專利名稱：生物環保發酵床養豬發酵菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程技術領域，涉及一種用于生物環保發酵床養豬的微生物復合菌劑及其制備方法。
背景技術：
人類養豬的歷史已有2000多年，農業耕種模式的改變，為養豬由半放牧模式逐步轉為圈養模式創造了條件；飼料工業的興起，養殖技術的進一步發展，使養豬業走向了專業化、集約化、規模化的道路，豬的生長潛能得到了極大發揮；但是，高密度的工廠化飼養模式也帶來了新的生態問題高劑量的抗生素、微量元素與重金屬的添加，不僅破壞了動物體內的生態平衡，也惡化了外部養殖環境，嚴重影響了豬的正常發育和健康，豬發病率大大增加；集中排放的糞便與污水，污染了土壤和水源，造成了嚴重的養殖污染，給人類賴以生存的生態系統帶來了極大的破壞。以養豬為例，一頭約100公斤的出欄豬一生排泄量約為I. I噸，一頭繁殖母豬一年排泄量約為4噸，我國年出欄豬約6億頭，存欄母豬4500萬頭，其中規模養殖約占42%，生豬年集中排泄量高達3. 2億噸，這還不包括因沖洗豬舍導致超過10億噸的污水以及3. 6億多頭散養豬的排泄物與污水。人們已經認識到，必須把經濟發展與環境保護協調一致，建立可持續發展的健康生態系統；在這種背景下，各種有利于生態系統健康的高科技技術應運而生，生物環保(發酵床)養豬技術就是其中之一，生物環保(發酵床)養豬技術可以做到糞尿零排放，改善養殖環境，降低豬的疾病發生率，增進動物福利，提高效益，使養殖業更好地納入農業生態循環體系，推動生態農業的循環發展。發酵床養豬墊料發酵分解糞尿的過程是微生物作用的結果，所以，發酵菌種活力的高低決定了糞便分解和墊料發酵的效率，是發酵床養豬法墊料制作的首要關鍵因素。目前，國內的同類產品多數是從自然界采集“土著菌”生產的不明微生物復合菌群，有的直接使用生物發酵肥菌種和EM菌液，微生物菌種的特性和作用發揮不確切，同時， 有的發酵劑使用操作復雜，實際升溫速度較慢并且存在糞尿降解效果較差，容易造成死床; 有的菌種發酵床豬易患呼吸道和腹瀉疾病。
發明內容
本發明的目的是提供一種生物環保發酵床養豬發酵菌劑。本發明的另一個目的是提供一種生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法。本發明生物環保發酵床養豬發酵菌劑，其組成和重量份配比為
羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496 I一2 份、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1923 2-5 份、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1866 2—4 份、嗜熱酸雙歧桿菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282 2-3 份、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilissubsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108 2-4 份、阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314 1-3 份和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 3-5份，充分混勻后真空包裝，即可得到復合菌劑。每一種發酵菌劑每毫升所含活菌數不小于IO9個。本發明生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，由以下步驟組成
I)菌種的培養
a.菌劑的活化
分別取體積百分含量為O. 9%生理鹽水10ml，置于7個250ml三角瓶中，于121°C溫度下滅活30分鐘后冷卻至30°C，在無菌狀態下，將羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus) CGMCC NO. I. 1923、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus) CGMCC NO. I. 1866、嗜熱酸雙歧桿菌 (Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108、阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4. 1314 和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 七株菌分別倒入上述7個裝有生理鹽水的250ml三角瓶中，震蕩溶解后，在30°C恒溫箱中靜止30分鐘，備用；
