專利名稱：一種腈水解酶及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種新的腈水解酶及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，利用重組表達轉化體制備重組酶的方法，以及該重組腈水解酶在水解鄰氯扁桃腈或其結構類似物，制備(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物方面的應用。
背景技術：
(R)-鄰氯扁桃酸是抗凝血類藥物氯吡格雷的重要手性中間體。而其類似物是一類重要的手性合成砌塊，被廣泛應用于多種藥物的合成。如頭孢類半合成抗生素、抗腫瘤及抗衰老藥物的重要中間體；也可以作為手性拆分試劑，用于拆分其他的手性藥物或醫藥中間體。目前研究人員已經開發出多種制備(R)-鄰氯扁桃酸的方法，主要有化學法和生物法。傳統的化學拆分法，主要是利用手性胺類化合物，如α-甲基芐胺、(-)_麻黃堿和辛可寧等，通過與外消旋的鄰氯扁桃酸形成非對映異構體鹽的方法，得到單一對映體的鄰氯扁桃酸。生物法制備00-鄰氯扁桃酸已經成為研究的熱點。例如，酯酶途徑主要有兩種 第一種，是在鄰氯扁桃酸的羥基上酰化，然后由酯酶催化拆分，從而得到光學純的產物和剩余底物(Appl Microbiol Biotechnol，2010，86 :83-91)。第二種，則是在鄰氯扁桃酸的羧基上甲酯化，然后酶促拆分(Biotechnol Bioeng，2008，101 :460-469)。除了酯酶催化拆分之外，還有文獻報道了氧化還原酶不對稱還原鄰氯苯甲酰甲酸，生成(R)-鄰氯扁桃酸(J Chem Technol Biot，2009，84 1787-1792)。腈水解酶能夠催化有機腈化合物一步水解為羧酸并產生等摩爾量的氨，該過程反應條件溫和，不需要任何輔因子的參與，反應效率高，反應過程具有較好的區域和立體選擇性。由于鄰氯扁桃腈易于大規模生產且成本低廉；更為重要的是，當(R)-鄰氯扁桃腈被對映選擇性地酶促水解為(R)-鄰氯扁桃酸后，剩余的(S)-鄰氯扁桃腈在弱堿性條件下可以自發地消旋轉化為外消旋的鄰氯扁桃腈，這樣理論上可以得到100%的產率。因此，獲得對鄰氯扁桃腈具有高水解活性和對映選擇性的腈水解酶，有利于實現(R)-鄰氯扁桃酸的大規模工業化生產。而目前，已知的腈水解酶對于鄰氯扁桃腈的底物耐受性普遍較差，多數在 50mmol/L 以下(J Am Chem Soc，2002，124 :9024-9025 ;J Ind Microbiol Biotechnol, 2010,37 :741-750 ；Enzyme Microb Technol，2010，47 140-146)。雖然已有文獻報道腈水解酶能夠在水-甲苯兩相體系中水解200mM鄰氯扁桃腈，但其產率和ee較低，產物濃度 157mmol/L, ee = 90. 4% (J Biotechnol, 2011，152 :24-29)。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種新的水解鄰氯扁桃腈獲得手性(R)-鄰氯扁桃酸的腈水解酶，該腈水解酶在所述催化反應中底物耐受性好，產率和ee值較高，具有催化活性高、對映選擇性強、對環境友好的優點。本發明還提供該腈水解酶基因以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，重組酶的制備方法，以及該重組腈水解酶的應用。本發明通過下述技術方案解決上述技術問題本發明的技術方案之一是一種腈水解酶，該腈水解酶是如下(a)或(b)的蛋白質；(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；(b)在蛋白質(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質。蛋白質(b)是在蛋白質(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質。其中，所述的“幾個”是指二個至小于100個， 更佳的小于30個。比如添加一個外分泌信號肽的融合蛋白，只要該融合蛋白還是具有腈水解酶活性，本發明發現這樣的融合蛋白同樣可以水解鄰氯扁桃腈獲得手性(R)-鄰氯扁桃酸的腈水解酶，并達到底物耐受性好，產率和ee值較高的效果。也就是說本發明發現只要由(a)衍生的蛋白質具有腈水解酶活性，且衍生方式如上所述，則都可以達到本發明的發明目的。本發明所述的腈水解酶來源于Labrenzia aggregate，更佳的來源于Labrenzia aggregate DSM 13394。所述的腈水解酶可以從Labrenzia aggregate中分離獲得，也可以從重組表達該腈水解酶的表達子中分離獲得，也可以人工合成獲得。根據本發明，在如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的蛋白質(a)分子中進行1_3個氨基酸殘基的突變，也可獲得上述蛋白質(b)，但仍然保持腈水解酶活性，并催化鄰氯扁桃腈水解獲得手性(R)-鄰氯扁桃酸，例如將SEQ ID No.2第14位的Ile突變為Val，第31位的Glu突變成Gln，第39位的Ile突變為Leu所得的突變蛋白質，其序列如SEQ ID No. 4, 在所述的催化反應中仍然具有底物耐受性好，產率和ee值較高的特點。