一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法

專利名稱：一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法
技術領域：
本發明屬于生物脫氮領域，具體涉及一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法。
背景技術：
好氧反硝化是指有氧氣的條件下發生的反硝化現象，近些年來不斷有好氧反硝化菌被分離出來(已報道的菌屬有如副球菌屬、假單孢菌屬、產堿菌屬、芽孢桿菌屬等50多個菌屬存在好氧反硝化現象)，這就為生物脫氮技術提供了一個新的途徑。好氧反硝化與傳統的反硝化相比具有如下優點
1、在有氧條件下進行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同時在一個反應器中進行，設備與操作成本大幅下降；
2、硝化作用的產物可直接作為反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化進程加快，縮短了脫氮周期。所以，好氧反硝化脫氮技術是當前與以后一段時間內的科學研究的熱點。芽孢桿菌屬的特點
1.細菌呈直桿狀，細胞染色大多數在幼齡培養時呈G+，好氧或兼性厭氧，化能異氧菌， 具有發酵或呼吸代謝類型；在條件不利的情況下形成芽孢，將自已保護起來，復活率高。其有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等，故以其開發產品有較高的穩定性
2.菌體生長營養要求簡單。3.有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，對污染水體的有機物有較強的降解能力。
綜上所述，設計出一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，以利于快速分離、 提純出高效好氧反硝化的芽孢桿菌，以期為生物脫氮作貢獻。好氧反硝化菌的分離方法有很多，主要有選擇性富集法；稀釋法；間歇曝氣法。

發明內容
本發明提供了一種簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，篩選出具有反硝化水體(水產養殖、與環境污染水體)中硝態氮與亞硝態氮的芽孢桿菌。為實現上述目的本發明采用如下技術方案
一種簡易、快速分離篩選好氧反硝化芽孢桿菌的方法，其特征在于選擇如土壤、池塘水樣、泥樣或活性污泥等目標物接種于含有N02_-N/N03—N的富集培養基中，進行間歇增氧富集培養；移取適量富集培養物75-80°C水浴殺除雜菌，稀釋后涂布于含N02_-N/N03一N梯度平板培養；然后對培養后的平板進行噴涂N02_-N/N03一N顯色液，挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落，繼續用劃線法獲得純培養物，對純培養物革蘭氏染色鏡檢，以內生芽孢桿菌的作為初篩菌株；接著利用純培養物菌體在不同N02_-N/N03一N濃度的培養基中，恒溫間歇增氧培養，測定其0D600nm吸光度值，以定量的確定芽孢桿菌所適應的N02__N/N03一N濃度范圍；在確定的適中的N02_-N/N03一N濃度下，用含有N02__N/N03一N的液體富集培養基，分別培養不同好氧反硝化芽孢桿菌，通過測定液體富集培養基中N02_-N/N03一N含量，以求解其去除率，復篩出好氧反硝氧能力強勁的芽孢桿菌。所述的簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，其特征在于所述的富集培養基用的是LB培養基2. 0-200. O mg/lN02_-N/N03—N ;所述的LB培養基(g/Ι):胰蛋白胨
10.0，氯化鈉 5.0，酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，滅菌 25_30min。本發明的有益效果
目前現有技術在分離反硝化細菌多用BTB培養基，利用反硝化過程中堿的特性，利用培養基中BTB (溴百里酚藍)指示劑在PH值> 7. 6顯示藍色，來間接判斷有反硝化細菌的有無。其培養基組份較復雜，且營養不全面，富集培養時間長，無針對性快速分離好氧反硝化芽孢菌缺點；利用本發明的方法，具有培養基組成簡單(一般的化驗室條件均有條件)，營養全面，且有促生長因子故富集培養時間短，用針對性的顯色劑噴涂，更直觀。初篩中加入水浴環節能有效提高芽孢菌的檢出率，大大降低在篩選目標菌株的工作量。應用定性與定量的方法相給合，使得工作效率更快。總之，本發明方法具有簡易、快速、直觀、高效分離具有好氧反硝化能力芽孢桿菌的的特點，為生物脫氮技術提供了一個新的途徑。