b.制備液體培養基
按各菌劑的培養基制備要求制備培養基各1000ml，備用；
c.一級菌劑的制備
分別各量取七株菌的培養基200ml，分別置于7個500ml三角瓶中，于121°C溫度下滅活30分鐘后冷卻至30°C，接種步驟a中已活化的菌種，在30—35°C溫度搖床(轉速為150r/ min)上恒溫培養48h，作為一級菌種發酵菌劑；
d.生產發酵菌劑的制備
首先配置7份生產發酵培養基，于121°C溫度下濕熱滅菌20分鐘，自然冷卻至30°C， 分別按5%的體積含量接種一級菌種，在30— 35°C溫度搖床(轉速為150r/min)上恒溫培養 36—48h ;用紫外分光光度計檢測7株生產菌劑在460nm處光密度(OD)值為X，后依據數學模型Y= (3. 14X+1. 42) X IO8估計每毫升菌液活菌含量；如生產發酵菌劑活菌數> IO9個/ ml，視同發酵成熟，如活菌數彡IO9個/ml，繼續在40°C搖床上恒溫培養，直到達到IO9個/ ml ；
e.粉劑凍干菌種的制備
將發酵成熟的生產發酵菌劑在無菌條件下倒入安培瓶(165X165)中，液面低于1cm， 加蓋放入-30°C冰柜速凍，凍結后放入凍干機進行冷凍干燥。做為本發明的進一步改進，各菌種的培養基組成如下
嗜熱脂肪芽孢桿菌培養基組成為蛋白胨10.0g，牛肉提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)3. Og,氯化鈉5. Og,瓊脂15. O,蒸餾水1000ml，pH值為7. O。嗜熱酸雙歧桿菌培養基組成為蛋白胨10.0，牛肉提取物10. 0g，酵母提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)5. Og,葡萄糖5. Og,磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0. 45g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 33g，氯化銨(NH4Cl) I. Og,七水硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0. Ig,體積百分含量為55%的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物(L-Cysteine. HCl H2O溶液)10. Oml,的體積百分含量為O. 1%樹脂天青溶液(Resazurin溶液)I. 0ml，體積百分含量為5%的九水硫化鈉溶液 10. Oml，蒸餾水 1000ml，pH 值為 7. 5。枯草芽孢桿菌培養基組成為牛肉提取物5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)5. Og,葡萄糖5. Og,氯化鈉5. Og,瓊脂15. Og,蒸餾水 1000ml, pH 值為 7. O。阿南德氏鏈霉菌培養基組成為酵母提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)
2.0g，可溶性淀粉10. 0g，瓊脂15. 0g，蒸餾水1000ml，pH值為7. 3。釀酒酵母培養基組成為12波美度的麥芽汁1000ml，瓊脂15. 0g，5波美度的麥芽汁IOOml與瓊脂I. 5g的混合物；麥芽汁制備過程為稱大米500g，洗凈，加水4000ml，煮成米粥，冷卻至60-65°C，將1500g麥芽粉摻入米粥中攪拌均勻，置于55-60°C保溫箱內糖化4 小時，即可取出過濾，將濾液裝瓶滅菌備用，用時將濾液稀釋至所需糖。羊肚菌培養基組成為馬鈴薯提取液(南京澤朗農業發展有限公司)1000ml，葡萄糖20. Og,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 3. Og,七水硫酸鎂(MgSO4. 7H20) I. 5g，維生素B1O. 5g，瓊脂 15. 0g，pH 值為 6.0。做為本發明的更進一步改進，所述步驟d中生產發酵培養基組成為體積百分含量為10%的脫脂奶乳濁液，向每份脫脂乳濁液中加入液態甘油、低聚木糖、葡萄糖，液態甘油與脫脂奶乳濁液的體積比為2%，低聚木糖與脫脂奶乳濁液的質量體積比為2%、葡萄糖與脫脂奶乳濁液的質量體積比為2%。本發明發酵床墊料制作如下以玉米1.5 — 2%，稻殼(不粉碎28. 