專利名稱：檢測蕪菁花葉病毒的一步多重rt-pcr法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測蕪菁花葉病毒的一步多重RT-PCR 法及其專用引物。
背景技術：
完菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus,TuMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae) 馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),病毒粒子呈彎曲線形，長約720nm,寬約15_20nm,由95 %的外殼蛋白和5%的RNA構成。病毒核酸為單鏈正義RNA，約由10，000個核苷酸組成。TuMV 寄主范圍廣泛，在人工接種條件下，可侵染43科156屬，超過318種雙子葉植物及部分單子葉植物；主要侵染十字花科蔬菜作物和觀賞性物種，是僅次于黃瓜花葉病毒(CMV)浸染大田蔬菜最重要的病毒。據調查，我國白菜因TuMV危害平均每年造成5%的產量損失，有些年份減產10%以上，病害嚴重的地塊幾乎絕收。對該病毒的快速、準確檢測有助于控制其傳播流行，減輕危害和損失。常用的植物病毒檢測方法有傳統的生物學檢測方法、血清學方法、電鏡檢測法和分子生物學方法等。傳統生物學方法簡單、直觀、可靠，能準確反映病毒的生物學特性，但需要具備指示植物、溫室、網室等隔離條件，且檢測速度很慢，如隔離措施不當，容易交叉感染，影響準確性。電鏡檢測是最直接、最準確的檢測病毒的手段，但用電鏡觀察時需要樣品含有的病毒濃度較高，因此需要對被檢病毒進行提純，病毒提純費時費力，且電鏡法所需電鏡及超速離心設備價格昂貴，操作對初學者掌握難度較大。血清學方法是檢測植物病毒最常用的有效方法之一，該方法需要與被檢病毒相對應的特異性抗血清。但抗血清制備需要的時間較長，且檢測結果容易受抗血清的特異性影響，有時會有交叉反應。分子生物學方法是從核酸水平來檢測病毒的存在，比血清學方法靈敏度高，可檢測到皮克(Pg)級甚至飛克 (fg)級，并且特異性更強，可進行大批量樣本的檢測。由于分子生物學方法顯著的優越性， 使得其在病毒檢測中得以迅速廣泛的應用。分子生物學方法包括核酸雜交、雙鏈RNA電泳、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、 熒光定量PCR、芯片檢測等方法，其中RT-PCR方法檢測病毒是最為廣泛應用的方法之一，該方法需要病毒基因特異性引物(GSP)對病毒核酸模板進行擴增檢測。雖然ELISA技術已經廣泛應用于植物病毒的檢測，但其檢測的靈敏性無法與RT-PCR方法相比，RT-PCR方法是 DAS-ELISA方法敏感度的1000倍。隨著人們對不同來源的病毒進行基因組測序工作的進展，GenBank的數據不斷豐富，使得利用RT-PCR方法檢測病毒變得更加切實可行。在此基礎上人們進而開發了多重RT-PCR，在同一反應體系中同時檢測多種病毒。一般RT-PCR檢測法需要分兩步進行先提取樣品總RNA，然后經反轉錄獲得cDNA后進行PCR檢測，步驟相對繁瑣。在兩步法的基礎上人們為了簡化步驟，開發了一步RT-PCR法，即反轉錄和PCR擴增在同一反應體系中進行。因此，建立快速、高靈敏度的病毒檢測體系是對TuMV病毒防治的先決條件。發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測蕪菁花葉病毒的引物組。
D本發明提供的檢測蕪菁花葉病毒的引物組，為如下引物組C、引物組A或引物組D
所述弓I物組C包括引物對a和引物對b ；
所述引物組A包括引物對a;
所述引物組B包括引物對b ;
所述引物對a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成；
所述引物對b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成。
上述引物組中，所述引物組C還包括隨機引物和Oligo d (T) 18 ；
所述引物組A還包括隨機引物和/或Oligo d (T) 18 ；
所述引物組B還包括隨機引物和/或Oligo d(T) 18。
所述隨機引物為Random Primer,購自TaKaRa公司，產品目錄號為D3801 ；
所述Oligo d(T) 18為Oligo d(T) 18，購自TaKaRa公司，產品目錄號為D511。
上述引物組中，所述引物組C由所述引物對a、所述引物對b、所述隨機引物和所述Oligo (KT) 18 組成；
上述引物組中，所述引物組A由所述引物對a、所述隨機引物和/或所述Oligod(T) 18 組成；
