專利名稱：用于鑒定acc脫氨酶結構基因的引物及方法
技術領域：
本發明屬于應用微生物技術領域，具體涉及針對微生物1-氨基環丙烷-1羧酸 (ACC)脫氨酶結構基因設計的通用特異性簡并引物和用聚合酶鏈式反應(PCR)從根瘤菌等細菌中擴增ACC脫氨酶結構基因(acdS)的方法。
背景技術：
植物遭受旱澇、鹽堿、高低溫、重金屬等逆境脅迫和病原微生物侵染會應激產生大量植物激素乙烯。高水平的乙烯會抑制植物根伸長、促植物器官衰老和脫落、加重病癥。ACC 是植物合成乙烯的直接前體。有些定殖在植物體內外的細菌能吸收植物細胞分泌出來的 ACC,并用ACC脫氨酶催化ACC脫氨基反應，生成α -酮丁酸和NH3作為細菌生長所需的碳氮源。與此同時，植物細胞內的ACC濃度下降，相應地ACC氧化成乙烯的量降低，從而消減在逆境下乙烯對植物生長的抑制，延緩植物器官的衰老或病害的發展。由于植物不能靠運動選擇適宜生長的地方而免不了生長在逆境中，與植物緊密聯合的有ACC脫氨酶的細菌往往會比有固氮、溶磷或分泌鐵載體等特性的細菌更易產生促植物生長的效應；ACC脫氨酶也就被認為是細菌促植物生長的一種重要特性(Glick et al. Critical Reviews of Plant Sciences 2007,26 :227-242)。隨著全球氣候變暖，自然災害頻發，環境污染日益嚴重，利用微生物幫助植物抗逆和修復污染的土壤和水體受到人們的重視，大量的有ACC脫氨酶的細菌被分離和篩選出來，顯示出促植物生長、抗逆和清除污染物的效益。根瘤菌與豆科植物共生體系的固氮能力是自然界多種生物固氮體系中最強的，固氮量占地球生物固氮量的65%以上。根瘤菌若能高效結瘤和固氮，一方面侵染力要強，能夠躲避或壓制植物把根瘤菌作為外來入侵物而產生的防衛反應，另一方面要適應植物的生存環境，能耐受干旱、高鹽、偏酸堿或高低溫等逆境或稱非生物脅迫。篩選能耐受非生物脅迫的根瘤菌只需操作自由培養狀態的根瘤菌，相對便捷。篩選侵染力強的根瘤菌，通常要逐一接種相應的豆科植物，培養一段時間后，檢測根部的結瘤數和接種根瘤菌的占瘤率；若要從數量較多的根瘤菌菌株中篩選出侵染力強的菌株往往需要較大的培養空間，耗時耗力。早在20世紀70年代就有研究發現乙烯抑制根瘤菌結瘤和固氮，90年代的研究發現根瘤菌侵染引發豆科植物產生ACC和乙烯，近十年的研究發現有些根瘤菌有ACC脫氨酶，它們的ACC脫氨酶結構基因(accK)在根瘤中的表達量很高，如果把根瘤菌的acdS敲除，根瘤菌的結瘤能力會顯著降低(Uchiumi et al. Journal of Bacteriology 2004,186 2439-2448)；相反，如果向原本沒有ACC脫氨酶的根瘤菌導入acdS，那根瘤菌工程菌的結瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株(Ma et al. Applied and Environmental Microbiology 2004,70 :5891-5897)。有一研究檢測了 10個商業化生產應用的根瘤菌菌株發現有一半(5個)的菌株有acdS和ACC脫氨酶活性(Ma et al. Antonie van Leeuwenhoek 2003,83 :285-291)。這些研究都表明有ACC脫氨酶的根瘤菌有強的侵染力，能高效結瘤；篩選有ACC脫氨酶的根瘤菌能更可預測地實現與豆科植物高效結瘤固氮。ACC脫氨酶在多個綱目的細菌和真菌中存在。檢測細菌是否有ACC脫氨酶通常用含有ACC的培養基來培養細菌并誘導細菌的ACC脫氨酶活性，再用比色法檢測ACC脫氨酶催化ACC脫氨的產物-α -酮丁酸。但有研究發現有些根瘤菌有acdS，但在自生狀態下沒有 ACC 脫氨酶活性(Ma et al. Antonie van Leeuwenhoek 2003，83 :285-291)，只在與豆科植物共生的根瘤中表達 acdS(Uchiumi et al. Journal of Bacteriology 2004， 186 :2439-2448 ；Nukui et al. Applied and Environmental Microbiology 2006,72 4964-4969)。這樣，要鑒定細菌是否有ACC脫氨酶，從分子水平檢測細菌是否有acdS是比檢測細菌是否有ACC脫氨酶活性更穩妥的方法。檢測細菌是否有acdS可以用DNA雜交法或PCR擴增法。PCR擴增比DNA雜交在實驗操作上要簡便得多，快得多，費用也低，所以更適合用來從大量菌株中篩選有acdS的細菌。