本發明中氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的腈水解酶，與已知腈水解酶的氨基酸序列的同源性低于60%，具有顯著性差異。本發明所述的腈水解酶可以作為催化劑催化鄰氯扁桃腈或其結構類似物水解得到光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物。本發明的技術方案之二是一種腈水解酶基因，所述的腈水解酶基因是如下(1) 或O)的基因(1)其堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；(2)編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；(b)在(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的蛋白質。本發明的腈水解酶基因來源于Labrenzia aggregate，更佳的來源于Labrenzia aggregate DSM 13394。所述的腈水解酶基因可以從Labrenzia aggregate基因組中分離獲得，也可以從該腈水解酶基因的重組載體中或者重組表達子中分離獲得，也可以全人工合成獲得。本發明所述的腈水解酶基因之一堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，命名為LaN，全長1008bp。其中，其編碼序列(⑶幻從第1個堿基起至第1008個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。該序列無內含子，其編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2 所示。更佳地，本發明將所述的Labrenzia aggregate DSM 13394的腈水解酶全長基因序列(SEQ ID No. 1)進行1-3個堿基突變，例如將Labrenzia aggregate DSM 13394的腈水解酶基因編碼序列的第91位的G突變為C，第501位的C突變T，第636位的A突變成G，從而得到突變的基因，其序列如SEQ ID No. 3所示。該突變基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，仍然具有腈水解酶活性，可以催化鄰氯扁桃腈水解獲得手性(R)-鄰氯扁桃酸。如本領域技術人員所知，本發明的腈水解酶基因的堿基序列也可以是編碼序列表中SEQ ID似.2(或似.4)所示氨基酸序列的其他任何堿基序列。例如，由于密碼子的簡并性，編碼SEQ ID No. 2 (或4)的氨基酸序列的堿基序列不僅僅局限于SEQ ID No. 1 (或3)。 另外，還可以通過適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。 本發明中多聚核苷酸的同系物可以通過對堿基序列SEQ ID No. 1(或幻的一個或多個堿基在保持酶活性范圍內進行替換、缺失或增加來制得。SEQ ID No. 1 (或3)的同系物也指啟動子突變體。在所述的堿基序列之前的啟動子或信號序列可通過一個或多個核苷酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對啟動子的功能沒有負面影響。而且通過改變啟動子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動子完全替換，可提高目標蛋白的表達水平，例如對本發明有利的調節序列可來自于革蘭氏陰性菌的啟動子中，如 cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、T7、T5、T3、gal、trc、ara、 SP6等；或存在于革蘭氏陽性啟動子amy和SP02中；或來自于真菌或酵母啟動子ADC1、AC、 P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp^、ADH等；或者來自Hansenula的丙酮酸脫羧酶啟動子或人工啟動子等。SEQ ID No. 1 (或No. 3)的同系物還指一種具有在標準條件下能夠與SEQ ID No. 1(或N0J)所示序列的多聚核苷酸進行雜交的堿基序列的多聚核苷酸。在標準條件下進行雜交可根據“分子克隆”中描述的方式進行Cold Spring Harbor Laboratory Press, 分子生物學中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具體來說，雜交可以按照如下步驟進行，將一個載有被轉錄的待測DNA或RNA分子的膜與一個標記探針在雜交緩沖液中進行雜交。雜交緩沖液的組成為0. Iwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20 的稀釋抑制劑以及2 8XSSC。