Cpt1a基因或蛋白的定量檢測在食管鱗癌預后判斷中的應用的制作方法

專利名稱：Cpt1a基因或蛋白的定量檢測在食管鱗癌預后判斷中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、臨床預后判斷領域，具體涉及CPTlA基因的拷貝數或蛋白表達水平在食管鱗癌預后判斷中的應用。本發明還涉及CPTlA基因拷貝數和蛋白表達水平的檢測方法。
背景技術：
食管鱗狀細胞癌簡稱食管鱗癌，是人類常見的消化道惡性腫瘤之一。食管組織細胞在ー些生物、物理、化學及其他因素刺激下異常增生直至癌變為食管鱗癌的病理特點，進行性吞咽困難是其主要臨床表現。食管鱗癌的發病機制目前尚不清楚。全球毎年新增病例超過45萬，死亡病例超過38萬。值得注意的是，中國依然是食管鱗癌的高發地區。2006年全國第三次死因回顧抽樣人口調查資料顯示中國食管鱗癌高發縣標準化死亡率在10. 34/10萬-78. 32/10萬之間，占全部惡性腫瘤死亡的11. 69% -42. 61%。男女年齡調整死亡率合計為15. 78/10萬，均居惡性腫瘤死亡順位的第四位。特別是在多數農村高發區，食管鱗癌的發生率和死亡率多年來一直居高不下，是ー項嚴重的社會問題。食管癌預后很差，長期存活率低于5%。復發和遠處轉移是術后治療失敗的主要原因。目前臨床實踐中，病理分期是最重要、最可靠的預后指標，但是仍然需要更精確的標志物進ー步將術后病人劃分為高風險和低風險，進而采取更有效的治療。食管鱗癌的基因組改變中包含了許多可以用于早期診斷、預后判斷和藥物靶點的信息，因此許多的研究致カ于從基因組改變中尋找食管鱗癌的預后分子標志物。目前的研究發現，ー些染色體區域的基因組改變與預后有夫。Ueno等通過比較基因組雜交技術發現5pl5,8q24-qter和14q21的増益與食管鱗癌的不良預后顯著相關，多因素分析進ー步顯示5pl5是ー個獨立的預后因子。另ー項研究結果顯示病理分期、12p的増益和3p的缺失與短的無進展生存期相關，其中12p是獨立于病理分期的預后因素(Kwong D et al. 2004)。Carneiro課題組利用比較基因組雜交芯片技術篩選與食管鱗癌預后相關的基因組改變，結果表明1ρ36.32和19pl3. 3的增益是獨立的預測食管鱗癌術后生存的因素。另ー項比較基因組雜交芯片的工作發現4q、13q、20q和Xq的拷貝數改變與預后相關(Hirasaki etal. 2007)。盡管已發現了上述與食管鱗癌預后相關的DNA分子標志物，但是均未能應用于臨床檢測。CPTlA和CPTlB是肉堿棕櫚酰轉移酶I。CPTl定位于線粒體外膜，是細胞內脂肪 代謝的調控位點，并且具有將長鏈脂肪酸轉運入線粒體進行beta-氧化的功能。研究表明，CPTl可以與BCL2相互作用，而后者具有調節細胞凋亡的功能
發明內容
在此背景下，本發明系統研究了食管鱗癌中與預后相關的基因組改變，發現CPTlA所在的llql3. 2區域的増益具有預后判斷價值，進而在兩個獨立樣本中驗證該基因的増益與預后的關系，同時也發現CPTlA基因(Gene ID 1374)的拷貝數増加或蛋白的強表達與食管鱗癌不良預后相關。本發明的第一方面涉及CPTlA基因或蛋白的定量檢測試劑在制備食管鱗癌預后判斷試劑盒中的用途。根據本發明第一方面的用途，其中所述的CPTlA基因的定量檢測的方法為本領域常用的核酸定量檢測方法，例如可以為電泳法或定量PCR法。在本發明的一個實施方案，所述的CPTlA基因的定量檢測方法為實時熒光定量PCR的方法。根據本發明第一方面的用途，其中所述的CPTlA蛋白定量檢測的方法為本領域常用的蛋白定量檢測方法，例如可以為電泳法、色譜法或免疫組織化學的方法。