專利名稱：尼羅羅非魚性染色體特異分子標記的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及魚類性染色體特異分子標記及遺傳性別鑒定方法，特別涉及羅非魚性染色體特異分子標記及遺傳性別鑒定方法。
背景技術：
我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類品種在生長速率上存在著性別差異，有的品種雌性個體比雄性個體生長快^Tl(Km)，如牙鲆、半滑舌鰨、圓斑星鰈、南方鲇等；有的品種雄性個體比雌性個體生長快00%以上)，如黃顙魚、羅非魚等。開展這些魚類品種遺傳性別鑒定和性別控制技術研究既有重要的科學意義，又有廣闊的應用前景。羅非魚具有食性雜、生長快、繁殖強、味道鮮美且肌間刺少等優良特征，是世界水產業重點科研培養的淡水養殖魚類，目前養殖品種主要有莫桑比克羅非魚、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚和吉富羅非魚等。其中，尼羅羅非魚(Preochromis Niloticus)體型較大、生長較快，是聯合國推薦養殖的優質水產養殖品種，現已成為世界性的主要養殖魚類品種之一， 產量逐年遞增。由于羅非魚雄魚比雌魚生長快約50%，且羅非魚的銷售價格與其個體大小有很大關系，體重40(T500g的羅非魚售價要比體重800g以上的羅非魚低40%左右，因此，如果能夠在育種中人工控制羅非魚的性別，培育出全雄羅非魚，將大大提高羅非魚的養殖產量，降低養殖成本，提高經濟效益。傳統生產全雄魚主要通過人工選育、雄性激素直接誘導性逆轉等，但這些方法都存在缺陷，如人工選育工作量大，準確性差；雄性激素直接誘導性逆轉存在食品安全性問題等。目前，國內普遍采用種間雜交(主要是尼羅羅非魚早X奧利亞羅非魚$ )的方法培育全雄羅非魚，雄性率為90、5%，仍有相當數量的雌魚。最近有研究者先利用魚類性逆轉技術獲得XY生理雌魚，再通過XY生理雌魚雌核發育產生了 YY超雄魚，由此建立起兩個成熟的繁育體系YY超雄魚繁育體系(YY超雄魚與 XY生理雌魚交配，生產YY超雄魚)和全雄魚繁育體系(YY超雄魚與XX雌魚交配，生產全雄魚)，從而可利用YY超雄魚持續生產全雄魚。但由于YY超雄魚繁育體系在產生YY超雄魚的同時也產生數量相當的XY雄魚，而區分YY超雄魚和XY雄魚的傳統方法是在測交實驗后根據測交子代性別比例來判斷其父本為YY超雄魚或XY雄魚，測交子代需要養殖3個月以上才能解剖根據組織學判斷其性別，存在實驗周期長、養殖成本高、不利于規模化生產等缺陷。因此，如何經濟、快捷、準確地區分YY超雄魚和XY雄魚，成為利用該技術規模化生產全雄魚的關鍵問題。隨著DNA分子標記技術的發展和成熟，利用DNA分子標記進行遺傳性別鑒定成為可能，但前提是要篩選到性別特異的DNA分子標記。此外，魚類的性別特異分子標記通常具有物種或者品系特異性，一種魚類的性別特異分子標記通常不能跨物種使用。目前，在一些經濟魚類中，通過各種DNA分子標記技術如隨機擴增產物多態性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、擴增的限制性片斷長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)等篩選性別特異分子標記已有文獻報道，如=Kovacs等利用RAPD掃描非洲鯰魚、Clarias gariepinus)雌、雄基因池，找到兩個與雄性性別相關的RAPD標記；Sakamoto等發現兩個SSR標記(0myreT19 TUF和0myRGT28 TUF)與雄性虹鱒(Pncorhynchus mykiss)的性別決定位點相連鎖。此外， 還有以下研究報道Lee等用集團分離分析法找到10個與羅非魚表型性別連鎖的SSR標記，這些標記可直接用于不同Y染色體等位基因功能的研究和具有一個或幾個Y染色體拷貝的親魚的鑒定出zaz等用AFLP掃描尼羅羅非魚基因組，找到3個Y染色體連鎖AFLP標記(0niY425、0niY382和0niY227)和1個X染色體連鎖AFLP標記(0niX420)，但這些標記的性別特異性不強，不適用于尼羅羅非魚的遺傳性別鑒定。因此，迄今為止，全世界尚未發現可用于尼羅羅非魚遺傳性別鑒定的性染色體特異分子標記。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供尼羅羅非魚的性染色體特異分子標記，特異性強，適用于尼羅羅非魚的遺傳性別鑒定。為達到此目的，本發明提供如下技術方案尼羅羅非魚性染色體特異分子標記，Y 染色體特異分子標記NtYl的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，Y染色體特異分子標記NtY2 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，X染色體特異分子標記NtXl的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。在此基礎上，本發明的目的之二在于提供利用所述尼羅羅非魚性染色體特異分子標記進行尼羅羅非魚遺傳性別鑒定的方法，操作簡便、省時、成本低，能夠經濟、快捷、準確地區分YY超雄魚和XY雄魚，有助于通過YY超雄魚培育路線實現全雄羅非魚魚苗的規模化生產，顯著提高羅非魚的養殖產量，降低養殖成本，提高經濟效益，在滿足日益增長的市場需求的同時加快農村發展。為達到此目的，本發明提供如下技術方案利用所述尼羅羅非魚性染色體特異分子標記進行尼羅羅非魚遺傳性別鑒定的方法，包括以下步驟
a、PCR克隆剪取待測尼羅羅非魚的鰭條，提取基因組DNA；以所得基因組DNA為模板， PCR擴增下述尼羅羅非魚性染色體特異分子標記中的任一個或多個Y染色體特異分子標記NtYl、Y染色體特異分子標記NtY2和X染色體特異分子標記NtXl ；