20XSSC為3M氯化鈉和0.3M的檸檬酸組成的溶液。雜交溫度為50 70°C。在培養幾個小時或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜。清洗溫度為室溫，更優選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成為6XSSC+0. Iwt % SDS溶液，更優選為5XSSC+0. Iwt % SDS0當用這種清洗緩沖液清洗完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內被雜交的探針上的標記來識別DNA或RNA分子。本發明的技術方案之三是一種包含本發明所述的腈水解酶基因的重組表達載體。本發明所述的重組表達載體可通過本領域常規方法將本發明的腈水解酶基因連接于各種表達載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，如市售的質粒 (大腸桿菌中合適載體有 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pHS2、pMBL等)、粘粒(pHZ13》、噬菌體或病毒載體(反轉錄病毒載體，腺病毒載體)等所述質粒代表一小部分的可能質粒，其他質粒為技術人員公知。本發明所述重組載體較佳地采用pET28a質粒。較佳地，可通過下述方法制得本發明的重組表達載體將通過上游引物 5，-CCGGAATTCATGAAAGCTATCAAGGTTGCCG-3，，下游引物:5，-CCGCTCGAGCTACTCCTCGACCTCAA AAGGC-3’。PCR擴增所得的腈水解酶基因產物和表達載體pET28a用限制性內切酶EcoRI和 XhoI雙酶切，形成互補的粘性末端，再經T4DNA連接酶連接，生成含有本發明的腈水解酶基因片段的重組表達載體pET-LaN。本發明的技術方案之四是一種重組表達轉化體，該重組轉化體包含本發明所述的腈水解酶基因的重組表達載體。其可通過將本發明的重組表達載體轉化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領域常規的各種宿主微生物，只要能滿足重組表達載體可穩定的自行復制，且所攜帶的本發明的還原酶基因可被有效表達即可。本發明優選大腸桿菌，更優選大腸埃希氏菌 (E. coli)BL21(DE3)或大腸埃希氏菌(E. coli)DH5a。將本發明前述重組表達質粒pET_LaN 通過常規轉化方法，轉化至Ε. coli BL21(DE3)中，即可得本發明優選的基因工程菌株，即 E.coli BL21(DE3)/pET-LaNο本發明的技術方案之五是一種重組腈水解酶或含重組腈水解酶的微生物細胞的制備方法，包括如下步驟培養所述的重組表達轉化體，獲得重組表達的腈水解酶或含重組腈水解酶的微生物細胞。其中，所述的重組表達轉化體同前述介紹，可通過將本發明的重組表達子轉化至宿主微生物得到。其中，所述的培養重組表達轉化體中所用的培養基可為本領域任何可使轉化體生長并產生本發明的腈水解酶的培養基，優選LB培養基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/ L, NaCl 10g/L，pH7.0。培養方法和培養條件沒有特殊的限制，培養方法和培養條件可以根據宿主類型和培養方法等因素的不同按本領域普通知識進行適當的選擇，只要使轉化體能夠生長并產生本發明所述的腈水解酶即可。其他培養轉化體具體操作均可按本領域常規操作進行，優選下述方法將本發明涉及的的重組大腸桿菌(優選E.coli BL21(DE3)重組表達轉化體接種至含卡那霉素的LB培養基中培養，當培養液的光密度OD6tltl達到0. 5-0. 7 (優選0.6)時，在終濃度為0. 1-l.Ommol/L (優選0. 5mmol/L)的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導下，高效表達本發明的重組腈水解酶。本發明中催化鄰氯扁桃腈或其結構類似物水解得到光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物的催化劑，可以是上述產生重組腈水解酶的轉化體的培養物，也可以是通過將培養基離心分離后得到的轉化體細胞或者用其加工的制品。這里“加工的制品”是指由轉化體得到的提取物、或通過對提取物的腈水解酶進行分離和/或純化得到的分離產品、或者通過固定化轉化體細胞或提取物或轉化體的分離產品而得到的固定化制品。本發明的技術方案之六是一種所述的腈水解酶或含重組腈水解酶的微生物細胞作為催化劑以鄰氯扁桃腈或其結構類似物為底物進行水解反應，得到光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物的應用。本發明中，所述的鄰氯扁桃腈或其結構類似物是如式(I)所示的化合物，所述的 (R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物是如式(II)所示的化合物；CN 102533705 A