在本發明的一個實施方案，所述的CPTlA蛋白的定量檢測方法為免疫組織化學法。 根據本發明第一方面的用途，其中所述的CPTlA基因或蛋白的定量檢測方法中包括使用定量檢測試劑的步驟。根據本發明第一方面的用途，其中所述的CPTlA基因的定量檢測試劑包括用于定量檢測CPTlA基因的寡核苷酸片段；任選地，還包括用于定量檢測GAPDH的寡核苷酸片段；任選地，還包括檢測緩沖液。根據本發明第一方面任ー項的用途，其中所述的寡核苷酸片段為引物或探針。在本發明的一個實施方案中，所述的寡核苷酸片段為引物。在本發明的一個實施方案中，其中用于定量檢測CPTlA基因的引物序列為SEQ IDNO 1和2所示序列；在本發明的一個實施方案中，其中用于定量檢測GAPDH的引物序列為SEQ ID NO :3和4所示序列。根據本發明第一方面的用途，其中所述的CPTlA蛋白的定量檢測試劑包括與CPTlA蛋白特異性結合的抗體，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；任選地，還包括檢測緩沖液。在本發明的一個實施方案中，其中所述的抗體為抗CPTlA的多克隆抗體，購于Proteintech 公司，其貨號為 15184-1-AP。根據本發明第一方面的用途，其中所述的食管鱗癌預后判斷方法為=CPTlA基因的拷貝數増加，則食管鱗癌患者術后生存期短；或者，CPTlA蛋白過表達，則食管鱗癌患者術后生存期短。在本發明的實施方案中，所述的CPTlA基因拷貝數可以利用實時定量PCR的方法測量得到；所述方法中包括使用擴增CPTlA基因的引物的步驟，以及使用擴增GAPDH基因的引物的步驟；測定結果采用2_“ct的方法進行分析。所述的實時定量PCR方法具體包括以下步驟配制體積為20 μ I的反應體系,包括10 μ I 2 XPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，2 μ I 樣品 DNA (5ng/μ 1)，1μ I引物混合液(10 μ M/每條引物)和7μ I去離子水；在7300或7900Real_TimePCR System (Applied Biosystems)上,進行如下程序先進行95°C IOmin的熱變性,然后進行40個循環，每個循環包括95°C 15sec和60°C Imin的程序。結果采用2_Λ "ct的方法進行分析。
所述的拷貝數增加是指，2_ΛΛα> I. 25，其中Λ ACt= Δ Ct (待測樣本)-Λ Ct (內參照)。其中所述的內參照為GAPDH。在本發明的實施方案中，所述的CPTlA蛋白表達水平可以利用免疫組織化學方法測量得到；所述的免疫組織化學方法中包括使用抗CPTlA多克隆抗體的步驟；在本發明的一個實施方案中，所述抗CPTlA多克隆抗體購于Proteintech公司，其貨號為15184-1-ΑΡ。所述的蛋白過表達是指在隨機觀察的3個視野中，強表達細胞所占比例平均值高于 50%。所述強表達細胞是指與陰性著色細胞相比有明顯著色的細胞，其中陰性著色細胞指目標蛋白不表達，不著色的細胞。在本發明的一個實施方案中，所述的免疫組織化學方法具體包 括以下步驟先將組織切片在65°C烘箱中烘烤30min，然后ニ甲苯脫蠟3次，每次lOmin，接著梯度こ醇水化(100%，85%，75% )，每次3min，然后置于IXPBS中洗滌2次，每次5min，用3%的過氧化氫處理IOmin后，接著用枸櫞酸鈉溶液修復抗原20min，經I XPBS洗滌后，加入抗CPTlA抗體，4°C過夜孵育，經I XPBS洗滌后，用pv9000試劑盒處理后，加DAB顯色，蘇木素復染，經梯度こ醇脫水(75%，85%，100% )和ニ甲苯透明后，封片和鏡檢。