PCR技術作為分子生物學最常用的技術，經廣泛持續的研發，效率越來越高，操作越來越簡便，費用越來越低。如有些商業化的2XPCR預混液中加入了增強劑和優化劑，顯著提高了 PCR反應的特異性和靈敏度，還能有效擴增GC含量高、有二級結構等復雜模板，降低了對PCR條件的要求；反應前只需向2XPCR預混液加入引物、模板和用純水補足反應體積，降低了取樣誤差，提高了檢測重復性。已有一些研究設計了用PCR法擴增細菌acdS完整或部分序列的簡并引物，但還沒有特異性和廣譜性兼備的引物。有針對Miizobium屬根瘤菌的acdS設計的引物，但對 Rhizobium屬不同種的根瘤菌要用不同的引物對(Duan et al. Microbial Ecology 2009， 57 :423-436),廣譜適用性差。有的引物是針對β-和Y _變形桿菌綱細菌的acdS設計的(Blaha et al. FEMS Microbiology Ecology 2006,56 :455-470 ；Shah et al. Canadian Journal of Microbiology 1998,44 :833-843)，對有些屬于α -變形桿菌綱的根瘤菌不適用，而且對有些有ACC脫氨酶活性的β-和Y-變形桿菌綱細菌，也不能從中擴增出 acdS (Shah et al. Canadian Journal of Microbiology 1998,44:833-843)。有的廣譜引物簡并度太高，特異性差，能擴增到非ACC脫氨酶的ACC脫氨酶同源蛋白的基因，如D-半胱氨酸脫巰基酶的基因(Hontzeas et al. Applied and EnvironmentalMicrobiology 2005, 71 :7556-7558)。已有研究表明ACC脫氨酶與其它同源蛋白的氨基酸序列保守區和酶活性關鍵位點在第51 (Lys，簡寫K)，78 (Ser，S), 268 (Tyr, Y)和294(Tyr, Y)位上的氨基酸殘基是相同的，但在第295位和322位上的氨基酸殘基是不同的，而且這兩個氨基酸殘基決定了酶的催化特性。ACC脫氨酶在第295位和322位上的氨基酸殘基是Glu (E)和Leu (L)，而其它同源蛋白往往是Thr(T)或義！·^。因此，根據第295位和322位上氨基酸殘基的差異有可能設計出擴增acdS的特異引物。共有-簡并雜合寡核苷酸弓丨物(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primer，C0DEH0P)法是設計廣譜簡并引物的有效方法(Rose et al. Nucleic Acids Research 1998,26 :1628-1635)。C0DEH0P法設計簡并引物的原理是選擇靶蛋白保守區內連續3-4個保守氨基酸序列設計簡并核苷酸序列(9-12個堿基)得到3’簡并核心區；在5’ 端根據引物退火溫度的設置選擇部分保守或優勢氨基酸殘基，結合密碼子偏好性設計出5’ 端非簡并共有序列夾。通過在較短的3’簡并核心區序列用較少的簡并堿基來控制適度的引物簡并度，控制適度的有效引物的濃度；通過加長5’端非簡并共有序列夾來控制引物退火溫度，保障擴增特異性。這樣，在首輪擴增時，通過雜合引物在3’簡并核心區與模板正確匹配而實現正確延伸；在隨后的擴增循環中，通過雜合引物與首輪擴增產物在5’共有序列夾區正確匹配而實現正確擴增。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，設計出針對ACC脫氨酶結構基因(acdS)的廣譜且特異的簡并引物，用于從根瘤菌等細菌中用PCR法擴增出acdS，在分子水平鑒定具有ACC脫氨酶的細菌，從大量根瘤菌中快速篩選出具ACC脫氨酶的能高效結瘤的根瘤菌。本發明的解決方案是，基于盡可能多種類的、已確證有ACC脫氨酶活性的微生物包括α -、β -和Y -變形桿菌綱的細菌和真菌的acdS的保守區和C0DEH0P法設計出用于擴增acdS的廣譜簡并引物，通過序列比對選出能區分acdS序列和與ACC脫氨酶高度相似的D-半胱氨酸脫巰基酶的基因序列的特異簡并引物，用預測有效的廣譜特異引物從已知有ACC脫氨酶活性的細菌中擴增acdS，用檢驗有效的廣譜特異引物從根瘤菌中擴增acdS， 篩選出有ACC脫氨酶的、有較高幾率能與寄主豆科植物高效結瘤固氮的根瘤菌。本發明中，設計出的擴增acdS片段的廣譜特異的新引物有3條正向引物 acdSf3、反向引物 acdSr3 和 acdSr4。