專利名稱：一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種羊痘病毒的PCR檢測方法，特別涉及一種羊痘病毒通用型 TaqMan-MGB探針熒光PCR檢測方法，屬于檢驗檢疫技術領域。
背景技術：
羊痘是綿羊痘和山羊痘的統稱，是由羊痘病毒屬(Capripoxvirus)的綿羊痘病毒 (she印pox virus,SPPV)或山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV)引起的羊的一種急性、熱性、 接觸性傳染病，主要表現為發熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發生丘疹和皰疹，是所有動物痘病中最為嚴重的一種，有較高的死亡率，能造成巨大經濟損失。羊痘在非洲中北部、亞洲中部和西南部以及印度大部分地區呈地方性流行。我國的貴州、廣西、甘肅、黑龍江等地均有本病發生。世界動物衛生組織(OIE)將該病列為法定通報傳染病，我國將其列為一類動物疾病。有本病的國家和地區的易感動物及其相關產品被世界各國列為嚴格限制進出的對象，嚴重影響國際貿易和養羊業的發展。因此，快速、敏感和特異的診斷羊痘病毒的方法對于緊急控制和預防羊痘、減少經濟損失具有重要的實際應用價值。山羊痘病毒為雙鏈DNA病毒，長度約1501Λ左右，其中堿基A、T均勻分布于整個基因組，含量約為75%，是A+T含量最高的痘病毒。目前已建立的檢測羊痘病毒方法較多，如病毒培養、電鏡觀察、瓊脂擴散、間接熒光抗體染色、血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗檢測技術等，但應用常規方法檢測羊痘的存在費時、費力，特異性和敏感性不高等缺點。近年來， 國內外也已有一些關于利用PCR方法從活體組織、組織培養物中檢測羊痘病毒的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針熒光PCR檢測方法。本發明方法快速、準確、高通量、靈敏度高且特異性強。本發明通過以下技術方案實現1.合成引物及TaqMan-MGB探針選取羊痘病毒基因組末端反向重復序列(ITR)的保守區序列作為PCR擴增的靶序列，設計合成特異性的引物及探針，將該引物對擴增并BLAST，結果表明該引物及探針序列高度保守；該引物對及Taqman-MGB探針序列為ITRP1 5 ’ -TTCACAGAAGAACAAGTTGGAGATG-3，，ITRP2 :5’ -CATTAGGGAATCATGTGCAGTGAT-3，，ITRProb e 5 ’ -Fam-CCAATATTCTGCTGCTCTTGC-NFQ-MGB_3，。或者是，上述引物序列的互補序列；再或者，是上述序列同源性大于75%的序列。探針序列的5’端標記FAM熒光報告基團，3’端標記末端連接MGB的非熒光淬滅基團。2.構建陽性對照克隆質粒
用于構建ITR基因陽性對照質粒的引物如下上游引物5，-ATTATAAAAAAGCCAATTAAACCTGT-3，下游引物5，-TGAAATCATACGTTGAGAGTGTAAGT-3，以提取的山羊痘病毒ANHUI株基因組DNA為模板，使用上述引物按常規方法進行下列操作擴增ITR基因片段，將回收目的片段與PCR2. 1載體連接，轉化DH5 α感受態細胞，挑選陽性克隆后測序。測序結果與GenBank序列比對無誤后，一 20°C保存備用。3.建立熒光PCR反應體系依次加入以下反應試劑，建立50 μ L反應體系。1) Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG with ROX 25 μ L2) 50mM MgCl21. 5μ L3) ITRPll.OyL4) ITRP2l.OyL5) ITRProbel.OyL6)模板 5 μ L7) ddH20補足至 50 μ L反應參數為50°C2min，95°C 5min，95°C 30s,60°C 30s,45 個循環。本發明的另一個目的是提供一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR 檢測試劑盒，包括(1)熒光PCR反應混合液I(2)熒光PCR混合液II(3)陽性對照克隆質粒(4)陰性對照(5)使用說明書所述熒光PCR反應混合液I為各種市售的熒光反應液。所述熒光PCR混合液II通過如下方法獲得使用DNA合成裝置合成寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析法純化后進行氨解處理；同樣合成探針序列，氨解處理后分別在在其5'端標記熒光發生基團(報告基團)&6-FAM amidite，并在其3'端標記非熒光淬滅基團MGB，以FPLC層析法純化熒光標記探針，然后用雙蒸水溶解純化的引物和探針，濃度為lOOnmol/L，混勻即成。本發明方法的優點和特點是1.本發明方法相對于常規的PCR技術而言，具有更高的敏感性、特異性和重復性，同時還具有快速、高通量、污染少等特點。本發明采用新一代 Taqman-MGB探針，其淬滅基團采用了非熒光淬滅基團，本身不產生熒光，與普通Taqman探針相比，降低了 PCR反應熒光本底信號的強度，進一步增強了方法的特異性；同時探針末端連接著MGB(Minorgroove binder)修飾基團，可以將探針的溫度提高10°C左右，相比其他探針更適合于羊痘病毒的檢測。2.從提取樣本基因組到試驗結束整個檢測過程在4h內完成，大大縮短了檢測時間，為山羊痘的臨床診斷和檢疫提供了一種敏感、特異、快速、簡便的診斷方法；3.本方法的最低檢出限可以達到lX102copies/yL。4.特異性經臨床樣本檢測，表明本發明方法對山羊痘病毒(Goatpox virus,
