專利名稱：一種基于m基因的尼帕病毒熒光rt-pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種尼帕病毒的熒光RT-PCR檢測方法，特別涉及一種尼帕病毒 TaqMan-MGB探針熒光RT-PCR檢測方法，屬于檢驗檢疫技術領域。
背景技術：
1998年，尼帕病首次暴發于馬來西亞，引起豬和人的發病和死亡。病原生態學和流行病學調查發現，狐蝠科的食果蝙蝠是本病的病原-尼帕病毒(Nipah Virus, NiV)的自然宿主，在向動物和人傳播疫病過程中起到決定性作用。NiV對蝙蝠不致病，對豬有一定的致病性，而對人的致病力很強，人感染NiV后病死率達40% 70%。因此，NiV被列為最危險的生物安全4級病原微生物。NiV與亨德拉病毒一起同屬于副粘病毒科亨尼帕病毒屬成員，其基因組全長約 18. 21Λ，含有6個轉錄單位，依次編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、 受體結合蛋白(G)和大蛋白(L)等6個結構蛋白，F和G蛋白是病毒的兩個表面糖蛋白。病毒分離是鑒定NiV最重要、最基本的診斷方法，但需在生物安全4級(P4)實驗室進行病毒培養。中和試驗是MV血清學檢測的主要方法，同樣MV病毒中和試驗也需要P4 級的生物安全實驗室。美國CDC使用捕獲ELISA來檢測特異性抗MV的IgM抗體，澳大利亞動物衛生實驗室分別用NiV感染Vero細胞的滅活提取物作為間接EI ISA的抗原來檢測血清抗體的效價。目前檢測NiV的PCR方法主要有兩種，一種是澳大利亞AAHL的RT-PCR， 采用巢式引物擴增病毒基質蛋白的M基因，可用于檢測固定組織、新鮮組織、腦脊液中的病毒序列；另一種是美國CDC的RT-PCR，用于擴增NiV的N基因。熒光定量PCR技術是一種新型擴增待檢基因的方法，采用“閉管”操作，具有操作簡便、結果直觀、敏感性高、特異性強、 重復性好、耗時短等優點，還可避免常規PCR操作時EB染色所造成的危害及PCR后處理可能帶來的假陽性。法國與馬來西亞合作，于2005年報道了針對NiV N基因的熒光RT-PCR 檢測技術，該技術中的陽性標準品是用NiV的RNA制備的，也需要在P4級的實驗室培養病近年來在柬埔寨和泰國所進行的病原生態學研究顯示，兩國境內的蝙蝠群均存在一定比例的NiV抗體陽性率。雖然尼帕病在我國尚未出現，但是由于來自周邊國家的疫情威脅以及我國東南沿海地區有與NiV原發地相似的生態環境和動物分布，所以尼帕病對我國造成了明顯的威脅。本病目前尚無有效的方法進行治療和預防，相關疫苗尚在研究之中。我國是一個養豬大國，一旦發生豬尼帕病毒病疫情并且沒有被及時發現而擴散開來，對我國將產生嚴重的不良后果。我國目前無本病發生，應加強對進口豬的檢疫，防止該病傳人我國。因此， 建立MV的監測與診斷技術對于構建預警與應急技術平臺防范尼帕病進入我國具有十分重要的現實意義
發明內容
本發明人經過大量研究實驗，建立了一種基于M基因的尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法，本發明方法準確、快速。本發明通過以下技術方案實現1.合成引物及iTaqMan-MGB探針比對GenBank中公布的12株尼帕病毒基因組M基因序列，選擇尼帕病毒基因組M 基因的保守區序列作為PCR擴增的靶序列，通過篩選確定引物對和Taqman-MGB探針的序列為引物 1 5，-GATGGACATCAATCCTTG-3，，引物 2 5，-CTCTCTTGGAACAGAAGG-3，，探針5，-Fam-CTGCTACTCGGCTGATCTCACA-NFQ-MGB-3，；或者為上述引物序列的互補序列；再或者為上述序列同源性大于75%的序列。探針序列的5’端標記熒光發光基團，3’端標記末端連接MGB的非熒光淬滅基團。 標記探針的熒光發光基團可以為FAM、ΤΕΤ、JOE、HEX、NED熒光報告基團的中的任意一種。2.構建陽性對照假病毒采用常規方法人工合成一段包含適合引物及探針序列的尼帕病毒基因組M基因片段，然后通過雙酶切、連接，構建插入該基因序列的慢病毒表達載體，再將慢病毒表達載體和包裝質粒同時轉入包裝細胞中，從而瞬時表達慢病毒表達載體的轉錄子以及包裝所需的蛋白，最終獲得用于制備標準品或對照品的假病毒。3.建立優化的一步法熒光RT-PCR反應體系RT-PCR反應組份包括1)2X Master Mixwithout UN2)40X MultiScribe3)RNase Inhibitor Mix4)引物5)探針6) RNA 模板7) ddH20反應參數為48°C30min,95°C 10min,95°C 15s,60°C 30s，40 個循環；60°C退火條件下采集熒光信號。