acdSf3的核甘酸序列是5，ATCGGCGGCATCCAGffSNAAYCANAC 3，，對應的氨基酸序列是IGGIQ(S)NQT，包括了第78位的保守氨基酸殘基Ser(S)，下劃線區是3’簡并核心區，簡并度是128，在acdS序列中對應部分的GC含量平均約60% ；序列比對分析顯示3’簡并核心區能很好匹配各類受試微生物的acdS中相應的保守序列，而且3’簡并核心區的3’端不與D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應序列匹配(圖1)，即能區分acdS和D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應序列，對acdS的擴增特異性強。acdSr3 的核苷酸序列是 5，GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT 3，，對應的氨基酸序列是DPVY(E)GKSMH，包括了第295位的保守氨基酸殘基Glu(E)，下劃線區是3’簡并核心區，簡并度是64，在acdS序列中對應部分的GC含量平均約；序列比對分析顯示3’簡并核心區能很好匹配受試acdS中相應序列，但3’簡并核心區的3’端也與多數受試D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應序列匹配(圖幻，對acdS的擴增特異性弱。acdSr4的核苷酸序列是5，GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA 3’，對應的氨基酸序列是 YAH(L) GGQP,包括了第322位的保守氨基酸殘基Leu (L)，下劃線區是3’簡并核心區，簡并度是64，在acdS序列中對應部分的GC含量平均約72% ；序列比對分析顯示3’簡并核心區能很好匹配受試acdS中相應序列，與D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應序列匹配度差(圖3)，能較好區分acdS和D-半胱氨酸脫巰基酶基因相應序列，對acdS的擴增特異性較強。因預測到acdSr4比acdSr3對acdS相應序列的特異性要強，所以預測用acdSf3/ acdSr4引物對擴增acdS片段的特異性比用acdSf3/acdSr3引物對強，而acdSf3/acdSr3 引物對的擴增特異性主要決定于acdSf3的特異性。在實際應用時，特異性擴增acdS首選acdSf3/acdSr4引物對。但因acdSr4在acdS序列中對應部分的GC含量較高(平均約 72% )，用acdSf3/acdSr4引物對擴增acdS的反應條件要求也要高于用acdSf3/acdSr3引物對的條件，所以實際應用時，對同一菌株分別用acdSf3/acdSr4和acdSf3/acdSr3引物對擴增，以分別確保檢測的特異性和成功率。本發明中，利用權利要求1所述的引物鑒定和篩選微生物是否具有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶的方法，其特征在于，是將acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一個引物對用于PCR反應，從微生物或其核酸樣品中擴增ACC脫氨酶結構基因的部分序列； 用acdSf3/acdSr4引物對擴增出的acdS片段大小760bp，用acdSf3/acdSr3引物對擴增出的acdS片段大小680bp ；如能用acdSf3/acdSr4引物對擴增得到長度760bp的DNA片段，或者用兩對引物分別擴增得到長度760bp和680bp的DNA片段，即認為微生物有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶；如只能用acdSf3/acdSr3引物對擴增得到長度680bp的DNA片段， 還需要以acdSf3或/和acdSrf為測序引物進行PCR產物直接測序獲得所得DNA片段的堿基序列，如果測得的序列與基因數據庫GenBank中序列相似度最高的是ACC脫氨酶結構基因的序列，則認為微生物有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶。對于有不只一個接近預期大小片段的擴增產物，可以通過切膠回收分別純化不同大小的片段，再以相應引物為測序引物分別進行PCR產物直接測序，如果其中有一個DNA片段的序列與基因數據庫GenBank 中序列相似度最高的是ACC脫氨酶結構基因的序列，則認為微生物有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶。