專利名稱：一種手性氨基酸的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明具體的涉及ー種手性氨基酸的制備エ藝。
背景技術：
氨基酰化酶拆分生產氨基酸是氨基酸尤其是非天然氨基酸生產的主要エ藝。其操作エ藝一般為L-氨基酸或者DL-氨基酸在冰こ酸為溶劑下，高溫下與醋酐反應制備出こ酰化-DL-氨基酸，然后こ酰化-DL-氨基酸配成PH7. 5-8. 0的溶液，加入氨基酰化酶，こ酰化-DL-氨基酸轉換成為D-或者L-氨基酸。使用的氨基酰化酶有D-氨基酰化酶和L-氨基酰化酶兩種酶，這兩種酶都已經商品化，而且有固定化的氨基酰化酶。氨基酰化酶拆分生產氨基酸，能否充分發揮酰化酶的催化活力、提高轉化率是エ藝的主要技術指標。實際應用此エ藝拆分氨基酸的過程中，常常發生酶拆分效率低，拆分不徹底的現象，輕則影響成本和質量，重則造成拆分失敗。其重要原因是こ酰化氨基酸的雜質較多，造成了酶的抑制。眾所周知，酶作為生物催化劑，發生催化作用的是活性中心，有很多底物，其活性基團會抑制活性中心，造成酶的活力降低甚至造成酶的失活。在氨基酸的醋酐-冰こ酸體系高溫こ酰化過程中，有以下雜質こ酰化氨基酸，こ酰化氨基酸和氨基酸之間形成的小肽，氨基酸之間、こ酰化氨基酸之間縮水形成的酮類化合物，這些化合物都有肽鍵結構，因為都可能和氨基酰化酶的活性中心結合，進而抑制酶的活性或者造成酶的失活。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的氨基酰化酶拆分生產手性氨基酸的方法中，易發生酶拆分效率低，拆分不徹底等缺陷，而提供了一種手性氨基酸的制備エ藝。本發明的制備エ藝可有效去除氨基酰化酶拆分手性氨基酸的方法中的雜質，提高こ酰化含量，拆分效果與現有技術相比明顯提高。因此，本發明提供了一種手性氨基酸的制備エ藝，其包含下列步驟(I)以冰こ酸為溶劑，將L-氨基酸或者DL-氨基酸和醋酐進行こ酰化反應；(2)將步驟⑴得到的反應物在外溫50 95°C，壓カ為-0. OlMPa -0. IMpa下蒸餾20分鐘 5小時，降溫結晶，得到こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸；(3)將步驟⑵得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸，甲苯，以及甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液混合，升溫至外溫80 90°C，維持I. 5 2. 5小時(優選2小時)，然后在-0. OlMPa -0. IMPa壓カ下，外溫50 95°C下蒸餾4 6小時(優選5小時)，加入水，調整pH為7 8，即可；其中，所述的甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液的質量濃度為25% 35% (優選30% )，步驟(2)得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸與甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液的質量比為I : I I : 5(優選I : I I : 2);所述的甲苯與步驟(2)得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的體積質量比為I 5L/Kg ；(4)將步驟(3)得到的物質和D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶進行拆分，得到D-氨基酸或L-氨基酸。步驟(I)中，所述的こ酰化反應的方法和條件均可本領域此類反應的常規方法和條件，本發明特別優選下述方法和條件所述的L-氨基酸較佳的為L-苯丙氨酸或L-纈氨酸。所述的DL-氨基酸較佳的為DL-正亮氨酸。所述的冰こ酸與L-氨基酸或者DL-氨基酸的體積質量比較佳的為8 10L/Kg(優選9L/Kg)。所述的醋酐的摩爾量較佳的為L-氨基酸或者DL-氨基酸的摩爾量的I 2倍(優選I. 18倍)。步驟(4)中，所述的拆分的方法和條件均可為本領域此類拆分所用的常規方法和條件，本發明特別優選下述條件所述的D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶與步驟(3)得到的物質的質量比由該對應的氨基酸對D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶的比活力確定，一般D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶的實際使用量應該是使底物24小時內理論上轉化完畢的基礎上過量2-5倍。考慮到拆分的徹底性，上面所述的拆分的時間較佳的為50 80小時(優選72小吋)。拆分結束后，較佳的通過濃縮結晶，過濾，即得到D-氨基酸或L-氨基酸。