專利名稱：一種白藜蘆醇多聚體的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種植物生物活性物質的制備方法，具體地說是一種白藜蘆醇多聚體的制備方法。
背景技術：
白藜蘆醇(Resveratrol，簡稱Res)，化學名為3，4，，5-三羥基二苯乙烯(3，4，， 5-trihydrolystilbene)，為無色針狀晶體，熔點256-257°C，升華溫度洸1°C。易溶于乙醚、 氯仿、甲醇、丙酮等。是植物體內一種天然的二苯乙烯類多酚物質，在自然界中多以單體及糖苷形式存在，一般有四種異構形式順反式白藜蘆醇和順反式白藜蘆醇，其中反式異構體的生物活性強于順式異構體，在紫外線照射下反式異構體能夠轉化為順式異構體。白藜蘆醇氧化后形成的低聚物(包括二聚體、三聚體等)統稱viniferins，它們是植物在惡劣環境中或遭到病原體侵染時所分泌的植物抗毒素。在體外可通過化學和酶氧化白藜蘆醇而得到，如用自由基DPPH處理，得到一種白藜蘆醇二聚體(δ -viniferin)，用 FeCl3處理，得到得到一個同質異構的二聚體(ε-viniferin)；還可以被灰霉菌純化的漆酶、山葵的過氧化物酶、大豆的酯氧合酶催化形成二聚體，如下式所示
o-viniferin白藜蘆醇的不同聚合物對霜霉病菌均具有不同殺傷力，也具有更強的保護心血管和抗癌的潛在活性。另有研究表明，viniferins等芪類化合物對阿爾茨海默癥的盡淀粉質纖維也有體外抑制作用。白藜蘆醇聚合物viniferins的體外合成方法可以分為生物合成和化學合成兩類。已見報道的生物合成主要包含以下四種途徑(1)使用真菌產生的類似漆酶的芪合物氧化酶，將白藜蘆醇氧化成聚合物δ-viniferin。( 分別用嗜熱甲烷八疊球菌和絨毛栓菌產生的漆酶與白藜蘆醇作用，催化合成了 3-“1^作1^11，反應2411后產量可分別達到 31%和18%。C3)經辣根過氧化物酶處理后，白藜蘆醇亦可被催化脫氫生成δ-viniferin。 (4)利用大豆脂肪氧化酶也可氧化白藜蘆醇合成δ-viniferin。化學合成法有研究采用 DPPH處理白藜蘆醇，得到了二聚體δ-viniferin，產量達18%。
發明內容
本發明旨在提供一種產物收率和純度都較高的酶氧化法制備白藜蘆醇低聚體的方法，所要解決的技術問題是遴選酶氧化法所需的氧化酶。本發明選擇的氧化酶是普遍存在于茶葉中的茶多酚氧化酶。本發明的技術方案是以白藜蘆醇為原料，包括茶多酚氧化酶的提取和氧化反應以及分離、濃縮各單元過程，與現有技術的區別是所述的氧化反應是向質量百分濃度4-8% 的白藜蘆醇溶液中加入酶活力》10U/L的茶多酚氧化酶，使茶多酚氧化酶質量百分濃度 > 5%，于25-55°C下攪拌反應25-135min，反應結束后用丙酮萃取，丙酮相減壓濃縮至干得到白藜蘆醇低聚體viniferins。茶多酚氧化酶是這樣制備的用綠茶鮮葉，超低溫凍干粉碎茶葉后，加30%丙酮水溶液溶解，棄去沉淀，上清液低溫加入過量丙酮，低溫離心，沉淀為茶葉多酚氧化酶。酶活力是這樣測定的以藜蘆醇為底物，3mL反應混合液中，含50mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH = 4. 5) 2. 4mL, lmmol/L底物和0. 6mL粗酶液(提取液經10000r/min離心IOmin 后取上清液作為粗酶液)，30°C水浴保溫反應30min，于465nm處測定吸光度G65nm處藜蘆醇摩爾消光系數ξ 465 = 1. 21 X IO4L · mo Γ1 · cm—1)，以100°C滅活的酶反應混合液為對照。 酶活定義為每分鐘內催化氧化1 μ mol藜蘆醇的酶量為1個酶活單位(U/L)。本方法原料易得，工藝簡單，產物得率> 50%，純度> 85% (高效液相檢測)。液相色譜分析表明本低聚體主要為二聚體、三聚體和四聚體。如圖2所示。
四
圖1是液質聯用圖譜中的液相色譜，出峰時間11. 64分鐘是白藜蘆醇低聚體的特征峰。圖2液相譜圖中特征峰所含各物質的分子量數據，即質譜分子離子峰，樣品中所含m/z分別為453. 1,499. 1、680. 2和907. 2的物質依次是白藜蘆醇二聚體、三聚體和四聚體。圖3是合成產物(白藜蘆醇低聚體)液相色譜圖，產物純度達90%。
五具體實施例方式取質量百分濃度5%的白藜蘆醇溶液lOOOmL，加入酶活力為10U/L的茶多酚氧化酶100g，于40°C攪拌反應30min，反應結束后用丙酮萃取兩次，合并丙酮相，減壓蒸餾回收丙酮，得到白藜蘆醇低聚體27. 5克，得率55 %，純度90 %。高效液相色譜檢測條件波長為310nm，流速為lmL/min，流動相為乙睛水05 75)，采用C18柱(4. 6X150mm)。質譜檢測條件ESI ( —)電噴霧離子源(負離子模式)，干燥氣的溫度為350°C， 干燥氣的流速為8L/min，霧心氣壓力為40ps。
權利要求
1. 一種白藜蘆醇多聚體的制備方法，以白藜蘆醇為原料，包括茶多酚氧化酶的提取和氧化反應以及分離、濃縮各單元過程，其特征在于所述的氧化反應是向質量百分濃度 4-8%的白藜蘆醇溶液中加入酶活力> 10U/L的茶多酚氧化酶，使茶多酚氧化酶質量百分濃度彡5%，于;35-55°C下攪拌反應25-i;35min。
全文摘要
一種白藜蘆醇多聚體的制備方法，以白藜蘆醇為原料，包括茶多酚氧化酶的提取和氧化反應以及分離、濃縮各單元過程，其特征在于所述的氧化反應是向質量百分濃度4-8％的白藜蘆醇溶液中加入酶活力≥10U/L的茶多酚氧化酶，使茶多酚氧化酶質量百分濃度≥5％，于35-55℃下攪拌反應25-135min。本方法原料易得，工藝簡單，產物得率≥50％，純度≥85％。本多聚體主要為二聚體、三聚體和四聚體。
文檔編號C12P17/18GK102559797SQ20121003452
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者尹若春, 王林 申請人:安徽大學