本發明中，針對acdS的廣譜特異簡并引物的應用所依托的是PCR技術。在實際操作中，一方面使用了添加了增強劑和優化劑的2XPCR預混液商品，提高了擴增acdSr4引物對應的GC含量高模板的效率，也降低了取樣誤差，提高了檢測重復性。另一方面，利用根瘤菌等革蘭氏陰性細菌的細胞壁易破解的特性，將根瘤菌及其它革蘭氏陰性細菌的單菌落用10 μ 1無菌水懸浮后取1 μ 1直接加入PCR反應體系，利用PCR預變性反應階段的高溫裂解細菌細胞，以釋放出的細菌DNA為模板進行擴增，免去提取細菌基因組DNA的步驟，簡便、省時、省錢，適用于從多個細菌中快速篩選有ACC脫氨酶的菌株。本發明提供的acdSf3/ acdSrf和aCdSf3/acdSr4兩對引物經預測也適用于從放線菌(革蘭氏陽性)和真菌基因組中擴增acdS(圖1，2，3)，但本發明針對根瘤菌等革蘭氏陰性細菌所用的制備PCR模板的方法不適用于放線菌和真菌。本發明的有益效果在于提供了兩對廣譜且特異的用于PCR法擴增微生物acdS片段的新引物acdSf3/ acdSr3和aCdSf3/aCdSr4，預測適用于α-、β-和γ -變形桿菌綱的細菌、放線菌和真菌。 實踐已證實基于這兩對引物的PCR能從有ACC脫氨酶活性的屬于β -變形桿菌綱的伯克霍爾德菌、草螺菌和屬于Y -變形桿菌綱的假單胞菌中擴增到acdS的片段，能從大量屬于 α -變形桿菌綱的根瘤菌中快速篩選出有acdS的菌株，比已有的其它研究設計的引物在廣譜性和特異性上都要強，擴增效率也更高。本發明不僅能用來鑒定有ACC脫氨酶活性的細菌有acdS，也能用于篩選有ACC脫氨酶的細菌；而且，因有研究證實有ACC脫氨酶的根瘤菌能高效結瘤，所以本發明能快速從大量根瘤菌中篩選出能高效結瘤的菌株。
圖1為核苷酸序列聯配比對圖，顯示引物acdSf3序列與各類微生物ACC脫氨酶結構基因(acdSf3上部)和D-半胱氨酸脫巰基酶基因(acdSf3下部)相應序列間的匹配性。 涂黑堿基表示與引物堿基不匹配。圖2為核苷酸序列聯配比對圖，顯示引物acdSrf序列與各類微生物ACC脫氨酶結構基因(acdSr3上部)和D-半胱氨酸脫巰基酶基因(acdSr3下部)相應序列間的匹配性。涂黑堿基表示與引物堿基不匹配。圖3為核苷酸序列聯配比對圖，顯示引物acdSrf序列與各類微生物ACC脫氨酶結構基因(acdSr4上部)和D-半胱氨酸脫巰基酶基因(acdSr4下部)相應序列間的匹配性。 涂黑堿基表示與引物堿基不匹配。
具體實施例方式引物設計從GenBank數據庫中選取了 17個已證實有ACC脫氨酶活性的微生物的ACC脫氨酶的氨基酸序列。這17個微生物包括6個α-變形桿菌綱的細菌[Agrobacterium tumefaciens D3 (氨基酸序列在 GenBank 的登錄號 AAI^8496)、Azospirillum lipoferum4B(ABE66282) > Mesorhizobium Ioti MAFF303099(BAB52295)> Phyllobacterium brassicacearum STM196(AB031418)、 Rhizobium leguminosarum 128C53K(AAL16088)和 Sinorhizobium meliloti SMll (ABA56046) ]，4 個 β-變形桿菌綱的細菌[Burkholderi caledonica LMG 19076(ACH81521), B.caryophylli LMG 2155 (ACH81522)、Ralstonia solanacearum GMI 1000(CAD17797)禾口 Variovorax paradoxus5C2 (AAT35829)]，2 個 Y —變形桿菌綱的細菌[Pseudomonas ffluorescens 17(AAC44163)禾口 P. putida UW4(AAV73804)]，2 個歸屬還未確定的細菌[Enterobacter cloacae CAL2 (AAD05070) 禾口 Pseudomonas sp.ACP(AAA25689) ], 3 個真菌[Hansenula saturnus(Q7M523)、 Penicillium citrinum(BAA92150)和 Tricboderma asperellum(ACX94231)]。