b、結果判斷當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中擴增出Y染色體特異分子標記NtYl 和/或NtY2時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的雄魚，性染色體基因型為XY或YY ；當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2以及X 染色體特異分子標記NtXl時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的雄魚，性染色體基因型為XY ；當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2 而未擴增出X染色體特異分子標記NtXl時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的超雄魚， 性染色體基因型為YY ；當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中未擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2而擴增出X染色體特異分子標記NtXl時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的雌魚，性染色體基因型為XX。
進一步，步驟a中所述Y染色體特異分子標記NtYl的PCR擴增引物為NtYFl與 NtYR, Y染色體特異分子標記NtY2的PCR擴增引物為NtYFl與NtYMR8，X染色體特異分子標記NtXl的PCR擴增引物為NtYFl與NtXFR8 ；所述引物NtYFl的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示，引物NtYR的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，引物NtYMR8的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，引物NtXFR8的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。本發明的有益效果在于本發明先采用AFLP分子標記技術篩選出尼羅羅非魚Y染色體特異AFLP標記并將其轉化成方便使用的序列特異性擴增區(SCAR)標記，再采用基因組掃描技術篩選出尼羅羅非魚性染色體特異分子標記，并據此建立了尼羅羅非魚的遺傳性別鑒定方法，該方法具有特異性強、操作簡便、省時、成本低等優點，能夠經濟、快捷、準確地區分YY超雄魚和XY雄魚，有助于通過YY超雄魚培育路線實現全雄羅非魚魚苗的規模化生產，顯著提高羅非魚的養殖產量，降低養殖成本，提高經濟效益，在滿足日益增長的市場需求的同時加快農村發展。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述。圖1為應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記 NtYl和NtY2對12尾尼羅羅非魚雌魚(12XX)、12尾尼羅羅非魚雄魚(12XY)和7尾尼羅羅非魚超雄魚(JTi)進行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對照，M表示DNA分子量標準DL2000。圖2為應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記 NtYl和NtY2對19尾XX尼羅羅非魚雜交后代進行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對照， M表示DNA分子量標準DL2000。圖3為應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記 NtYl和NtY2對20尾XY尼羅羅非魚雜交后代進行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對照， M表示DNA分子量標準DL2000。圖4為應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記 NtYl和NtY2對20尾尼羅羅非魚測交后代(父本性染色體基因型未知)進行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對照，M表示DNA分子量標準DL2000。圖5為3尾尼羅羅非魚雌魚(XXI-廣XX1_3)、3尾尼羅羅非魚雄魚(XY1-廣XY1-3) 和3尾尼羅羅非魚超雄魚(ΥΥ1-ΓΥΥ1-3)基因組的性別特異多態位點序列比對分析，其中方框處為性別特異多態位點。