5— 30%)，鋸末 40—50%,秸桿粉碎物20— 29%為發酵床墊料培養基，將本發明復合菌劑按15 — 20克/m2的比例，用40— 45°C溫水2000ml溶解后，噴灑添加到墊料(培養基)表面，30cm厚度充分混勻，自然條件下3— 5天后發酵成熟。本發明復合菌劑均為非致病性菌，其中羊肚菌菌絲體中的氨基酸含量異常豐富， 并含有稀有氨基酸及香味物質，風味奇鮮，研究發現羊肚菌是有效的免疫調節劑，具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤功能，真菌多糖并不能直接殺死腫瘤細胞，但卻可以促進機體T細胞和NK細胞的活性，從而達到抑制腫瘤細胞增生的目的；酵母菌有益于維持豬腸道的健康； 鏈霉菌可以對發酵床內滋生的非優勢菌起到抑制作用，利用維持優勢菌群的穩定；而芽孢桿菌屬的細菌由于芽孢保護，能耐受發酵高溫，生長優勢強，適合在發酵床中發揮優勢作用，且發酵床中優勢芽孢桿菌大多數能夠分泌過氧化氫酶、脲酶、蛋白酶等酶類，利用豬糞迅速生長，除臭效果良好；在特定時期能夠產生某些物質對大腸桿菌等有害菌的生長產生抑制作用，達到消納糞便，抑制病原菌，促進豬生長的作用；發酵床中優勢芽孢桿菌大部分對常用抗生素敏感，應用過程不會引入抗藥性基因，并且由于其抑菌作用和免用抗生素，可以顯著降低發酵床上飼養豬腸道抗藥性及藥物殘留。使用本發明發酵菌劑制作的發酵床可以明顯降低豬圈舍的臭味，減少蚊蠅滋生機會，提高豬的免疫力，保障豬能夠健康成長，同時具有實踐操作簡單發酵床制作簡單的特點。本發明的七株菌劑購買于中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；網址為http://WWW. cgmcc. net/， 點擊菌種供應中的菌種目錄,輸入菌種編號即可購買。
圖I是本發明菌種所制備的發酵床溫度變化圖。
具體實施例方式下面的實施例可以進一步說明本發明，但不以任何方式限制本發明。菌種的選擇
2號菌一羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496 ；
A 菌一枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. 1.108;
C 菌一嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. 1.1923;
D 菌一嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. 1.1866;
F菌一嗜熱酸雙歧桿菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. 1.2282; H 菌一阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314;
N 菌一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 本發明簡稱上述七株菌株為2號菌、A菌、C菌、D菌、F菌、H菌、N菌。菌株的培養基制備
2號菌一羊肚菌，培養基馬鈴薯提取液(南京澤朗農業發展有限公司)1000ml，葡萄糖20. Og,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 3. Og,七水硫酸鎂(MgSO4. 7H20) I. 5g，維生素B1O. 5g，瓊脂 15. 0g，pH 值為 6.0。A菌一枯草芽孢桿菌，牛肉提取物5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)5. 0g，葡萄糖5. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂15. 0g，蒸餾水1000ml，pH值為 7. O。C菌一嗜熱脂肪芽孢桿菌，培養基蛋白胨10. 0g，牛肉提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)3. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂15. 0，蒸餾水1000ml，pH值為7. O。D菌一嗜熱脂肪芽孢桿菌，培養基蛋白胨10. 0g，牛肉提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)3. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂15. 0，蒸餾水1000ml，pH值為7. O。F菌一嗜熱酸雙歧桿菌，培養基蛋白胨10.0，牛肉提取物10. 