本發明的第二方面涉及用于食管鱗癌預后判斷的試劑盒，其包含CPTlA基因或蛋白的定量檢測試劑。根據本發明第二方面的試劑盒，其中所述的CPTlA基因的定量檢測試劑可以為用于核酸定量檢測的常用試劑，例如可以為用于定量檢測CPTlA基因的寡核苷酸片段；任選地，還包括用于定量檢測GAPDH的寡核苷酸片段；任選地，還包括檢測緩沖液。根據本發明第二方面任ー項的試劑盒，其中所述的寡核苷酸片段為引物或探針。在本發明的一個實施方案中，所述的寡核苷酸片段為引物。在本發明的一個實施方案中，其中用于定量檢測CPTlA基因的引物序列為SEQ IDNO 1和2所示序列；在本發明的一個實施方案中，其中用于定量檢測GAPDH的引物序列為SEQ ID NO :3和4所示序列。根據本發明第二方面任ー項的試劑盒，其中所述的CPTlA蛋白的定量檢測試劑可以為用于蛋白定量檢測的常用試劑，例如可以為與CPTlA蛋白特異性結合的抗體，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；任選地，還包括檢測緩沖液。在本發明的一個實施方案中，其中所述的抗體為抗CPTlA的多克隆抗體，購于Proteintech 公司，其貨號為 15184-1-AP。根據本發明第二方面任ー項的試劑盒，其中所述的食管鱗癌預后判斷方法為CPTlA基因的拷貝數増加，則食管鱗癌患者術后生存期短；或者，CPTlA蛋白過表達，則食管鱗癌患者術后生存期短。根據本發明第二方面任ー項的試劑盒，其中所述的CPTlA基因拷貝數可以利用實時定量PCR的方法測量得到；所述方法中包括使用擴增CPTlA基因的引物的步驟，以及使用擴增GAPDH基因的引物的步驟；測定結果采用2_“ct的方法進行分析。所述的實時定量PCR方法具體包括以下步驟配制體積為20 μ I的反應體系,包括10 μ I 2 XPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，2 μ I 樣品 DNA (5ng/μ 1)，1μ I引物混合液(10 μ M/每條引物)和7μ I去離子水；在7300或7900Real_TimePCR System (Applied Biosystems)上,進行如下程序先進行95°C IOmin的熱變性,然后進行40個循環，每個循環包括95°C 15sec和60°C Imin的程序。結果采用2_Λ 的方法進行分析。所述的拷貝數增加是指，2_ΛΛα> I. 25，其中Λ ACt= Δ Ct (待測樣本)-Λ Ct (內參照)。其中所述的內參照為GAPDH。在本發明的實施方案中，所述的CPTlA蛋白表達水平可以利用免疫組織化學方法測量得到；所述的免疫組織化學方法中包括使用抗CPTlA多克隆抗體的步驟；在本發明的一個實施方案中，所述抗CPTlA多克隆抗體購于Proteintech公司，其貨號為15184-1-ΑΡ。所述的蛋白過表達是指在隨機觀察的3個視野中，強表達細胞所占比例平均值高于 50%。所述強表達細胞是指與陰性著色細胞相比有明顯著色的細胞，其中陰性著色細胞 指目標蛋白不表達，不著色的細胞。在本發明的一個實施方案中，所述的免疫組織化學方法具體包括以下步驟先將組織切片在65°C烘箱中烘烤30min，然后ニ甲苯脫蠟3次，每次lOmin，接著梯度こ醇水化(100%，85%，75% )，每次3min，然后置于IXPBS中洗滌2次，每次5min，用3%的過氧化氫處理IOmin后，接著用枸櫞酸鈉溶液修復抗原20min，經IXPBS洗滌后，加入抗CPTlA抗體，4°C過夜孵育，經I XPBS洗滌后，用pv9000試劑盒處理后，加DAB顯色，蘇木素復染，經梯度こ醇脫水(75%，85%，100% )和ニ甲苯透明后，封片和鏡檢。