OHOH
(I )(II)其中，R代表 H，Cl。當R為Cl，并在鄰位取代時，其為鄰氯扁桃腈。在本發明的一較佳實例中，所述的水解反應在單水相反應體系中進行，包括以下步驟將含重組腈水解酶的微生物細胞懸浮于PH為6. O 9. O的緩沖水溶液中，加入式(I) 所示的鄰氯扁桃腈或其結構類似物作為底物進行反應，從反應液中分離提取式(II)所示的光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物。在本發明的另一較佳實例中，所述的水解反應在兩相反應體系中進行，包括以下步驟將含重組腈水解酶的微生物細胞懸浮于PH為5. O 10. O的緩沖水溶液中，加入疏水性有機溶劑，加入式(I)所示的鄰氯扁桃腈或其結構類似物作為底物進行反應，從反應液中分離提取式(II)所示的光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物。在所述的單水相或兩相反應體系中，在本發明的重組腈水解酶的作用下，對鄰氯扁桃腈或其結構類似物進行對映選擇性水解反應，制得(R)-鄰氯扁桃酸或其類似物。本發明的方法中，所述的底物濃度通常為1 500mmol/L。考慮到反應的效率，底物濃度優選為大于等于50mmol/L。較佳的，在單水相反應體系中，式(I)所示的鄰氯扁桃腈或其結構類似物在反應液中的濃度為1 200mmol/L，優選50 200mmol/L ；在兩相反應體系中，式(I)所示的鄰氯扁桃腈或其結構類似物在反應液中的濃度為1 500mmol/L，優選 50 300mmol/L(以兩相總體積計算)。在反應時分批添加底物，可以提高生產效率。反應所生成的產物可以在反應結束后分離，也可以通過原位分離的方法不斷地將產物移走。本發明的方法中，所使用的催化劑較佳的是含所述重組腈水解酶的微生物細胞的整細胞，其用量較佳的為1 300g/L。本發明的方法中，所述的緩沖水溶液是常規的腈水解酶可以發揮酶活性的緩沖水溶液，較佳的如磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、巴比妥鈉緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液等。本發明的方法中，所述水解反應的反應溫度是常規的腈水解酶可以發揮酶活性的溫度，可以是15-50°C，優選20-40°C，最優選30°C。本發明的方法中，所述水解反應的反應時間是常規，一般到反應至反應完全為止。在本發明所述的在兩相反應體系中的水解反應方法中，所述的疏水性有機溶劑是本領域常規的疏水性有機溶劑，較佳的是疏水性極性有機溶劑，如選自碳鏈長5 9的烷烴類(直鏈、支鏈或環化)、乙酸乙酯，乙酸丁酯，氯仿、正辛醇、苯和甲苯中的一種或多種， 均可取得較佳的反應結果，其中以甲苯最佳。兩相的體積比例是有機相水相=0 10 4 1。在本發明方法中制備的鄰氯扁桃酸可簡單地通過萃取來從水相中分離。為此，先用堿(如氫氧化鈉和氨水)來堿化反應液，優選將PH調至8. 0 9. 0，然后用有機溶劑萃取以除去反應液中的雜質，可以重復幾次以徹底去除雜質及未反應完的底物。然后，再加入酸 (如鹽酸或硫酸)來酸化反應液，優選PH值在1. 0 2. 0之間，再用有機溶劑萃取，可以重復幾次以提高產率。有機溶劑包括乙酸乙酯、乙醚、甲苯或正己烷等，本發明中較佳地采用甲苯為有機相。通過將有機溶劑濃縮或去除后，即可得到較高化學純度的產物，還可以通過重結晶來進一步提高產物的化學純度和光學純度。通過以上優選的方法，本發明方法的產物可以以60% -98%的產率分離。分離的產物具有很高的化學純度和光學純度，經過重結晶之后其對映體過量值高于99%。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于本發明的LaN與已知的腈水解酶相似性低 (< 60% )，該酶對于鄰氯扁桃腈具有較高的比活力以及很好的選擇性。本發明的腈水解酶或其重組酶可作為催化劑應用于制備(R)-鄰氯扁桃酸及其類似物，具有催化效率高，對映選擇性強，且產物光學純度高，反應條件溫和，對環境友好，操作簡便，易于工業放大，因此具有很好的工業應用前景。
以下結合
本發明的特征和有益效果。圖1為基因LaN的PCR擴增電泳圖譜。其中，1、基因LaN的PCR擴增產物；2、DNA Marker (Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。圖2為重組表達質粒pET-LaN的構建示意圖。圖3為重組腈水解酶LaN的聚丙烯凝膠電泳圖(泳道1為破碎上清，泳道2為純酶)。