上述引物組中，所述引物組B由所述引物對b、所述隨機引物和/或所述Oligod(T) 18 組成。
本發明的第二個目的是提供一種檢測蕪菁花葉病毒的PCR試劑。
本發明提供的PCR試劑，為如下I)-3)中的任意一種
I)由上述的引物組中的所述引物組C、dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；
2)由上述的引物組中的所述引物組A、dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；
3)由上述的引物組中的所述弓丨物組B、dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成。
在上述PCR試劑中，所述反轉錄酶為M-MLV ；
所述各引物組中的所述引物對a和所述引物對b的各條引物在對應的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 125 μ mol/L ；
所述引物組A或所述引物組B中的所述隨機引物在對應的所述PCR試劑中的終濃度均為 I. 25 μ mol/L ；
所述引物組A或所述引物組B中的所述Oligo d(T) 18在對應的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 625 μ mol/L。
本發明的第三個目的是提供一種檢測蕪菁花葉病毒的試劑盒。
本發明提供的試劑盒，包括上述的PCR試劑。
上述的引物組、上述的PCR試劑或上述的試劑盒在鑒定或輔助檢測蕪菁花葉病毒中的應用也是本發明保護的范圍。或上述的引物組、上述的PCR試劑或上述的試劑盒在制備鑒定或輔助檢測蕪菁花葉病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍；或上述的引物組、上述的PCR試劑或上述的試劑盒在鑒定或輔助檢測待測植物是否感染蕪菁花葉病毒中的應用也是本發明保護的范圍；在上述應用中，上述待測植物具體為蘿卜、甘藍或四月慢油菜。本發明的第四個目的是提供一種鑒定或輔助檢測待測植物是否感染蕪菁花葉病毒的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟以待測植物組織的RNA提取物作為模板，分別用上述的PCR試劑或上述的試劑盒中的所述的引物組C、所述的引物組A或所述的引物組B 進行一步RT-PCR擴增，得到擴增產物，檢測擴增產物，若所述引物組C擴增產物的大小為156bp和/或377bp，則待測植物為或候選為感
染蕪菁花葉病毒；若所述引物組A擴增產物的大小為156bp，則待測植物為或候選為感染蕪菁花葉
病毒;若所述引物組B擴增產物的大小為377bp，則待測植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒。上述方法中，所述大小為156bp的擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列I或與其同源性大于90%的核苷酸序列；所述大小為377bp的擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列2或與其同源性大于90%的核苷酸序列；所述一步RT-PCR擴增的退火溫度為55°C ；所述檢測擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳；所述待測植物為蘿卜、甘藍或四月慢油菜；上述方法中的所述待測植物組織的RNA提取物按照如下方法制備將所述待測植物葉片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl, EDTA、 SDS和水組成；所述Tris在所述提取液中的終濃度為200mM，所述NaCl在所述提取液中的濃度為250mM，所述EDTA在所述提取液中的濃度為25mM，所述SDS在所述提取液中的濃度為0.5% (質量百分含量)；所述提取液的pH值為7.5 ;所述研磨在23 °C -28 °C條件下進行；所述組織為葉片。上述提取液在提取RNA中的應用；上述應用中，所述提取的溫度具體為 230C -28O。本發明的實驗證明，本發明根據GenBank數據，設計了兩套針對TuMV的特異性引物，利用反轉錄酶M-MLV和普通Taq酶，建立了一步法多重RT-PCR，可以實現對TuMV進行快速、準確地檢測，尤其是兩套針對TuMV的特異性引物確保了檢測的準確性；另外在一步法多重RT-PCR中的模板只需要在室溫條件下對樣品簡單研磨即可制備，研磨的粗提液或經濃縮后的DNA-RNA混合物均可作為模板，方法簡便,不需要經過先對總RNA的單獨提純步驟；再者，一步法多重RT-PCR中的M-MLV反轉錄酶比現有的一步法RT-PCR使用的 SuperscriptII價格便宜,在實際應用中應更容易被接受。