4GTPV)和綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)有特異性，能準確檢測到皮膚痘疹材料中羊
痘病毒的存在。
具體實施例方式為了理解本發明，下面結合實施例進一步說明本發明，但不限制本發明。配制PBS溶液
0. 2M Na2HP04/ml 81. OmL 0. 2M NaH2P04/ml19. 0 mL
青霉素10000 IU
鏈霉素1. Og混勻后，充分溶解，-20°C保存備用。實施例1.樣本基因組DNA的提取1)處理用PBS溶液浸洗患病羊皮膚組織，經研磨器研磨，制成1 10的組織懸液， 反復凍融三次，然后600g離心lOmin，取上清液備用。幻基因組DNA的提取采用TIANGEN公司產品血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按如下操作(1)取步驟1)所得上清液200yL，加入蛋白酶K溶液，混勻。 (2)加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置lOmin，期間顛倒混勻數次，溶
液變清亮為止。(3)加入200 μ L無水乙醇，充分顛倒混勻。(4)將上一步所得溶液和可能的絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱CB3 放入收集管中)，12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(5)向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液GD，12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(6)向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液PW，12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500 μ L漂洗液PW，12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管中的廢液。(8)將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm離心^iin,倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干材料中殘余的漂洗液。(9)將吸附柱CB3轉入另一干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ L洗脫緩沖液ΤΒ，室溫放置2 5分鐘，以12，OOOrpm離心2min，將溶液收集到離心管中，得到熒光PCR反應用DNA模板。2.熒光PCR反應按以下要素依次加入反應試劑，建立50 μ L反應體系。
權利要求
1.一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測方法，選取羊痘病毒基因組末端反向重復序列(ITR)的保守區序列作為PCR擴增的靶序列，設定合成引物和TaqMAN-MGB探針對羊痘病毒進行定性檢測，其特征在于引物對和Taqman-MGB探針序列為I TRP 1 :5’-TTCACAGAAGAACAAGTTGGAGATG-3’，I TRP2 :5’ -CATTAGGGAATCATGTGCAGTGAT-3，，I TRProb e :5’ -Fam-CCAATATTCTGCTGCTCTTGC-NFQ-MGB-3'；探針序列的5’端標記FAM熒光報告基團，3’端標記末端連接MGB的非熒光淬滅基團。
2.一種如權利要求1所述的羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測方法，其特征在于引物對和Taqman-MGB探針是所述引物序列的互補序列。
3.一種如權利要求1所述的羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測方法，其特征在于引物對和Taqman-MGB探針是所述序列同源性大于75%的序列。
4.一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于包含采用權利要求1、2或3所述引物和探針制備的部件。
全文摘要
本發明公開了一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測方法及試劑盒，本方法克服了現有方法中存在的不足，可以快速、準確、方便地診斷羊痘病毒，有利于緊急控制和預防羊痘，減少經濟方面的損失，具有很高的實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102559934SQ20121004302
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月23日 優先權日2012年2月23日
發明者劉偉, 李寧, 王建華, 賀艷, 趙祥平, 鄭文杰 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心