0g，酵母提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)5. Og,葡萄糖5. Og,磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0. 45g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 33g，氯化銨(NH4Cl) I. Og,七水硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0. Ig,體積百分含量為55%的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物(L-Cysteine. HCl H2O溶液)10. Oml,的體積百分含量為0. 1%樹脂天青溶液(Resazurin溶液)I. 0ml，體積百分含量為5%的九水硫化鈉溶液 10. Oml，蒸餾水 1000ml，pH 值為 7. 5。H菌一阿南德氏鏈霉菌，培養基酵母提取物(購買于上海滬宇生物科技有限公司)
2.0g，可溶性淀粉10. 0g，瓊脂15. 0g，蒸餾水1000ml，pH值為7. 3 ；
N菌一釀酒酵母，培養基12波美度的麥芽汁1000ml，瓊脂15. 0g，5波美度的麥芽汁 IOOml與瓊脂I. 5g的混合物(注麥芽汁制備稱大米500g，洗凈，加水4000ml，煮成米粥， 冷卻至60-65°C。將1500g麥芽粉摻入米粥中攪拌均勻，置于55-60°C保溫箱內糖化4小時， 即可取出過濾，將濾液裝瓶滅菌備用，用時將濾液稀釋至所需糖)；
實施例Ia.菌劑的活化
分別取體積百分含量為O. 9%生理鹽水10ml，置于7個250ml三角瓶中，于121°C溫度下滅活30分鐘后冷卻至30°C，在無菌狀態下，將七株菌種分別倒入上述7個裝有生理鹽水的250ml三角瓶中，震蕩溶解后，在30°C恒溫箱中靜止30分鐘，備用；
b.一級菌劑的制備
分別各量取七株菌的培養基200ml，分別置于7個500ml三角瓶中，于121 °C溫度下滅活30分鐘后冷卻至30°C，接種步驟2中已活化的菌種，在30—35°C搖床(轉速為150r/min) 上恒溫培養48h，作為一級菌種發酵菌劑；
c.生產發酵菌劑的制備
首先配置7份10%的脫脂奶乳濁液(每份4000ml)，再向每份脫脂乳濁液中加入液態甘油80ml、低聚木糖80g、葡萄糖80g,于121/C溫度下濕熱滅菌20分鐘，自然冷卻至 30°C，分別按5%的體積含量接種一級菌種，在30— 35°C搖床(轉速為150r/min)上恒溫培養36— 48h ;用紫外分光光度計檢測7株生產菌劑在460nm處OD值X，后依據數學模型 Y= (3. 14X+1. 42) X IO8估計每毫升菌液活菌含量。如生產發酵菌劑活菌數彡IO9個/ml，視同發酵成熟，如活菌數彡IO9個/ml，繼續在40°C搖床上恒溫培養，直到達到IO9個/ml ；
d.粉劑凍干菌種的制備
將發酵成熟的生產發酵菌劑在無菌條件下倒入安培瓶(165X165)中，液面低于1cm， 加蓋放入_30°C冰柜速凍，凍結后放入凍干機進行冷凍干燥；
e.復合菌劑的制備
按粉劑凍干菌種重量，取羊肚菌粉末10g，嗜熱脂肪芽孢桿菌I. 1923粉末20g，枯草芽孢桿菌粉末20g份，嗜熱脂肪芽孢桿菌I. 1866粉末20g，阿南德氏鏈霉菌粉末10g，嗜熱酸雙歧桿菌粉末20g，釀酒酵母2. 2081粉末30g，充分混勻后真空包裝，即可得到復合菌劑；
7.發酵床墊料制作
以玉米I %，稻殼30 % (不粉碎)，鋸末40%，秸桿粉碎物29 %為發酵床墊料(培養基)， 將本發明復合菌劑按15克/m2的比例，用40°C溫水2000ml溶解后，噴灑添加到墊料(培養基)表面，30cm厚度充分混勻，自然條件下3—5天后發酵成熟。實施例2
與實施例I不同處在于復合菌劑的制備及發酵床墊料制作，
復合菌劑的制備按粉劑凍干菌種重量，取羊肚菌粉末20g，嗜熱脂肪芽孢桿菌I. 1923 粉末50g，枯草芽孢桿菌粉末40g，嗜熱脂肪芽孢桿菌I. 1866粉末40g份，阿南德氏鏈霉菌粉末30g份，嗜熱酸雙歧桿菌粉末30g份，釀酒酵母2. 2081粉末50g份，充分混勻后真空包裝，即可得到復合菌劑。發酵床墊料制作
以玉米I. 5 %，稻殼28. 5 % (不粉碎)，鋸末50%，秸桿粉碎物20 %為發酵床墊料(培養基)，將本發明復合菌劑按20克/m2的比例，用45°C溫水2000ml溶解后，噴灑添加到墊料 (培養基)表面，30cm厚度充分混勻，自然條件下3—5天后發酵成熟。應用效果
一、發酵床溫度測定