具體實施例方式本發明人通過基因組數據庫挖掘的方法分析了一些基因組序列，候選了一批在一些生物信息學上被預測為腈水解酶基因序列。所述的挖掘方法具體為，以來自Alcaligenes sp. E⑶0401的腈水解酶Alcaligenes sp. nitrilase的氨基酸序列為模板探針，在NCBI數據庫中進行PBLAST搜索，選出一批預測的腈水解酶序列。然后將這些候選基因分離出來， 進行克隆表達，構建重組大腸桿菌細胞，驗證其功能。通過測定對鄰氯扁桃腈的活力以及立體選擇性，對克隆的腈水解酶進行比較，獲得催化性能最佳的腈水解酶。實驗證明這些候選基因(7個)均能夠選擇性水解鄰氯扁桃腈，生成光學純的(R)-鄰氯扁桃酸。它們針對鄰氯扁桃腈的活力普通集中在0. 10 0.80U/mg protein，產物(R)-鄰氯扁桃酸的ee值均> 70%,為此，我們從這7個腈水解酶中選擇了活力和選擇性最佳的腈水解酶LaN作為后續實驗所用的酶，從而完成了本發明。下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照生產廠商所建議的條件。下列實施例中的材料來源為菌株 Labrenzia aggregate DSM 13394，從 DSMZ 購買所得。
表達載體質粒pET28a購自上海Novagen公司。E.coli DH5a 和 Ε· coli BL21(DE3)感受態細胞，2XTaq PCR MasterMix，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。實施例1過程如圖2所示。實施例1腈水解酶基因的克隆根據 Genbank 中收錄的 Labrenzia aggregate 的基因序列 Genbank Accession NZ_AAUW01000019. 1 設計 PCR 引物如下引物(擴增LaN基因)上游引物5，-CCGGAATTCATGAAAGCTATCAAGGTTGCCG-3，，下游引物5，-CCGCTCGAGCTACTCCTCGACCTCAAAAGGC-3，。其中，上游引物下劃線部分為EcoRI酶切位點，下游引物下劃線部分為BioI酶切位點，CCG為保護堿基。以 Labrenzia aggregate DSM 13394，(購自 DSMZ)的基因組 DNA 為模板，加入引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR體系為2XTaq PCR MasterMix 15μ1，上游引物和下游引物各 1 μ 1 (0. 3 μ mol/L)，DNA 模板 1 μ 1 (0. 1 μ g)禾Π ddH20 12 μ 1。PCR 擴增步驟為 (1)95°C，預變性 5min ;(2)94°C，變性 60s ;(3)60°C退火 30s ;(4)72°C延伸 60s ；步驟(2) (4)重復35次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收IOOObp左右的目標條帶(見圖1)。送上海生工公司測序， 確認是目的條帶，如此獲得一條完整的腈水解酶全長基因序列，命名為LaN，全長1008bp， 堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示； 實施例2重組表達質粒和重組表達轉化體的制備將實施例1所得的PCR產物在37°C用限制性內切酶EcoRI和BioI雙酶切6h，經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標片段，其中含有正確的插入片段。將目標片段與同樣經EcoRl和XhoI酶切后的質粒pET28a混合，在T4 DNA連接酶的作用下，4°C連接過夜得到重組表達質粒pET-LaN。將上述重組表達質粒轉化到Ε. coli DH5a感受態細胞中。在含有卡那霉素的抗性平板(培養基成分LB培養基，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L和瓊脂2%，抗生素含量50mg/L)上對陽性重組體進行篩選，挑取單克隆，培養重組菌株，待質粒擴增后提取質粒，重新轉化至E. coli BL21(DE3)感受態細胞中。轉化液涂布到含有卡那霉素(50mg/L) 的LB平板上，37°C倒置培養過夜，獲得陽性重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3) /PET_LaN。實施例3重組腈水解酶的表達將實施例2所得的重組大腸桿菌，接種至含卡那霉素(50mg/L)的LB培養基中， 37°C振蕩培養過夜。按(ν/ν)的接種量接入裝有50ml LB培養基的250ml三角燒瓶中，置37°C、ISOrpm搖床震蕩培養。當培養液的OD6tltl達到0. 6時，加入終濃度為0. 5mmol/L 的IPTG進行誘導。16°C誘導24h后，將培養液離心，收集細胞，并用生理鹽水洗滌兩次，得 0. 1 0. 5g濕細胞，總活力5 40U。重組腈水解酶的制備將所得的靜息細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(lOOmmol/L， pH8. 0)中，在冰水浴中超聲破碎(功率400W，工作6s，間隙如，超聲99次)。8800rpm離心 20min收集上清液，即為重組腈水解酶的粗酶液。粗酶液經聚丙烯酰胺凝膠電泳圖分析(見圖3)，重組蛋白以可溶的形式存在。細胞凍干粉的制備將所得靜息細胞均勻涂布在容器內(水果盤)，厚度< 0.5cm。 置于_80°C冰箱預冷他，在迅速置于冷凍干燥機內，冷凍干燥48h。