過濾得到的濾液中為另ー絕對構型的こ酰化氨基酸，通過常用的水解反應方法，即可得到另ー構型的氨基酸。在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于本發明的制備エ藝可有效去除氨基酰化酶拆分手性氨基酸的方法中的雜質，提高こ酰化含量，拆分效果與現有技術相比明顯提高。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進ー步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述各實施例中，所用的D-氨基酰化酶和L-氨基酰化酶均購買自日本AMANO公司。對比實施例IL-苯丙氨酸165KG，加入冰こ酸1500L，加入醋酐120KG，回流溫度下反應2_3小吋，壓カ為-0. OlMPa，外溫50°C蒸餾冰こ酸3小吋，降溫結晶，得到こ酰化-DL-苯丙氨酸，經過HPLC分析こ酰化含量為92% ;將以上苯丙氨酸配成0. IM的苯丙氨酸溶液，加入D-氨基酰化酶5克拆分，72小吋，反應率80%。將反應液濃縮至小體積，降溫，結晶，過濾，得到D-苯丙氨酸,外觀灰色,含量95%,質量不合格。對比實施例2以DL-正亮氨酸為原料，采用以上同等摩爾配比，反應溫度110度，反應時間5小 吋，壓カ為-0. 08MPa,外溫90°C蒸餾冰こ酸2小吋，結晶后こ酰化含量88%;拆分反應72小吋，反應率40% ;濃縮結晶過濾，得到的氨基酸，外觀灰色，含量96%，質量不合格。對比實施例3以L-纈氨酸為原料，采用以上同等摩爾配比，反應溫度110度，反應時間5小吋，壓カ為-0. 08MPa，外溫95°C蒸餾冰こ酸5小時，結晶后こ酰化含量80%;拆分反應72小吋，反應率30% ;濃縮結晶過濾，得到的氨基酸，外觀灰色，含量93%，質量不合格。對比實施例4 L-苯丙氨酸165KG，加入冰こ酸1500L，加入醋酐120KG，回流溫度下反應2_3小吋，壓カ為-0. OSMPa,外溫95°C蒸餾冰こ酸，降溫結晶，得到こ酰化-DL-苯丙氨酸，經過HPLC分析こ酰化含量為92 % ;將以上苯丙氨酸配成0. IM的苯丙氨酸溶液，加入L-氨基酰化酶200克拆分，72小吋，反應率85%。將反應液濃縮至小體積，降溫，結晶，過濾，得到L-苯丙氨酸，外觀灰色，含量97%,質量不合格。實施例I對比實施例I制得的こ酰化-DL-苯丙氨酸200公斤，進料濃度92% (HPLC含量)，加入甲苯200L，以及質量濃度30%甲胺溶液500公斤，然后升溫溫度80-90度(外溫)，維持2小時，然后在-0. 0 IMPa, 70 V外溫下減壓蒸餾5小時，后加入水，調整PH = 7. 5，HPLC測定含量98%，直接加入D-氨基酸酰化酶3克拆分，72小時后拆分達到終點。將反應液濃縮至小體積，降溫，結晶，過濾，得到D-苯丙氨酸，外觀白色，含量99%，手性含量99. 7%，質量合格。濾液濃縮到小體積，調節PH到2，結晶，得到こ酰化-L-苯丙氨酸，加入0. 3M鹽酸回流水解2小時，回收鹽酸，調整至等電點，結晶，過濾，干燥，得到L-苯丙氨酸，含量99%，手性純度達到99. 5 %，產率為95 %。實施例2以DL-正亮氨酸為原料，采用與對比實施例I同等的摩爾配比，反應溫度110度，反應時間5小吋，壓カ為-0. IMpa，外溫90°C蒸餾冰こ酸5小時，結晶后HPLC檢測こ酰化的DL-正亮氨酸含量88% ;向こ酰化正亮氨酸中加入甲苯(甲苯的體積為こ酰化正亮氨酸質量的5倍，L/Kg)，再加入5倍體積(體積與こ酰化正亮氨酸的質量比為5L/Kg) 30%甲胺溶液后，升溫溫度80-90 (外溫)度，維持2小吋，然后在-0. 05MPa壓カ下，外溫95°C減壓蒸餾5小時，后加入水，調整PH = 7. 5，測定含量99%，直接加入D-氨基酸酰化酶5克拆分，72小時后拆分達到終點。濃縮結晶過濾，得到的D-正亮氨酸，外觀類白色，含量99%，質量合格，產率為95%。實施例3以L-纈氨酸為原料，采用與對比實施例I同等的摩爾配比，反應溫度110度，反應時間5小吋，壓カ為-0. 5Mpa，外溫70°C蒸餾冰こ酸3小吋，結晶后HPLC檢測こ酰化纈氨酸含量80% ;向こ酰化纈氨酸中加入甲苯(甲苯的體積為こ酰化纈氨酸質量的3倍，L/Kg),再加入5倍30%甲胺溶液后，升溫溫度80-90度，維持2小時，然后在-0. 08MPa壓カ下，夕卜溫75°C減壓蒸餾5小吋，后加入水，調整PH = 7. 5，測定含量97%，直接加入D-氨基酸酰化酶5克拆分，72小時后拆分達到終點。濃縮結晶過濾，得到的D-纈氨酸，外觀白色，含量99%，質量合格，產率為95%。實施例4L-苯丙氨酸165KG，，加入冰こ酸1500L，，加入醋酐120KG，，回流溫度下反應2_3小吋，壓カ為-0. IMPa,外溫95°C蒸餾冰こ酸20分鐘，降溫結晶，得到こ酰化-DL-苯丙氨酸205KG (折干計)，經過HPLC分析こ酰化含量為92% ;將以上こ酰苯丙氨酸加入甲苯500L，以及質量濃度30%的甲胺溶液500公斤，然后升溫溫度80-90度(外溫)，維持2小時，然后在-0. 05MPa,90°C外溫下減壓蒸餾5小時，后加入水，調整PH = 7. 5，測定含量98%，直接加入L-氨基酸酰化酶200克拆分，72小時后拆分達到終點。將反應液濃縮至小體積，降溫，結晶，過濾，得到L-苯丙氨酸，外觀白色，化學含量99%，手性含量99. 6%，質量合格。濾液濃縮到小體積，調節PH到2，結晶，得到こ酰化-D-苯丙氨酸，加入0. 3M鹽酸回流水解2小 吋，回收鹽酸，調整至等電點，結晶，過濾，干燥，得到D-苯丙氨酸，含量99 %，手性純度達到99. 5%，產率為 95%。