圖I為多種引物組合對檢測效果的影響
圖2為病毒量對擴增效率的影響
圖3為粗提物經分離純化濃縮后的產物圖
圖4為用粗提液與濃縮產物為模板進行檢測的對比
圖5為用GSPl引物組合對TuMV的快速檢測結果
圖6為用GSP2引物組合對TuMV的快速檢測結果
圖7為用GSPl引物組合和GSP2引物組合對TuMV的快速檢測結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中部分材料如下TuMV毒源為來源于中國農業科學院蔬菜花卉研究所的北京TuMV毒株Cl、C3、C4， 山東農業科學院蔬菜所提供的TuMV毒株Lu2。TuMV毒株Cl、TuMV毒株C3、TuMV毒株C4記載在馮蘭香、徐玲、劉佳、鈕心恪、李秀生“北京地區大白菜蕪菁花葉病毒株系的鑒定”《中國蔬菜》1988(4) :11-13;公眾均可從北京農業生物技術研究中心獲得。TuMV毒株Lu2記載在國家蔬菜抗病育種課題TuMV株系研究協作組“我國十省 (市)十字花科蔬菜蕪菁花葉病毒(TuMV)株系分化研究”《病毒學雜志》1990，5 (I). 82-87 ; 公眾可從北京農業生物技術研究中心獲得。將上述Cl、C3、C4、Lu2分別在溫室(25°C )條件下人工接種在四月慢油菜和漢王白蘿卜，網罩隔離，得到分別感染Cl、C3、C4、Lu2的四月慢油菜和分別感染Cl、C3、C4、Lu2 的漢王白蘿卜，上述接種在四月慢油菜樣本的葉片花葉皺縮、失綠，呈現出感染TuMV病毒的典型癥狀。接種在漢王白蘿卜樣本的表型極輕微，葉片無皺縮，有輕微的明脈。負對照為未接種上述各種TuMV毒株的四月慢油菜和漢王白蘿卜(生長狀態正常， 沒有TuMV病毒感染病癥)。反轉錄酶M-MLV(產品目錄號為D2639A)、Oligo d(T) 18 (產品目錄號為D511)、 Random Primer (產品目錄號為D3801，含有6個堿基的隨機序列引物，有46種可能序列，5' 末端憐酸化修飾。)為TaKaRa公司產品。DNA聚合酶EasyTaq (API 11)及DNA marker IOObp plus(BM311)為北京全式金生物技術有限公司產品。實施例I、一步RT-PCR法中相關引物的設計及條件摸索一、一步RT-PCR法中相關引物的設計在自然條件下蕪菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)非常容易通過基因重組，產生變異。通過查閱文獻獲知在TuMV-6Kl基因內沒有發現基因重組位點，序列高度保守，且TuMV-CP基因的C端相對比較保守。經對GenBank登錄的122個TuMV株系進行序列比對，根據TuMV的6K1區段(GenBank 號 HQ446217. I (C4)編碼區的第 3526-3681 位)及 CP 保守區(GenBank 號 HQ446217. I (C4)編碼區的第9074-9450位)設計了兩套特異性引物GSPl和GSP2 (見表I)。 所設計的引物經NCBI的BLAST檢測，確保對TuMV檢測的唯一性與準確性。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。表I為兩套特異性引物序列
權利要求
1.一種檢測蕪菁花葉病毒的引物組，為如下引物組C、引物組A或引物組B :所述弓I物組C包括引物對a和引物對b ；所述引物組A包括引物對a;所述引物組B包括引物對b;所述引物對a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成；所述引物對b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成。
2.根據權利要求I所述的引物組，其特征在于所述引物組C還包括隨機引物和Oligo d(T) 18 ；所述引物組A還包括隨機引物和/或Oligo d (T) 18 ；所述引物組B還包括隨機引物和/或Oligo d(T) 18。
3.根據權利要求I或2所述的引物組，其特征在于所述引物組C由所述引物對a、所述引物對b、所述隨機引物和所述Oligo d(T) 18組成；所述引物組A由所述引物對a、所述隨機引物和/或所述Oligo d(T) 18組成；所述引物組B由所述引物對b、所述隨機引物和/或所述Oligo d(T)18組成。
4.一種檢測蕪菁花葉病毒的PCR試劑，為如下1)-3)中的任意一種1)由權利要求1-3中任一所述的引物組中的所述引物組C、dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；2)由權利要求1-3中任一所述的引物組中的所述引物組A、dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；3)由權利要求1-3中任一所述的引物組中的所述引物組B、dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成。