本發明的第三方面涉及檢測食管鱗癌患者CPTlA基因拷貝數或蛋白表達水平的方法。在本發明的一個實施方案中，所述的CPTlA基因拷貝數可以利用實時定量PCR的方法測量得到；所述方法中包括使用擴增CPTlA基因的引物的步驟，以及使用擴增GAPDH基因的引物的步驟；測定結果采用2_“ct的方法進行分析。所述的實時定量PCR方法具體包括以下步驟配制體積為20 μ I的反應體系,包括10 μ I 2 XPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，2 μ I 樣品 DNA (5ng/μ I)，I μ I引物混合液(10 μ M/每條引物)和7 μ I去離子水；在7300或7900 Real-TimePCR System (Applied Biosystems)上,進行如下程序先進行95°C IOmin的熱變性,然后進行40個循環，每個循環包括95°C 15sec和60°C Imin的程序。結果采用2_Λ "ct的方法進行分析。當2_ΔΔΜ > I. 25時，定義為CPTlA基因拷貝數增加。其中AACt= Λ Ct (待測樣本)-ACt (內參照)。其中所述的內參照為GAPDH。在本發明的一個實施方案中，所述的CPTlA蛋白表達水平可以利用免疫組織化學方法測量得到；所述的免疫組織化學方法中包括使用抗CPTlA多克隆抗體的步驟；在本發明的一個實施方案中，所述抗CPTlA多克隆抗體購于Proteintech公司，其貨號為15184-トΑΡ。在隨機觀察的3個視野中，當強表達細胞所占比例平均值高于50%吋，定義為CPTlA蛋白過表達。所述強表達細胞是指與陰性著色細胞相比有明顯著色的細胞，其中陰性著色細胞指目標蛋白不表達，不著色的細胞。
在本發明的一個實施方案中，所述的免疫組織化學方法具體包括以下步驟先將組織切片在65°C烘箱中烘烤30min，然后ニ甲苯脫蠟3次，每次lOmin，接著梯度こ醇水化(100%，85%，75% )，每次3min，然后置于IXPBS中洗滌2次，每次5min，用3%的過氧化氫處理IOmin后，接著用枸櫞酸鈉溶液修復抗原20min，經IXPBS洗滌后，加入抗CPTlA抗體，4°C過夜孵育，經I XPBS洗滌后，用pv9000試劑盒處理后，加DAB顯色，蘇木素復染，經梯度こ醇脫水(75%，85%，100% )和ニ甲苯透明后，封片和鏡檢。根據本發明第三方面的方法，其可用于食管鱗癌預后的判斷。其中所述的食管鱗癌預后判斷方法為=CPTlA基因的拷貝數増加，則食管鱗癌患者術后生存期短；或者，CPTlA蛋白過表達，則食管鱗癌患者術后生存期短。在本發明的一個實施方案中，所述CPTlA基因拷貝數的檢測方法為提取腫瘤組 織DNA，要求腫瘤組織中腫瘤細胞含量大于50% ;進行Real-time PCR檢測；對Real-timePCR結果進行分析。在本發明的一個實施方案中，所述CPTlA蛋白表達水平的檢測方法為取食管鱗癌組織(要求腫瘤組織中腫瘤細胞含量大于50%)制成組織切片，用于免疫組織化學檢測；加入抗體進行孵育；加入顯色劑顯色；最后進行顯微鏡觀察和分析。在本發明中，所述的CPTlA基因或蛋白是指哺乳動物的CPTlA基因或蛋白。在本發明的一個實施方案中，所述的哺乳動物為人。在本發明中，所述的食管鱗癌為食管的鱗狀細胞癌，pNl期指有區域淋巴結轉移；II期指腫瘤侵及肌層或外膜但無區域淋巴結轉移和腫瘤侵及粘膜固有層或粘膜下層或肌層但有區域淋巴結轉移；111期指腫瘤侵及外膜伴有區域淋巴結轉移和腫瘤侵及鄰近結構(器官)。