙生成rebaudioside A。
文檔編號C12R1/865GK102559528SQ201210029158
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者嚴明, 劉歡, 安明東, 安芳芳, 李艷, 王珊珊, 許昇, 許琳, 郝寧, 郝思清, 顧金海, 魏淼 申請人:南京工業大學