具體實施例方式下面通過具體實施例來進一步說明。實施例僅用于本發明而不用于限制本發明的范圍；此外應理解為在閱讀本發明所敘述之后，本領域的技術人員可能對本發明作各種改動與修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限制的范圍。實施例I 一種簡易、快速分離篩選好氧反硝化芽孢桿菌的方法，具體操作如下 選擇如土壤、池塘水樣、泥樣或活性污泥等目標物接種于含有N02_-N/N03一N的富集培
養基中，進行間歇增氧富集培養；移取適量富集培養物75-80°C水浴殺除雜菌后，稀釋涂布于含N02—-N/N03一N梯度平板培養；然后對培養后的平板進行噴涂N02—-N/N03一N顯色液，挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落，繼續用劃線法獲得純培養物，對純培養物革蘭氏染色鏡檢，以內生芽孢桿菌的作為初篩菌株；接著利用純培養物菌體在不同N02_-N/N03一N濃度的培養基中，恒溫間歇增氧培養，測定其0D600nm吸光度值，以定量的確定芽孢桿菌所適應的N02--N/N03一N濃度范圍；在確定的適中的N02--N/N03一N濃度下，用含有N02--N/N03一N的液體富集培養基，分別培養不同好氧反硝化芽孢桿菌，通過測定液體富集培養基中N02—-N/ N03—N含量，以求解其去除率，復篩出好氧反硝氧能力強勁的芽孢桿菌。
所述的富集培養基用的是LB培養基+2. 0-200. O mg/lN02_-N/N03一N ;所述的LB培養基(g/Ι):胰蛋白胨 10. 0，氯化鈉 5. O,酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，滅菌 25_30min。制作N02—-N/N03一N梯度平板取IOml LB瓊脂培養基于直徑9cm的培養皿中，立即將培養皿斜放，使高處的培養基正好位于皿邊與皿底的交接處。等凝固后，再將平皿平放，再加入含有一定濃度的N02—-N/N03一N的LB瓊脂培養基10 ml.凝固后，便得到N02—-N/ N03一N從設定濃度到O逐漸遞減的濃度梯度的培養皿。上層培養基越厚，N02—-N/N03一N的濃度越高(也可在培養皿底部用“一”作N02—-N/N03一N濃度遞增標識)。N02—-N/N03一N取值
2.0-200. O mg/1，所述的LB瓊脂培養基在LB培養基的基礎上加入I. 5-2. 0%瓊脂粉或瓊脂條，121°C，滅菌 25-30min。在制作好的梯度平板上涂布培養目標物14-48hr后，噴涂N02:N/N03一N顯色液， 挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落，繼續用劃線法獲得純培養物，對純培養物革蘭氏染色鏡檢，以內生芽孢桿菌的作為初篩菌株。根據目標菌株所在梯度平板中所在的位置與數量，便可大致知道該菌株的N02\N/N03一N的耐受范圍。所述的N02二N/ N03-N顯色液為
N02一- N顯色液(格里斯氏試劑)配制
A液對氨基苯磺酸O. 5 g,稀醋酸(10%左右)150ml B液a-萘胺O. I g,蒸餾水20 ml,稀醋酸(10%左右)150ml 臨用前將A、B液混合。所述的N03一- N顯色液(二苯胺試劑)配制
取二苯胺O. 5 g溶于IOOml濃硫酸中,用20ml蒸懼水稀釋。所述的革蘭氏染色法所用試劑
結晶紫染色液
A液結晶紫2. Og, 95%乙醇20ml,
B液草酸銨O. 8g,蒸懼水80ml,
混合A、B液，靜置48h后過濾使用，
碘液碘I. 0g，碘化鉀2. 0g，蒸餾水300ml。先用少量(3_5 ml)蒸餾水溶解碘化鉀，再加入碘片，待碘片溶解后，加水稀釋到300ml。脫色液95%乙醇。O. 5%番紅復染液取2. 5%番紅乙醇液20ml，蒸餾水80ml，混勻。革蘭染色的方法步驟
A制片在一潔凈載玻片上加蒸餾水一滴，然后用接種環挑取少許菌苔與水滴涂布混勻，制成薄薄的細菌涂片，而后在酒精燈的火焰上通過3-4次，使細菌固定在載玻片上。B 染色
(O結晶紫染色用結晶紫混合液(加量以覆蓋菌膜為度)，染lmin，水洗并除盡水滴。(2)媒染滴加路哥爾氏碘液，染lmin，水洗并吸干水滴。(3)脫色滴加95%乙醇脫色，流滴到洗脫液無色，維持25-30S，立即水洗終止脫色。(4)復染滴加沙黃染色劑，染色lmin，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。C鏡檢用油鏡觀察上述涂片菌體深紫色為G+菌；菌體紅色G_菌。注意事項當染色結果可疑時，以金色葡萄球菌為G+對照菌；以大腸埃希氏菌 G_對照菌.