在本發明中，所述的食管鱗癌預后判斷是指對食管鱗癌患者的生存期進行預測或判斷，在本發明的實施方案中，所述食管鱗癌患者為腫瘤切除術后。在本發明中，所述的試劑盒并不拘泥于其存在形式，其包括用于定量檢測所需要的試劑的組合以及檢測方法。在本發明中，所述的用于定量檢測CPTlA基因的寡核苷酸片段可以為引物或探針，其可以擴增CPTlA基因，或者定量檢測CPTlA基因。在本發明的實施方案中，所述的寡核苷酸片段為引物。在本發明的一個實施方案中，所述的引物為SEQ ID NO :1和2所示的引物序列；所述的內參基因即內參照為GAPDH。在本發明的實施方案中，所述的定量檢測CPTlA基因的方法為實時定量PCR方法，也稱為實時熒光定量PCR方法，其方法為本領域技術人員通常采用的方法。在本發明的實施方案中，所述的拷貝數增加是指，2_“et> I. 25，其中Λ ACt =Δ Ct (待測樣本)-Λ Ct (內參照)。在本發明的實施方案中，其中所述的CPTlA蛋白表達水平可以利用免疫組織化學方法測量得到，其方法為本領域技術人員通常采用的方法。所述的蛋白過表達是指在隨機觀察的3個視野中，強表達細胞所占比例平均值高于50%。在基因拷貝數和蛋白表達的檢測時，通常要求被檢測組織的腫瘤細胞含量大于50%。發明的有益效果
本發明提供了ー種可以有效區分食管鱗癌病人術后生存期的分子標志物，該標志物具有以下特征(a)存在CPTlA基因拷貝數増加的食管鱗癌病人，較未發生拷貝數改變病人的術后生存期短。(b)存在CPTlA基因蛋白強表達的食管鱗癌病人，較中低強度表達病人術后生存期短。 統計學分析結果表明CPTlA基因拷貝數増加和蛋白過表達可以用于食管鱗癌預后的判斷，為食管鱗癌預后的判斷提供了新途徑，為臨床醫生對于食管鱗癌患者的病情分析提供了參考依據。


圖I顯示了 CPTlA增益對全部、III期、pNl期和II期食管鱗癌病人預后的影響圖2顯示了 CPTlA增益對全部、III期、pNl期和II期食管鱗癌病人預后的影響圖3顯示了 CPTlA強表達(過表達)與食管鱗癌病人預后的關系
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。本發明使用的實時定量PCR 儀為 7300 或 7900Real-Time PCR System (AppliedBiosystems 公 ロJ ノ。本發明中的基因拷貝數或蛋白表達水平與食管鱗癌患者的生存時間的關系采用SPSS軟件生存分析模塊中的Kaplan-Meier法來分析，在附圖中用累積生存率來表示。實施例I回顧性研究將151例食管鱗癌腫瘤標本(來自中國醫學科學院腫瘤醫院)，提取DNA，用Real-time PCR方法檢測CPTlA基因的拷貝數，并進行分析。DNA拷貝數分析采用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)試劑盒,按照說明書，提取腫瘤組織DNA，要求腫瘤組織中腫瘤細胞含量大于50 %。采用Power SYBR Green PCRMaster Mix (Applied Biosystems)試劑盒進行實時定量 PCR(Real_time PCR)檢測。反應體系為 20 μ I :10 μ I 2 X Power SYBR Green PCR Master Mix，2 μ I 腫瘤組織 DNA (5ng/μ 1)，1μ I引物(上下游引物各10 μ Μ) , 7 μ I無核酸酶的水。反應程序為95°C 10分鐘；95°C 15秒，60°C I分鐘，循環40次。Real-time PCR結果采用2_Δ Δα法進行分析，內參基因為GAPDH，Δ Δ Ct =Λ Ct (腫瘤)-ACt (參照)。當2_Λ > I. 25時，定義基因拷貝數増加(増益)。CPTlA 上游引物5’ -TTTCCCACGTCCAAAATAGGC-3 ’ (SEQ ID NO :1)，下游引物5’ -ACCAGGAGCAGGTGAGAGTCC-3’ (SEQ ID NO 2)；