具體實施例方式下面將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、尼羅羅非魚性染色體特異分子標記的獲得 1、尼羅羅非魚性染色體特異AFLP標記的篩選和克隆 (1)基因組DNA的提取剪取尼羅羅非魚鰭條 10mg，置裂解液[IOmM Tris-HCl (pH8. 0)+IOOmM EDTA (ρΗ8· 0) +IOOmM NaCl+5mg/ml SDS] 600 μ 1中勻漿，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K和終濃度為 100 μ g/ml的核糖核酸酶A (RNaseA)，55°C水浴消化至澄清，再加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比為25:24:1) 600 μ 1抽提DNA，充分混勻后于12000rpm離心10分鐘，吸取上清液，再次加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比為25:24:1)抽提DNA，離心，吸取上清液，加入冰乙醇1000 μ 1沉淀DNA，離心，棄上清液，DNA沉淀經體積分數為70%的乙醇洗滌、 自然干燥后，用TE緩沖液溶解制成濃度為20ng/y 1的溶液(ODa5tlA)D28tl=L 76 1. 80),-20 °C 保存備用。(2)基因組DNA的AFLP分析和性染色體特異AFLP標記的篩選
用終濃度為1. 25U/y 1的^CbaI和Msel限制性內切酶混合物對8(Tll0ng所得基因組 DNA進行雙酶切，37°C反應6小時后，70°C保溫15分鐘滅活限制性內切酶。向所得酶切產物中加入XbaI和MseI接頭混合物12 μ 1和Τ4 DNA連接酶0. 5 μ 1，20°C孵育20小時使特異接頭連接到酶切片段上。將所得連接產物稀釋10倍后作為預擴增模板，采用3’末端帶有一個選擇性堿基(A或C)的^CbaI預擴增引物和MseI預擴增引物進行PCR預擴增。將所得預擴增產物稀釋20倍后作為選擇性擴增模板，分別采用由3’末端帶有三個選擇性堿基的 16個^CbaI選擇性擴增引物和16個MseI選擇性擴增引物兩兩組合而成的256個引物組合進行PCR選擇性擴增。向所得選擇性擴增產物中加入適量上樣緩沖液，94°C變性5分鐘后， 用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電泳條件為電壓1500V，功率40W，電流40mA， 溫度45°C，時間3. 5小時，對電泳后產生的DNA條帶進行觀察，照相和分析。采用上述方法分別對12尾尼羅羅非魚XX雌魚、12尾尼羅羅非魚XY雄魚和7尾尼羅羅非魚YY超雄魚的基因組DNA進行AFLP分析。結果發現，256個引物組合中有1個引物組合在所有XY個體和YY個體的基因組DNA中均擴增出一條特異片段，而在所有XX個體的基因組DNA中均沒有擴增出該片段，因此，該特異片段即為篩選出的Y染色體特異AFLP片段。(3)性染色體特異AFLP標記的克隆和序列分析
用刀片切下含有上述Y染色體特異AFLP片段的聚丙烯酰胺凝膠，回收目的片段，將其克隆入PMD-19T載體，再轉化大腸桿菌感受態細胞，用藍白斑篩選法篩選陽性克隆，挑取白斑單菌落，用PCR法鑒定陽性克隆，并用ABI3730測序儀進行測序。將來自5個陽性克隆的相同長度的核苷酸序列用DNAMAN 4. O軟件進行多重比對，結果發現，這5個序列的同源性分別為 99. 38% 和 99. 56%ο2、將尼羅羅非魚性染色體特異AFLP標記轉化為SCAR標記
根據上述Y染色體特異AFLP片段的核苷酸序列設計如下特異引物NtYFl 5，-tgaggtcgtccatctgcc-3，(SEQ ID No. 4)和 NtYR :5，_acaaacttcacacaaaacaaa_3，(SEQ ID No. 5)。采用引物組合NtYFl+NtYR分別對12尾尼羅羅非魚XX雌魚、12尾尼羅羅非魚 XY雄魚和7尾尼羅羅非魚YY超雄魚的基因組DNA進行PCR擴增，所得PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖1所示，引物組合NtYFl+NtYR能夠在所有XY個體和YY個體的基因組DNA中均擴增出一條長約529bp的特異片段，而在所有XX個體的基因組DNA中均沒有擴增出該片段，說明該特異片段(SEQ ID No. 1)是Y染色體特異SCAR標記，將其命名為 NtYl。
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3、應用基因組掃描技術篩選尼羅羅非魚性染色體特異分子標記
根據上述獲得的Y染色體特異SCAR標記，結合基因組掃描技術，對大量尼羅羅非魚 XX、XY和YY個體進行基因組擴增，結果成功篩選到兩個性別特異多態位點，如圖5所示，在 XXU ΧΧ2和ΧΧ3個體中全部為CT，在ΧΥ1、ΧΥ2和ΧΥ3個體中既有TC也有CT，而在ΥΥ1、ΥΥ2 和ΥΥ3個體中全部為TC。根據上述兩個性別特異多態位點設計如下特異引物NtYMR8 :5’ -aatttttttacat act-gcacaatga-3‘ (SEQ ID No. 6), NtXFR8 5' -aatttttttacatactgcacaatag-3' (SEQ ID No. 7)。分別采用引物組合NtYFl+NtYMR8、NtYFl+NtXFR8對12尾尼羅羅非魚XX雌魚、12尾尼羅羅非魚XY雄魚和7尾尼羅羅非魚YY超雄魚的基因組DNA進行PCR擴增，所得PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖1所示，引物組合NtYFl+NtYMR8能夠在所有XY個體和YY個體的基因組DNA中均擴增出一條長約577bp的特異片段，而在所有XX個體的基因組DNA中均沒有擴增出該片段，說明該特異片段(SEQ ID No. 2)是Y染色體特異分子標記，將其命名為NtY2 ；引物組合NtYFl+NtXFR8能夠在所有XX個體和XY個體的基因組DNA 中均擴增出一條長約的特異片段，而在所有YY個體的基因組DNA中卻沒有擴增出該片段，說明該特異片段(SEQ ID No. 3)是X染色體特異分子標記，將其命名為NtXl。二、尼羅羅非魚的遺傳性別鑒定