將這些氨基酸序列用MUSCLE程序列隊聯配后提交到多序列聯配模塊處理器(Blocks Multiple AlignmentProcessor ；http://bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/ process_blocks.html)來鑒定這些ACC脫氨酶序列的保守區并產生保守區塊，用C0DEH0P 程序(http//bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/codehop. html)在默認參數下對各保守區塊設計出引物序列，將各程序生成引物與上述氨基酸序列對應的核苷酸序列比對進行手動校正產生待測引物。將待測引物與受試acdS和D-半胱氨酸脫巰基酶基因的相應保守區塊的核苷酸序列聯配比對，預測在3’簡并核心區能有效區分雙方序列的引物有正向引物 adSf3和反向引物acdSr4，而反向引物acdSr3的區分能力較弱(圖1，2，3)。引物制備用全自動DNA合成儀合成，用ULTRAPAGE方法純化得到白色結晶，用Tris-EDTA緩沖液(pH 8.0)或超純水稀釋到100 μ M，分裝到0. 5ml離心管內，在_20°C保存。PCR擴增模板制備取細菌在豐富培養基上生長的單菌落，用10 μ 1無菌純水懸浮菌體，取1 μ 1菌懸液作為PCR反應的模板。PCR 擴增按天根生化科技(北京)有限公司生產的2XTaq PCR MasterMix(含染料，目錄號 KT201)產品說明書配制PCR反應液。分別用引物對acdSf3/acdSr4或acdSf3/acdSr3擴增。 每個引物的濃度為0. 4 μ M，加1 μ 1菌懸液作模板，反應液的總體積為25 μ 1或50 μ 1 (用于測序)。以不加菌懸液的反應液為陰性對照。用Bio-Rad SlOOO型PCR儀或東勝龍黑金剛 PCR儀進行擴增反應。反應程序為預變性94°C 4min,變性-退火-延伸循環為94°C 45s,530C 45s, 72°C lmin,循環；35次，終延伸72°C IOmin0反應結束后吸取1_5 μ 1反應液及5 μ 1 250bp DNA ladder marker [寶生物工程(大連)有限公司生產，目錄號D515]，經1 %瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，用凝膠成像分析系統檢測擴增結果。擴增陽性結果得到長度 760bp (用 acdSf3/acdSr4 引物對)或 680bp (用 acdSf3/acdSr3 引物對)的 DNA 片段。實施例1從有ACC脫氨酶活性的歸屬于β -變形桿菌綱的伯克霍爾德菌和草螺菌和歸屬于Y -變形桿菌綱的假單胞菌的菌株中擴增acdS片段受試菌株是已檢測到有ACC脫氨酶活性的44個細菌菌株。其中有1個從甘蔗根際土壤中分離的、5個從玉米莖內分離的和12個從水稻根分離的歸屬于變形桿菌綱的伯克霍爾德屬的菌株，10個從水稻根分離的歸屬于變形桿菌綱的草螺菌屬的菌株和 16個從水稻根分離的歸屬于Y-變形桿菌綱的假單胞菌屬的菌株(li et al. Letters in Applied Microbiology 2011，53 :178-185)。這些菌株分別在LB培養基(每升含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg氯化鈉，15g瓊脂粉，pH7.0)上，在培養。用20 μ 1移液器吸頭挑取直徑約Imm的單菌落移入10 μ 1無菌純水中懸浮菌體，取1 μ 1菌懸液作為PCR反應的模板。經PCR擴增后都分別得到了 760bp和680bp的DNA片段，并且以acdSf3和acdSr3 為測序引物對其中680bp的擴增產物直接測序，獲得的序列與GenBank數據庫中的序列比較發現都與acdS最相似，證實擴增所得是acdS的片段。這些序列在GenBank中的登錄號為 HQ728585 到 HQ7^626，HQ728641, HQ728642 和 HQ84077。其中草螺菌屬菌株的 acdS 序列與數據庫中草螺菌菌株SmRl的acdS序列的相似度有93. 5% -100%，而與其它屬細菌 acdS序列的相似度都低于80% ；其中假單胞菌屬菌株的acdS序列與數據庫中其他微生物 WacdS序列相似度較低，與最相似的草螺菌SmRl的acdS序列的相似度也僅75% -76%。 由于這些草螺菌(包括數據庫中草螺菌菌株SmRl的acdS序列)和假單胞菌的acdS序列與數據庫中其它細菌的acdS序列差異比較大，用以前研究設計的簡并引物沒能從中擴增出acdS序列，所以，本發明設計的新引物對acdSf3/acdSr3和acdSf3/acdSr4比以前研究設計的簡并引物的廣譜性和擴增效率高。