GAPDH 上游引物5’ -GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3 ’ (SEQ ID NO :3)，下游引物5’-GGCATTGCTGCAAAGAAAGAG-3’ (SEQ ID NO :4)。結果如圖I、表I所示。表I.多因素回歸分析
權利要求
1.CPTlA基因或蛋白的定量檢測試劑在制備食管鱗癌預后判斷試劑盒中的用途。
2.權利要求I的用途，其中所述的CPTlA基因的定量檢測的方法為實時熒光定量PCR方法；其中所述的CPTlA蛋白的定量檢測的方法為免疫組織化學方法。
3.權利要求I或2的用途，其中所述的CPTlA基因的定量檢測試劑包括用于定量檢測CPTlA基因的寡核苷酸片段，例如為引物或探針；任選地，還包括用于定量檢測GAPDH的寡核苷酸片段，例如為引物或探針；任選地，還包括檢測緩沖液。
4.權利要求3的用途，其中用于定量檢測CPTlA基因的引物序列為SEQID NO :1和SEQID NO 2所示序列；和/或用于定量檢測GAPDH的引物序列為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示序列。
5.權利要求I或2的用途，其中所述的CPTlA蛋白的定量檢測試劑包括與CPTlA蛋白特異性結合的抗體，例如所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；任選地，還包括檢測緩沖液。
6.權利要求I或2的用途，其中所述的食管鱗癌預后判斷的方法為=CPTlA基因的拷貝數増加，則食管鱗癌患者生存期短；或者，CPTlA蛋白過表達，則食管鱗癌患者生存期短。
7.用于食管鱗癌預后判斷的試劑盒，其包含CPTlA基因或蛋白的定量檢測試劑。
8.權利要求7的試劑盒，其中所述的CPTlA基因的定量檢測試劑包括用于定量檢測CPTlA基因的寡核苷酸片段，例如為引物或探針；任選地，還包括用于定量檢測GAPDH的寡核苷酸片段，例如為引物或探針；任選地，還包括檢測緩沖液。
9.權利要求7的試劑盒，其中所述的CPTlA蛋白的定量檢測試劑包括與CPTlA蛋白特異性結合的抗體，例如所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；任選地，還包括檢測緩沖液
10.檢測食管鱗癌患者CPTlA基因拷貝數或蛋白表達水平的方法，其包括利用實時熒光定量PCR檢測CPTlA基因拷貝數的方法，或者包括利用免疫組織化學法檢測CPTlA蛋白表達水平的方法。
全文摘要
本發明屬于分子生物學、臨床預后判斷領域，涉及CPT1A基因或蛋白的定量檢測在食管鱗癌預后判斷中的應用。具體地，本發明涉及CPT1A基因或蛋白的定量檢測試劑在制備食管鱗癌預后判斷試劑盒中的用途，用于食管鱗癌預后判斷的試劑盒，以及檢測食管鱗癌患者CPT1A基因拷貝數或蛋白表達水平的方法。當CPT1A基因的拷貝數增加或蛋白過表達時，提示食管鱗癌患者術后生存期短。
文檔編號C12Q1/68GK102676650SQ20121005874
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月8日 優先權日2011年3月9日
發明者史志周, 徐昕, 王明榮, 郝佳潔 申請人:中國醫學科學院腫瘤研究所