5.根據權利要求4所述的PCR試劑，其特征在于所述反轉錄酶為M-MLV ；所述各引物組中的所述引物對a和所述引物對b的各條引物在對應的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 125ymol/L；所述引物組A或所述引物組B中的所述隨機引物在對應的所述PCR試劑中的終濃度均為 L 25 μ mol/L ；所述引物組A或所述引物組B中的所述Oligo d(T) 18在對應的所述PCR試劑中的終濃度均為O. 625 μ mol/L。
6.一種檢測蕪菁花葉病毒的試劑盒，包括權利要求4或5所述的PCR試劑。
7.權利要求1-3任一所述的引物組、權利要求4或5的所述的PCR試劑或權利要求6 所述的試劑盒在鑒定或輔助檢測蕪菁花葉病毒中的應用；或權利要求1-3任一所述的引物組、權利要求4或5的所述的PCR試劑或權利要求6 所述的試劑盒在制備鑒定或輔助檢測蕪菁花葉病毒產品中的應用；或權利要求1-3任一所述的引物組、權利要求4或5的所述的PCR試劑或權利要求6 所述的試劑盒在鑒定或輔助檢測待測植物是否感染蕪菁花葉病毒中的應用；所述待測植物具體為蘿卜、甘藍或四月慢油菜。
8.一種鑒定或輔助檢測待測植物是否感染蕪菁花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測植物組織的RNA提取物作為模板，分別用權利要求4或5的所述PCR試劑或權利要求6 所述試劑盒中的所述的引物組C、所述的引物組A或所述的引物組B進行一步RT-PCR擴增， 得到擴增產物，檢測擴增產物，若所述引物組C擴增產物的大小為156bp和/或377bp，則待測植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒；若所述引物組A擴增產物的大小為156bp，則待測植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒； 若所述引物組B擴增產物的大小為377bp，則待測植物為或候選為感染蕪菁花葉病毒。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述大小為156bp的擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列I或與其同源性大于 90%的核苷酸序列；所述大小為377bp的擴增產物的核苷酸序列為序列表中的序列2或與其同源性大于 90%的核苷酸序列；所述一步RT-PCR擴增的退火溫度為55°C ；所述檢測擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳；所述待測植物為蘿卜、甘藍或四月慢油菜；所述組織為葉片；所述待測植物組織的RNA提取物按照如下方法制備將所述待測植物葉片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl、EDTA、SDS和水組成；所述 Tris在所述提取液中的終濃度為200mM，所述NaCl在所述提取液中的濃度為250mM，所述 EDTA在所述提取液中的濃度為25mM、所述SDS在所述提取液中的濃度為O. 5% (質量百分含量)；所述提取液的PH值為7. 5 ;所述研磨在23 °C -28 °C條件下進行。
10.權利要求8或9所述方法中的所述提取液在提取RNA中的應用；所述提取的溫度具體為 23 °C -28 °C。
全文摘要
本發明公開了一種檢測蕪菁花葉病毒的一步多重RT-PCR法及其專用引物。本發明提供了一種檢測蕪菁花葉病毒的引物組，為如下引物組C、引物組A或引物組B所述引物組C由引物組A和引物組B組成；所述引物組A包括引物對a；所述引物組B包括引物對b；所述引物對a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成；所述引物對b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成。本發明的實驗證明，本發明建立了一步法多重RT-PCR，對TuMV進行快速、準確地檢測。
文檔編號C12Q1/70GK102586478SQ20121003865
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者葉艷英, 姚磊, 曾鋼, 馬榮才 申請人:北京農業生物技術研究中心