實施例2從大量根瘤菌菌株中擴增acdS片段，篩選出可能高效結瘤的根瘤菌受試根瘤菌是從刺槐根瘤內分離到的200個根瘤菌分離物。這些根瘤菌分別在TY 培養基(每升含5g胰蛋白胨，3g酵母提取物，0. 44g 二水氯化鈣，15g瓊脂粉，pH6. 8-7. 0) 上，在培養。用20 μ 1移液器吸頭挑取直徑約Imm的單菌落移入10 μ 1無菌純水中懸浮菌體，取1 μ 1菌懸液作為PCR反應的模板。經PCR擴增且以acdSf3和acdSr3為測序引物對680bp的擴增產物直接測序，獲得23個不同序列，都與GenBank數據庫中根瘤菌的acdS 序列最相似，證實擴增所得的是acdS的片段；其中20個菌株的acdS序列與Mesorhizobium 屬根瘤菌的acdS序列最相似，可能歸屬于Mesorhizobium屬；有3個菌株的acdS序列與 Sinorhizobium屬根瘤菌的acdS序列最相似，可能歸屬于Sinorhizobium屬。這些結果與此前研究發現Mesorhizobium屬根瘤菌在刺槐根瘤中占優勢是相符的(Wei et al. FEMS Microbiology Ecology 200968 :320-328 ；Shiraishi et al.Soil Science and Plant Nutrition 2011,57 :765-774)。從200個根瘤菌分離物中快速篩選出的這23個具ACC脫氨酶的菌株很可能是侵染力強、能高效結瘤的菌株；接下來可以通過在不同脅迫條件下培養根瘤菌菌株和接種刺槐苗的實驗從這23個菌株中篩選出對逆境適應性強、高效結瘤固氮且促刺槐苗生長的高效根瘤菌，在刺槐造林育苗生產上發揮作用。
權利要求
1.用于鑒定ACC脫氨酶結構基因的引物，其特征在于，包括正向引物acdSf3、反向引物 acdSr3和acdSr4，其核苷酸序列分別是acdSf3 :5’ -ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3‘；acdSr3 :5’ -GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’ ；acdSr4 :5’ -GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA-3，。
2.一種利用權利要求1所述的引物鑒定和篩選微生物是否具有ACC脫氨酶結構基因和 ACC脫氨酶的方法，其特征在于，是將acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一個引物對用于聚合酶鏈式反應，從微生物或其核酸樣品中擴增ACC脫氨酶結構基因的部分序列；如能用aCdSf3/acdSr4引物對擴增得到長度760bp的DNA片段，或者用兩對引物分別擴增得到長度760bp和680bp的DNA片段，即認為微生物有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶；如只能用acdSf3/acdSr3引物對擴增得到長度680bp的DNA片段，還需要以acdSf3 或/和acdSrf為測序引物測定所得DNA片段的堿基序列，如果測得的序列與基因數據庫 GenBank中序列相似度最高的是ACC脫氨酶結構基因的序列，則認為微生物有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物是細菌。
全文摘要
本發明涉及微生物技術，旨在提供用于鑒定ACC脫氨酶結構基因的引物及方法。該引物包括正向引物acdSf3、反向引物acdSr3和acdSr4。鑒定和篩選微生物是否具有ACC脫氨酶結構基因和ACC脫氨酶的方法，是將acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一個引物對用于聚合酶鏈式反應，從微生物或其核酸樣品中擴增ACC脫氨酶結構基因的部分序列，并根據擴增結果進行判斷。本發明能從大量屬于α-變形桿菌綱的根瘤菌中快速篩選出有acdS的菌株，比已有的其它研究設計的引物在廣譜性和特異性上都要強，擴增效率也更高。也能用于篩選有ACC脫氨酶的細菌，能快速從大量根瘤菌中篩選出能高效結瘤的菌株。
文檔編號C12N15/11GK102534034SQ20121003864
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者安千里, 常四平, 張繼泰, 李萬里, 李江川, 李鄭義 申請人:武漢凱迪工程技術研究總院有限公司, 浙江大學