干燥后，收集細胞凍干粉于干燥的小瓶中。實施例4利用LaN重組腈水解酶催化水解鄰氯扁桃腈(式I中，R為Cl，并在鄰位取代)在Iml磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液中(lOOmM，pH6 9)，加入0. 2U重組腈水解酶(實施例3制備的粗酶液)，加入終濃度為IOmM的鄰氯扁桃腈，在20 40°C反應2h。 反應后，取500 μ 1樣品，加入100 μ 12Μ的鹽酸酸化，再加入500 μ 1的乙酸丁酯萃取。有機相加入無水硫酸鈉干燥過夜，用高效液相色譜(手性OJ-H柱)分析產物濃度以及ee值。 HPLC分析條件如下流動相為正己烷異丙醇三氟乙酸=92 8 0. 2。柱溫25°C。結果如表1所示。表1.利用LaN重組腈水解酶催化水解鄰氯扁桃腈的結果
權利要求
1.一種腈水解酶，其特征在于，該腈水解酶是如下(a)或(b)的蛋白質；(a)其氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示；(b)在(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的蛋白質。
2.如權利要求1所述的腈水解酶，其特征在于，所述的(b)的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
3.一種腈水解酶基因，其特征在于，所述的腈水解酶基因是如下(1)或O)的基因(1)其堿基序列如序列表中SEQID No. 1所示；(2)編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因(a)其氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示；(b)在(a)的基礎上經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有腈水解酶活性的蛋白質。
4.如權利要求3所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述的(b)的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
5.一種包含如權利要求3或4所述的腈水解酶基因的重組表達載體。
6.一種重組表達轉化體，其特征在于，該重組轉化體包含如權利要求3或4所述的腈水解酶基因或如權利要求5所述的重組表達載體。
7.—種重組腈水解酶或含重組腈水解酶的微生物細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟培養如權利要求6所述的重組表達轉化體，獲得重組表達的腈水解酶或含重組腈水解酶的微生物細胞。
8.—種如權利要求1所述的腈水解酶或含重組腈水解酶的微生物細胞作為催化劑以鄰氯扁桃腈或其結構類似物為底物進行水解反應，得到光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物的應用，所述的鄰氯扁桃腈或其結構類似物是如式(I)所示的化合物，所述的 (R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物是如式(II)所示的化合物；
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的水解反應在單水相反應體系中進行， 包括以下步驟將含重組腈水解酶的微生物細胞懸浮于pH為6. 0 9. 0的緩沖水溶液中， 加入式(I)所示的鄰氯扁桃腈或其結構類似物作為底物進行反應，從反應液中分離提取式 (II)所示的光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物。
10.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的水解反應在兩相反應體系中進行， 包括以下步驟將含重組腈水解酶的微生物細胞懸浮于PH為5. 0 10. 0的緩沖水溶液中， 加入疏水性有機溶劑，加入式(I)所示的鄰氯扁桃腈或其結構類似物作為底物進行反應，從反應液中分離提取式(II)所示的光學純(R)-鄰氯扁桃酸或其結構類似物。
全文摘要
本發明公開了一種新的腈水解酶及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，利用重組表達轉化體制備該重組腈水解酶或含該重組腈水解酶的微生物細胞的方法，以及該微生物細胞在水解鄰氯扁桃腈或其結構類似物，生產手性鄰氯扁桃酸或其結構類似物的用途。本發明所述的重組腈水解酶來源于Labrenzia aggregate，可作為催化劑用于水解拆分鄰氯扁桃腈或其結構類似物，具有催化效率高，對映選擇性強，反應條件溫和對環境友好等優點。
文檔編號C12N15/63GK102533705SQ20121004436
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者張志鈞, 張陳勝, 李春秀, 潘江, 許建和 申請人:華東理工大學