試驗設對照組、試驗I組和試驗2組，對照組發酵床墊料接種市場上購買的益康發酵床專用益生菌劑(主要成分芽孢桿菌，放線菌、光合菌等)(按使用說明量每100公斤墊料添加50g)，試驗I組為實施例I生產的復合菌劑(復合菌劑按每100公斤墊料添加15克的比例)。試驗2組為實施例I生產的復合菌劑(復合菌劑按每100公斤墊料添加20克的比例)。分別選擇體重20kg左右健康無病的杜長大三元雜交保育豬60頭，隨機分為3組 (對照組和試驗組)，每組20頭。對照組和試驗組基礎日糧相同。試驗分別在第I一 14天每天取表層20cm處樣品，為提高試驗數據的可比性，每次樣品均在同一區域采取。取樣的同時，對墊料表層人工翻堆混勻。分析檢測樣品溫度和含水量變化。通過圖I所示可以看出，試驗組和對照組墊料溫度變化趨勢一致，都是先增長后下降，最后趨于穩定。環境氣溫變化對發酵床溫度變化的影響不大。在14天測試期， 試驗I組墊料溫度(43. 74°C)和試驗2組墊料溫度(45. 19°C )分別高于對照組墊料溫度(33. 590C ) 10. 16°C和11. 60°C，試驗I組、試驗2組墊料溫度均極顯著高于對照組(P
<O. 01);試驗2組墊料溫度高于試驗I組墊料溫度，但差異不顯著(P > O. 05)。三組墊料溫度均在第5d時達到峰值，分別為35. 90C >50. 2和54. 7. 6°C，隨后呈現下降，I Id后基本趨于穩定。試驗結果表明，以本次篩選的發酵床復合菌種對豬舍內發酵床溫度提升效果優與 “益康發酵床專用益生菌”。二、發酵床育肥豬飼養效果試驗
選擇斷奶仔豬90頭，體重20kg，分為3組，每組30頭，對照組飼養在傳統水泥地面； 試驗I組飼養在由本項目復合菌種制備的成熟發酵床上；試驗2組飼養在由“益康發酵床專用益生菌”制備的成熟發酵床上；同時保持三組圈舍的其他條件相同；試驗期102天。試驗測定1)記錄試驗正式開始和結束體重、耗料量；2)每天8 30和15 30記錄豬舍內溫度與相對濕度，每周二 9 00對豬舍內空氣采樣，測定氨氣濃度和懸浮顆粒濃度； 3)試驗期記錄驗收豬腹瀉和發病情況，試驗結束前一天，每組隨即抽取5頭豬空腹耳靜脈采血，測定血清免疫指標一免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgA、免疫球蛋白IgM。圖I是本發明菌種所制備的發酵床溫度變化圖。育肥豬生產性能測定見表1，冬季水泥地面豬舍及發酵床豬舍育肥豬血清免疫指標測定見表2，冬季水泥地面豬舍及發酵床豬舍育肥豬發病情況見表3。試驗結果顯示在冬季，生物環保(發酵床)養豬和我國傳統水泥地面養豬技術相比存在以下優勢
I)取暖效果好。圖I說明冬季(2010年10月 2012年2月)，發酵床舍內平均溫度高于水泥地面舍3. 4°C以上，整個飼養期內，發酵床舍內平均溫度為16. 62°C，極顯著高于水泥舍內的13.22°C (P〈0.01)。試驗地(武威市涼州區)冬季寒冷，一般最冷時間為每年的 I 2月份，最低溫度可達-18 -21°C左右。生物環保(發酵床)豬舍溫度更適宜豬的生長。試驗過程中測量的豬舍溫度為豬背部等高的環境溫度，該溫度遠遠低于發酵床表面溫度。試驗測定表示，發酵床表面溫度一般維持在24°C 26°C，此溫度遠遠高于水泥舍水泥地面的表面溫度10 14°C。2)生物環保(發酵床)豬舍內空氣質量得到改善。豬在發酵床墊料上生長，豬排泄的糞污被墊料中的微生物分解，豬舍基本無臭氣。而本試驗中盡管水泥地面舍采用干清糞方式，生物環保(發酵床)豬舍中的氨氣和懸浮顆粒濃度仍極顯著低于水泥地面舍(P<O. 01)，表明豬舍內環境得到改善，我國農產品安全質量無公害產地環境要求豬舍中氨氣的濃度彡25mg/m3，懸浮顆粒濃度彡3mg/m3。生物環保(發酵床)豬舍內環境達到了國家標準。3)豬福利明顯改善。表I說明發酵床墊料核心溫度保持在40°C以上，墊料表面溫度一般為24V 26°C,而水泥舍地表溫度為10 14°C。發酵床表面鋪墊鋸末、稻殼和秸桿，水泥舍地面為水泥，水泥面保暖性能差，散熱快，豬在水泥地面上趴臥，豬維持凈能相對增加，生產凈能相對減少，生物環保(發酵床)豬舍比水泥床豬舍日增重提高113g(100頭豬，平均日增重813g/日)，提高16. 71% ;料重比2. 94，比水泥床降低5. 5%(水泥床日增重 700g，料重比3. 31)。試驗中觀察到豬從進欄到出欄整個飼養過程中，生物環保(發酵床)豬舍豬扎堆次數明顯少于水泥地面豬舍，表明發酵床舍豬福利程度明顯改善。4)表2、表3表明說明本試驗中生物環保(發酵床)豬舍豬IgA、IgG濃度顯著高于水泥地面豬舍(p〈0. 05)。這與發酵床舍豬患病幾率低的報道相一致。盡管豬飼料中已添加抗生素，水泥地面豬舍豬仍存在氣喘等呼吸道疾病癥狀，而發酵床舍中未觀察到該現象。