權利要求
1.一種手性氨基酸的制備エ藝，其特征在于包含下列步驟 (1)以冰こ酸為溶劑，將L-氨基酸或者DL-氨基酸和醋酐進行こ酰化反應； (2)將步驟(I)得到的反應物在外溫50 95°C，壓カ為-0.OlMPa -0. IMpa下蒸餾20分鐘 5小吋，降溫結晶，得到こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸； (3)將步驟(2)得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸，甲苯，以及甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液混合，升溫至外溫80 90°C，維持I. 5 2. 5小時，然后在-0. OlMPa -0. IMPa壓カ下，50 95°C下蒸餾4 6小時，加入水，調整pH為7 8，即可；其中，所述的甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液的質量濃度為25% 35%，步驟(2)得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸與甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液的質量比為I : I I : 5;所述的甲苯與步驟(2)得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的體積質量比為I 5L/Kg ； (4)將步驟(3)得到的物質和D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶進行拆分，得到D-氨基酸或L-氨基酸。
2.如權利要求I所述的制備エ藝，其特征在于步驟⑴中所述的L-氨基酸為L-苯丙氨酸或L-纈氨酸。
3.如權利要求I所述的制備エ藝，其特征在干步驟(I)中，所述的DL-氨基酸為DL-正亮氨酸。
4.如權利要求I 3任一項所述的制備エ藝，其特征在于步驟(I)中，所述的冰こ酸與L-氨基酸或者DL-氨基酸的體積質量比為8 10L/Kg.
5.如權利要求I 3任一項所述的制備エ藝，其特征在于步驟(I)中，所述的醋酐的摩爾量為L-氨基酸或者DL-氨基酸的摩爾量的I 2倍。
6.如權利要求I所述的制備エ藝，其特征在干步驟(3)中，所述的甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液的質量濃度為30%。
7.如權利要求I所述的制備エ藝，其特征在于步驟(3)中，步驟(2)得到的こ酰化的L-氨基酸或者こ酰化的DL-氨基酸與甲胺水溶液、こ胺水溶液或片堿水溶液的質量比為I : I I : 2。
8.如權利要求I所述的制備エ藝，其特征在于步驟(4)中，所述的拆分的時間為50 80小時。
9.如權利要求8所述的制備エ藝，其特征在于步驟(4)中，所述的拆分的時間為72小時。
10.如權利要求I所述的制備エ藝，其特征在于步驟(4)中，拆分結束后，通過濃縮結晶，過濾，即得到D-氨基酸或L-氨基酸。
全文摘要
本發明公開了一種手性氨基酸的制備工藝，包含下列步驟1)將L-氨基酸或者DL-氨基酸和醋酐進行乙酰化反應；2)將步驟1)得到的反應物蒸餾，降溫結晶；3)將步驟2)得到的乙酰化的L-氨基酸或者乙酰化的DL-氨基酸，甲苯，以及甲胺水溶液、乙胺水溶液或片堿水溶液混合，至80～90℃，維持1.5～2.5小時，在-0.001MPa～-0.1MPa，50～95℃下蒸餾4～6小時，加水，調pH為7～8；4)將步驟3)得到的物質和D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶進行拆分。本發明的制備工藝可有效去除氨基酰化酶拆分手性氨基酸的方法中的雜質，提高乙酰化含量，拆分效果與現有技術相比明顯提高。
文檔編號C12P41/00GK102628076SQ20121004620
公開日2012年8月8日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者劉明君, 曾磊, 查正興, 胡文進, 謝建, 馬士忠 申請人:濱海瀚鴻生化有限公司