芽孢的有無，形狀、大小及其在體內的位置均是鑒定細菌的重要依據。本專利選用的孔雀綠染色法(制片一染色一鏡檢)。芽孢孔雀綠染色法所用試劑5%孔雀綠染色液，O. 5%沙黃染色液芽孢孔雀綠染色法染色步驟(I)制片在一潔凈載玻片上加蒸餾水一滴，然后用接種環挑取待染色的純培養物菌落一環，與水滴混勻，制成薄薄的細力涂片，而后在酒精燈的火焰上通過3-4次，使細菌固定在載玻片上。(2)染色:
A加孔雀綠染色液
加染色液于涂片處(染料以覆蓋涂片為度)，然后將玻璃放在擱架上，再將擱架放在三角鐵架上，用微火加熱至染料冒蒸汽時開始計時，維持5min.在加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干涸。B 水洗
待玻片冷卻后，用洗瓶中的自來水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。C 復染
用沙黃液染色2min。D水洗自來水沖洗，吸干。(3)鏡檢結果芽孢為綠色，菌體與芽孢囊為微紅色。將選出的好氧反硝化菌株接種到不同N02__N/N03一N濃度的LB培養基中，恒溫間歇增氧培養，測定其吸光度A600，確定其生長不受影響的濃度范圍；設計N02_-N/N03一N的降解實驗進行衡量檢測。在適中的N02__N/N03一N濃度下，用富集培養基，分別培養不同好氧反硝化芽孢桿菌，培養24、48、72、96h后分別測定培養液中N02__N/N031含量，以求解其去除率，去除率的求解公式為
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好氧反硝化能力測試培養基配方
LB 培養基+2. 0-200. O mg/1 N02二N/N03一N，PH 7. 0-7. 3，115°C，滅菌 25_30min.
培養條件10-45°C，120-150R/MIN恒溫培養14_48hr，振蕩器增氧時間間隔為12小時。亞硝態氮(N02一N)檢測方法N-(1-萘基)_乙二胺分光光度法(GB7493-87)。硝態氮(N03一N)檢測方法紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)。實例2 :養殖池塘底池中好氧反硝化芽孢桿菌的篩選 I、富集培養
將養殖池塘取得的塘池樣品混合均勻后接1%的接種量接入含用N02--N/N03 — N濃度為2. Omg/1富集培養基中，培養液為100ml，然后30°C，120-150r/min的搖床中間歇增氧恒溫富集培養，間歇增氧時間為12h ;富集48h后將培養物混合均勻，以2%接種量轉接到 N02--N/N031濃度20. Omg/1的富集培養基內，培養液為100ml，間歇增氧富集48小時；最后將第二次富集的培養液混均后以5%接種量轉接到N02—-N/N03一N濃度200. Omg/1的富集培養基內，培養液為100ml，間歇增氧富集48小時；總共富集培養3代，歷時6天。2、初篩
水浴將富集好的培養物混合均勻后取I. 0-2. Oml移入于滅過菌的試管，將其置于75-80°C水浴5-10min，利用芽孢桿菌的芽孢能耐高溫的特性，以清除不耐高溫的微生物。這樣目標性更強，大大減少后面分離目標菌株的工作量。涂布N02__N/N03—N梯度平板將水浴后的富集培養物，進行適當倍數稀釋，然后涂布于N02—N/N03—N梯度平板中，涂布后的平板倒置于30°C恒溫培養箱中，培養2天；從噴涂顯色后的N02—-N/N03一N梯度平板中高N02—-N/N03一N濃度區域挑選挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落根據形態不同加以分類；然后對形態不同的菌落分別加以劃線分離，將劃線后的平板倒置30°C恒溫培養箱中，培養2天，直到所有菌落形態完全一致。染色鏡檢對提純后的菌株，選取菌落形態典型者(接種后恒溫培養12-18h)進行革蘭氏染色后鏡檢，選取菌體形態一致，呈桿狀，革蘭氏染色陽性，內生芽孢，無雜菌者加以試管斜面保存，以便復篩之用。3、復篩
富集培養基生長情況測定
設計不同的N02_-N/N03—N濃度富集培養基，分別接入初篩的菌株，培養24h后，測定其在0D600nm吸光度值，以定量地確定每株芽孢桿菌所適應的N02—-N/N03一N濃度范圍。好氧反硝化能力的測定
在適中的N02_-N/N03一N濃度下，用富集培養基，分別培養不同的好氧反硝化芽孢桿菌， 培養24、48、72、96h后分別測定培養液中N02—-N/N03一N含量，計算出其去除率。結果初篩得4株芽孢菌，復篩得到I株96h能將100mg/l N02—-N降解為Omg/1 N02—-N的好氧反硝化芽孢菌。實例3
養殖池塘水樣中好氧反硝化芽孢桿菌的篩選 I、富集培養