表I育肥豬生產性能測定
權利要求
1.一種生物環保發酵床養豬發酵菌劑，其特征在于其組成和重量份配比為羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496 I一2 份、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1923 2-5 份、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1866 2—4 份、嗜熱酸雙歧桿菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282 2-3 份、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108 2-4份、阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314 1-3 份和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 3-5份，每一種發酵菌劑每毫升所含活菌數不小于IO9個。
2.權利要求I所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于該方法由以下步驟組成O菌種的培養a.菌劑的活化取羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) CGMCC NO. 1.1923、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1866、嗜熱酸雙歧桿菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108、阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4. 1314 和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 七株菌活化；b.制備液體培養基制備培養基各1000ml，備用；c.一級菌劑的制備分別各量取七株菌的培養基200ml，分別置于7個500ml三角瓶中，于121 °C溫度下滅活30分鐘后冷卻至30°C，接種步驟a中已活化的菌種，在30— 35°C溫度搖床上恒溫培養 48h，作為一級菌種發酵菌劑；d.生產發酵菌劑的制備首先配置7份生產發酵培養基，在于121°C溫度下濕熱滅菌20分鐘，自然冷卻至30°C， 分別按5%的體積含量接種一級菌種,在30—35°C溫度搖床上恒溫培養36—48h,使每一種發酵菌劑每毫升所含活菌數不小于IO9個；e.粉劑凍干菌種的制備將發酵成熟的生產發酵菌劑在無菌條件下倒入安培瓶中，加蓋放入冰柜速凍，凍結后放入凍干機進行冷凍干燥；2)按粉劑凍干菌種重量，取羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5.496 I— 2份、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. I. 1923 2-5 份、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. I. 1866 2一4 份、嗜熱酸雙歧桿菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282 2-3 份、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108 2-4 份、阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314 1-3 份和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 3-5份，充分混勻后真空包裝，即可得到復合菌劑。
3.根據權利要求2所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于步驟a.菌劑的活化過程為分別取體積百分含量為O. 9%生理鹽水10ml，置于7個250ml三角瓶中，于121°C溫度下滅活30分鐘后，冷卻至30°C，在無菌狀態下，將七株菌種分別倒入7個裝有生理鹽水的三角瓶中，震蕩溶解后，在30°C恒溫箱中靜止30分鐘。