剪取待測尼羅羅非魚的鰭條，按照前述方法提取基因組DNA;以所得基因組DNA為模板，PCR擴增下述尼羅羅非魚性染色體特異分子標記中的任一個或多個Y染色體特異分子標記NtYl (引物組合為NtYFl+NtYR)、Y染色體特異分子標記NtY2(引物組合為 NtYFl+NtYMR8)和X染色體特異分子標記NtXl (引物組合為NtYFl+NtXFR8) ；PCR條件為 94°C預變性3分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒，共38個循環，最后72°C延伸10分鐘；所得PCR產物進行1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的雄魚，性染色體基因型為XY或YY ；當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2以及X染色體特異分子標記NtXl時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的雄魚，性染色體基因型為XY ；當從待測尼羅羅非魚的基因組 DNA中擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2而未擴增出X染色體特異分子標記 NtXl時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的超雄魚，性染色體基因型為YY ；當從待測尼羅羅非魚的基因組DNA中未擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和/或NtY2而擴增出X染色體特異分子標記NtXl時，則判斷該待測尼羅羅非魚為遺傳上的雌魚，性染色體基因型為 XX。圖2示出了應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2對19尾尼羅羅非魚XX(早)XXX( $ )雜交后代進行遺傳性別鑒定的結果。由圖可知，在所有待測尼羅羅非魚和對照XX個體中都沒有擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2，而在對照XY和YY個體中都擴增出了 Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2 ； 在所有待測尼羅羅非魚以及對照XX和XY個體中都擴增出了 X染色體特異分子標記NtXl， 而在對照YY個體中沒有擴增出X染色體特異分子標記NtXl ；說明19尾待測尼羅羅非魚均為遺傳上的XX雌魚，與理論結果一致。圖3示出了應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2對20尾尼羅羅非魚XX(早)XYY( $ )雜交后代進行遺傳性別鑒定的結果。由圖可知，在所有待測尼羅羅非魚以及對照XY和YY個體中都擴增出了 Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2，而在對照XX個體中沒有擴增出Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2 ； 在所有待測尼羅羅非魚以及對照XX和XY個體中都擴增出了 X染色體特異分子標記NtXl， 而在對照YY個體中沒有擴增出X染色體特異分子標記NtXl ；說明20尾待測尼羅羅非魚均為遺傳上的XY雄魚，與理論結果一致。圖4示出了應用尼羅羅非魚X染色體特異分子標記NtXl以及Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2對20尾尼羅羅非魚測交后代(父本性染色體基因型未知)進行遺傳性別鑒定的結果。由圖可知，在廣5、7 10、12、15、17、18、19號待測尼羅羅非魚以及對照XY和 YY個體中都擴增出了 Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2，而在對照XX個體中沒有擴增出 Y染色體特異分子標記NtYl和NtY2 ；在所有待測尼羅羅非魚以及對照XX和XY個體中都擴增出了 X染色體特異分子標記NtXl，而在對照YY個體中沒有擴增出X染色體特異分子標記 NtXl ；說明1 5、7 10、12、15、17、18、19號待測尼羅羅非魚均為遺傳上的XY雄魚，而6、11、 13、14、16,20號待測尼羅羅非魚均為遺傳上的XX雌魚。同時，發明人對這20尾尼羅羅非魚測交后代的性腺進行了組織學切片及HE染色觀察，證實本發明方法的鑒定結果與組織學切片鑒定結果完全吻合。由此可以推知，用于測交實驗的未知父本性染色體基因型為XY。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.尼羅羅非魚性染色體特異分子標記，其特征在于為X染色體特異分子標記Ntxi，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及尼羅羅非魚性染色體特異分子標記，即X染色體特異分子標記NtX1，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；通過PCR擴增X染色體特異分子標記NtX1與Y染色體特異分子標記NtY1和/或NtY2，能夠經濟、快捷、準確地區分YY超雄魚、XY雄魚以及XX雌魚，有助于通過YY超雄魚培育路線實現全雄羅非魚魚苗的規模化生產，顯著提高羅非魚的養殖產量，降低養殖成本，提高經濟效益。
文檔編號C12N15/11GK102533751SQ20121003780
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者葉凱, 孫運侶, 曾圣, 王德壽, 黃寶鋒 申請人:西南大學