本發明的另一個目的是提供一種羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探針實時熒光PCR 檢測試劑盒，試劑盒包括(1) 一步法熒光RT-PCR反應混合液I(2)熒光PCR反應混合液11(3)陽性對照假病毒(4)陰性對照(5)使用說明書所述一步法熒光PCR反應混合液I為市售的熒光PCR反應混合液；所述熒光PCR反應混合液II為本發明引物和探針的混合物，通過如下方法制備得到使用DNA合成裝置合成寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析法(FPLC)純化后進行氨解處理；合成探針序列并氨解處理后分別在在其5'端標記熒光發生基團(報告基團)&6-FAM amidite, 并在其3'端標記非熒光淬滅基團MGB，以FPLC層析法純化熒光標記探針，然后用雙蒸水溶解純化的引物和探針，濃度為lOOnmol/L，混勻即成。本發明的優點及特點1本發明方法敏感性、特異性高。經生豬樣本檢測結果顯示，本方法具有較好的特異性和敏感性，對于豬的其他RNA病毒，如豬繁殖障礙與呼吸道病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒和豬腦心肌炎病毒，不產生PCR擴增反應。2.采用一步法熒光RT-PCR方法檢測豬樣本中的尼帕病毒，快速，整個檢測過程在 &內完成，操作簡便；3.基于尼帕病毒基因組的M基因，通過序列比對及引物、探針篩選可覆蓋已知的尼帕病毒。4.陽性對照樣本采用沒有感染性的假病毒，性質穩定，無需培養活病毒，具有良好的實驗室生物安全性，可模擬真實樣本進行質量控制。5.本發明采用新一代Taqman-MGB探針，增強了方法的特異性。
具體實施例方式為了理解本發明，下面結合實施例進一步說明本發明，但不限制本發明。實施例1.樣本處理及RNA的提取取生豬產品組織lOOmg，研磨后供提取RNA用。取假病毒200 μ L加入到無RNase的含750 μ L Trizol試劑的EP管中，充分振搖 15s，室溫靜置5min。加無RNase的氯仿200 μ L，振蕩15 30s，室溫靜置2 3min，4°C、 12000r/min離心15min ；小心吸取上層水相，移至新的EP管中；加未用過無RNase的異丙醇500 μ L，充分混勻，室溫靜置IOmin ；4°C、12000r/min離心IOmin ；棄上清，加用DEPC水配制的體積分數75%乙醇lmL，振搖，充分洗滌沉淀，4°C、12000r/min離心5min ；棄上清，真空干燥，加5 10 μ L無RNase三蒸水熔解沉淀，備用。取研磨的IOOmg組織做上述相同的處理，備用。2.熒光 RT-PCR 反應按以下要素依次加入反應試劑，建立50 μ L反應體系。
權利要求
1.一種基于M基因的尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于選取尼帕病毒基因組M基因的保守區序列作為PCR擴增的靶序列，合成特異性的引物和Taqman-MGB探針對尼帕病毒進行定性檢測，其特征在于所述引物對和Taqman-MGB探針序列為NIPHAMP 1 :5’ -GATGGACATCAATCCTTG-3’，NIPHAMP2 :5’ -CTCTCTTGGAACAGAAGG—3，，NIPHAMProbe :5’ -CTGCTACTCGGCTGATCTCACA-3’ ；探針序列的5’端標記熒光發光基團，3’端標記末端連接MGB的非熒光淬滅基團。
2.一種如權利要求1所述的基于M基因的尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于弓I物對和Taqman-MGB探針是所述弓|物序列的互補序列。
3.—種如權利要求1所述的基于M基因的尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于引物對和Taqman-MGB探針是所述引物序列同源性大于75%的序列。
4.根據權利要求1、2或3所述的一種基于M基因的尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于標記探針的熒光發光基團是FAM、ΤΕΤ、JOE、HEX、NED熒光報告基團的其中任意一種。
5.一種尼帕病毒Taqman-MGB探針實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包含采用權利要求1、2、3或4所述引物和探針制備的部件。
全文摘要
本發明公開了一種基于M基因的尼帕病毒熒光RT-PCR檢測方法及其試劑盒，本方法采用一步法熒光RT-PCR方法檢測豬樣本中的尼帕病毒，操作簡便、快速且具有較高的特異性和敏感性；本方法陽性對照樣本采用沒有感染性的假病毒，性質穩定，無需培養活病毒，具有良好的實驗室生物安全性。
文檔編號C12R1/93GK102559935SQ20121004302
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月23日 優先權日2012年2月23日
發明者吳紹強, 王乃福, 王建華, 王玉玲, 趙祥平, 陳本龍 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心