4.根據權利要求3所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟b液體培養基中的嗜熱脂肪芽孢桿菌培養基組成為蛋白胨10. 0g，牛肉提取物3. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂15. 0，蒸餾水1000ml，pH值為7. O。
5.根據權利要求3所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟b液體培養基中的嗜熱酸雙歧桿菌培養基組成為蛋白胨10. 0，牛肉提取物10.Og,酵母提取物5. Og,葡萄糖5. Og,磷酸氫二鉀O. 45g,磷酸二氫鉀O. 33g,氯化銨I. Og, 七水硫酸鎂O. Ig,體積百分含量為55%的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物10. Oml,的體積百分含量為O. 1%樹脂天青溶液I. 0ml，體積百分含量為5%的九水硫化鈉溶液10. 0ml，蒸餾水 1000ml, pH 值為 7. 5。
6.根據權利要求3所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟b液體培養基中的枯草芽孢桿菌培養基組成為牛肉提取物5. Og,蛋白胨10.Og,酵母提取物5. Og,葡萄糖5. Og,氯化鈉5. Og,瓊脂15. Og,蒸餾水1000ml，pH值為7.O。
7.根據權利要求3所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟b液體培養基中的阿南德氏鏈霉菌培養基組成為酵母提取物2. 0g，可溶性淀粉10. 0g，瓊脂15. 0g，蒸餾水1000ml，pH值為7. 3。
8.根據權利要求3所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟b液體培養基中的釀酒酵母培養基組成為12波美度的麥芽汁1000ml、瓊脂15.0g、5波美度的麥芽汁IOOml與瓊脂I. 5g組成的混合物。
9.根據權利要求3所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟b液體培養基中的羊肚菌培養基組成為馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20.Og,磷酸二氫鉀3. Og,七水硫酸鎂I. 5g，維生素B1O. 5g，瓊脂15. 0g, pH值為6. O。
10.根據權利要求4-9所述的生物環保發酵床養豬發酵菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟d中生產發酵培養基組成為體積百分含量為10%的脫脂奶乳濁液，再向每份脫脂乳濁液中加入液態甘油、低聚木糖、葡萄糖，液態甘油與脫脂奶乳濁液的體積比為2%， 低聚木糖與脫脂奶乳濁液的質量體積比為2%、葡萄糖與脫脂奶乳濁液的質量體積比為2%。
全文摘要
本發明公開了一種生物環保發酵床養豬發酵菌劑及其制備方法，首先選擇羊肚菌(Morchella sp.)CGMCC NO.5.496，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) CGMCC NO.1.1923，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)CGMCC NO.1.1866，嗜熱酸雙歧桿菌(Bifidobacterium thermoacidophilum)CGMCC NO.1.2282，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CGMCC NO.1.108，阿南德氏鏈霉菌(Streptomyces anandii)CGMCC NO.4.1314，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC NO.2.2081七株菌為生產發酵母劑，各生產發酵母劑活菌數≥108個/ml，然后對7株生產發酵菌劑進行凍干，按粉劑凍干菌種重量，充分混勻后真空包裝，即可得到復合菌劑。使用本發明發酵菌劑制作的發酵床可以明顯降低豬圈舍的臭味，減少蚊蠅滋生機會，提高豬的免疫力，保障豬能夠健康成長，同時具有實踐操作簡單發酵床制作簡單的特點。
文檔編號C12R1/125GK102577985SQ20121004490
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者徐庚全, 王成泰, 王明奎, 謝占玲, 雷華 申請人:武威市金綠源農業科技發展有限公司