專利名稱：一種通過添加三甲胺提高林可霉素產量的生產方法
一種通過添加三甲胺提高林可霉素產量的生產方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說，是一種在發酵過程中通過添加三甲胺來提
高林可霉索產量的生產方法。
背景技術：
林可霉索(Lincomycin,簡稱LCM)又稱潔霉索,是最早發現的兩種林可酰胺類抗生索中的一種，由1962年在內布拉斯加州林肯市附近土壤中分離得到的一種放線菌發酵產生。林可霉索通過與敏感菌菌體中的核糖體50S亞基結合，從而抑制菌體中蛋白質的合成來起作用，對大多數革蘭氏陽性菌有抑菌作用，但對部分革蘭氏陰性菌和真菌沒有活性， 由于其不存在交叉耐藥性，且毒性較低，因此，常在臨床上被用來治療由革蘭氏陽性菌引發的疾病。林可霉素是由一分子的古柯葉液堿PHA(反式-N-甲基-4-正丙基脯氨酸)和一分子的甲基硫林可糖胺MTL (6-氨基-6，8- 二脫氧-I-硫代-O-赤式-2-D-半乳糖吡喃糖苷)通過一個肽鍵連接而成的，其分子結構如圖I所示。其中，對于氨基部分的合成步驟了解的較清楚，葡萄糖首先通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑得到磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸，二者結合之后進入莽草酸途徑，從而得到酪氨酸，酪氨酸通過一系列的結構轉換使得到了丙基脯氨酸，其合成途徑如圖2所示。但對于糖基部分的合成步驟僅停留于推測階段。國外研究發現，在發酵過程中添加丙基脯氨酸可以降低林可霉素B組分，而提高林可霉素A組分。另外向林可霉素的發酵培養基中添加一定量的L-酪氨酸或L- 二羥基苯丙酸都有助于菌體內丙基脯氨酸的積累，但對于其作用的具體機理至今未研究清楚，但可以確定，N-去甲基林可霉素合成酶在催化丙基脯氨酸和甲基硫林可糖胺通過酰胺鍵連接時，丙基脯氨酸被優先利用。同時，國內研究發現，在發酵過程中添加林可霉素合成代謝過程中的關鍵物質或關鍵酶的抑制劑或激活劑，例如金屬離子、氨基酸、氟化鈉等，可明顯提高林可霉素的產量。但對于在發酵過程中添加三甲胺，能否提高林可霉素的產量卻未有報道。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種通過添加三甲胺來提高林可霉索產量的生產方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的—種通過添加三甲胺來提高林可霉素產量的生產方法，其特征在于，在發酵過程中加入三甲胺；三甲胺加入量為0.01 O. 05%，是指三甲胺占培養基的重量百分比，加入時間為O 168h，發酵周期為168h，從發酵開始時算起。一種通過添加三甲胺來提高林可霉索產量的生產方法，配制發酵培養基，按一定的接種量向發酵瓶中接入種子液，放在搖床上進行發酵，共需發酵168h，在發酵過程中(即O 168h)添加一定濃度的三甲胺，考察其對林可霉素產量的影響。發酵結束后，離心得到上清液，用杯碟法進行林可霉素產量的測定。與現有技術相比，本發明的積極效果是使用本發明所提供的方法，通過在發酵過程中添加作為林可霉索合成代謝過程中關鍵酶抑制劑的三甲胺可明顯提高林可霉素的產量。
圖I林可霉素的分子結構圖；圖2林可霉索的氨基部分合成方法示意圖。
具體實施方式以下提供本發明一種通過添加三甲胺來提高林可霉素產量的生產方法的具體實施方式
。請參見附圖I和2，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆:實驗手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或生產廠商推薦的條件下進行。在本發明的下述實施例中，使用的林可鏈霉菌(Streptomyces Iincolnensis)已于2008年04月25日提交位于武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為 CCTCC M 208064。除特別說明外，以下實施例中所使用的％，％。均為重量比。在本發明的實施例中，發酵培養基的配方為0.8% (NH4)2SO47O. 8% NaNO3,0. 5% NaCl, O. 02% K2HPO4, 3%黃豆餅粉，O. 2%玉米漿，O. 8% CaCO3, 5%葡萄糖，pH 7. O。在本發明的實施例中，林可霉素的效價采用杯碟法進行檢測，中國藥典2010版 (二部)。實施例I 5三甲胺的添加量對林可霉索生物合成的影響在配制林可霉索發酵培養基時，向培養基中添加重量比為0.01%、0.02%、 O. 03 %、O. 04 %、O. 05 %的三甲胺，并用不添加三甲胺的培養基作為對照，即對照例I，接入林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis),發酵168小時后,取樣測定林可霉素的效價， 結果如表I所示。表I、三甲胺的添加量對林可霉素生物合成的影響
實施例I實施例2實施例3實施例4實施例5對照例I三甲胺添加％0. 010. 020. 030. 040. 05對照相對效價103106104102101100 由表I的結果可見，向發酵培養基中添加三甲胺可提高林可霉索的產量，優選的添加量為0.02%。
實施例6 12三甲胺的添加時間對林可霉素生物合成的影響配制林可霉索發酵培養基，接入林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis),進行發酵培養，分別在發酵開始時、24、48、72、96、120、144小時向發酵培養基中添加重量比為
O.02%的三甲胺，同時以不添加三甲胺的培養基作為對照，發酵168小時后，取樣測定林可霉素的效價，結果如表2所示。表2、三甲胺的添加時間對林可霉素生物合成的影響
權利要求
1.一種通過添加三甲胺來提高林可霉素產量的生產方法，其特征在于，在發酵過程中加入三甲胺。
2.如權利要求I所述的一種通過添加三甲胺來提高林可霉素產量的生產方法,其特征在于，所述的三甲胺加入量為0.01 O. 05%，是指三甲胺占培養基的重量百分比。
3.如權利要求I所述的一種通過添加三甲胺來提高林可霉素產量的生產方法,其特征在于，所述的三甲胺加入時間為O 168h，發酵周期為168h，從發酵開始時算起。
全文摘要
本發明涉及一種通過添加三甲胺來提高林可霉索產量的生產方法，其特征在于，在發酵過程中加入三甲胺；三甲胺加入量為0.01～0.05％，是指三甲胺占培養基的重量百分比，加入時間為0～168h，發酵周期為168h，從發酵開始時算起。本發明的優點使用本發明所提供的方法，通過在發酵過程中添加作為林可霉素合成代謝過程中關鍵酶的抑制劑的三甲胺可明顯提高林可霉索的產量。
文檔編號C12R1/565GK102605028SQ201210062138
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日 公開號201210062138.發明者喬現婷, 劉儉國, 劉守強, 葉蕊芳, 呂和平, 張宏周, 徐紅梅, 林桂真, 毛全貴, 焦龍, 王成君 申請人:華東理工大學, 河南天方藥業股份有限公司