將養殖池塘水下50cm處取得的池水樣品混合均勻后接1%的接種量接入含用N02_-N/ N03一N濃度為2. Omg/1富集培養基中，培養液為100ml，然后在37°C恒溫，120_150r/m的搖床中間歇增氧富集培養培養，間歇增氧時間為12h ;富集48h后將培養物混合均勻，以2% 接種量轉接到N02—-N/N03一N濃度20. Omg/1的富集培養基內，培養液為100ml，間歇增氧富集48小時；最后將第二次富集的培養液混均后以5%接種量轉接到N02_-N/N03一N濃度 200. Omg/1的富集培養基內，培養液為100ml，間歇增氧富集48小時；總共富集培養3代， 歷時6天。2、初篩
水浴將富集好的培養物混合均勻后取I. 0-2. Oml移入于滅過菌的試管，將其置于 75-80°C水浴5-10min，利用芽孢桿菌的芽孢能耐高溫的物性，以清除不耐高溫的微生物。這樣目標性更強，大大減少后面分離目標菌株的工作量。涂布N02__N/N03一N梯度平板將水浴后的富集培養物，進行適當倍數稀釋，然后涂布于N02_-N/N03一N梯度平板中，涂布后的平板倒置于37°C恒溫培養箱中，培養2天后； 從噴涂顯色液后的平板中高N02_-N/N03—N濃度區域選挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落根據形態不同加以以分類；然后對不同菌落類型的菌落分別加以劃線分離，將劃線后的平板倒置30°C恒溫培養箱中，培養2天，直到菌落形態完全一致。鏡檢對提純后的菌株，選取菌落形態典型者(接種后恒溫培養12-18h)進行革蘭氏染色后鏡檢，選取菌體形態一致，內生芽孢，無雜菌者加以試管斜面保存，以便復篩之用。3、復篩
富集培養基生長情況測定
設計不同的N02_-N/N03—N濃度富集培養度基，分別接入初篩的菌株，培養24h后，測定其在0D600nm吸光度值，以定量的確定每株芽孢桿菌所適應的N02__N/N03一N濃度范圍。好氧反硝化能力的測定
在適中的N02_-N/N03一N濃度下，用富集培養基，分別培養不同好氧反硝化芽孢桿菌，培養24、48、72、96h后分別測定培養液中N02—-N/N03一N含量，以求解其去除率。結果初篩得2株芽孢菌，復篩得到I株能在96h內將40mg/l N02:N降解為Omg/ I N02—-N的好氧反硝化芽孢菌。
權利要求
1.一種簡易、快速分離篩選好氧反硝化芽孢桿菌的方法，其特征在于選擇如土壤、池塘水樣、泥樣或活性污泥等目標物接種于含有N02_-N/N03—N的富集培養基中，進行間歇增氧富集培養；然后移取適量富集培養物在75-80°C水浴殺除雜菌后，稀釋涂布于含N02_-N/ N03一N梯度平板培養；然后對培養后的平板進行噴涂N02_-N/N03一N顯色液，在平板高濃度 N02_-N/N03一N區域挑挑取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落，繼續用劃線法獲得純培養物， 對純培養物革蘭氏染色鏡檢，以內生芽孢桿菌的作為初篩菌株；接著利用純培養物菌體在不同N02_-N/N03一N濃度的培養基中，恒溫間歇增氧培養，測定其0D600nm吸光度值，以定量的確定芽孢桿菌所適應的N02—-N/N03一N濃度范圍；在確定的適中的N02—-N/N03一N濃度下， 用含有N02_-N/N03—N的液體富集培養基，分別培養不同好氧反硝化芽孢桿菌，通過測定液體富集培養基中N02_-N/N03—N含量，以求解其去除率，復篩出好氧反硝氧能力強勁的芽孢桿菌。
2.根據權利要求I所述的簡易、快速分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，其特征在于所述的富集培養基用的是LB培養基2. 0-200. O mg/1 N02—-N/N03一N ;所述的LB培養基(g/ I):胰蛋白胨 10. 0，氯化鈉 5. 0，酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，滅菌 25_30min。
全文摘要
本發明公開了一種分離好氧反硝化芽孢桿菌的方法，對目標物取樣進行間歇增氧選擇性富集培養，然后對富集培養物進行水浴后，稀釋涂布梯度NO2--N/NO3—N平板，以利用NO2--N/NO3—N與相應的顯色劑顯色的特點，從噴涂顯色液后的平板中高NO2--N/NO3—N濃度區域選取菌落周邊無顯色或顯色淺淡菌落，快速篩出好氧反硝化菌；通過劃線法得到純培養菌株，接著對純培養物進行染色鏡檢，以初篩選出具有好氧反硝化能力的芽孢桿菌；最后根據純菌株在不同NO2--N/NO3—N濃度的富集培養基的生長情況以確定適宜的NO2--N/NO3—N濃度，設計好氧反硝化降解試驗復篩出高效好氧反硝化能力的菌株。本發明方法具有快速分離、提純出高效好氧反硝化的芽孢桿菌的特點，為生物脫氮技術提供了一個新的途徑。
文檔編號C12Q1/04GK102586156SQ20121006140
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月10日 優先權日2012年3月10日
發明者吳文坤, 周呈祥, 朱杰 申請人:安徽聯大生物環保科技有限公司