專利名稱：一種細腳擬青霉菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物領域，具體涉及一種細腳擬青霉菌株及其應用。
背景技術：
細腳擬青霉(Paecilomycestenuipes)為高雄山蟲草(Coryceps takaomantana)的無性型，異名有棉鈴蟲穗霉(Spicaria heliothia)、棉鈴蟲擬青霉(Paecilomycesheliothia)、大孢蟲花(Isaria japonica)、杜氏棒束孢(Isaria dussii)等10余種同物異名。陳祝安曾報道細腳擬青霉栽培產物所含氨基酸種類與冬蟲草夏相同，多種氨基酸甚至成倍高于冬蟲草夏，并具有提高小鼠常壓耐缺氧能力和鎮靜、鎮痛等作用(真菌學報，1990,9(4) :304-311 ;真菌學報，1989 :8(3) :214-220)。細腳擬青霉能阻止環磷酰胺所 致的白細胞數降低，對環磷酰胺所致免疫抑制的大小鼠脾臟、胸腺等免疫器官萎縮有阻遏作用，顯示了對機體具有免疫調節活性(金麗琴，浙江醫學，2001，23 (4) :216-217)。細腳擬青霉液體培養液及其糖蛋白濃縮組分能改善小鼠因5-氟尿喃唳引起的貧血癥(TakataT，Biol. Pharm. Bull. 2008，31 (8) 1565-1573)。其甲醇提取物具有較強的清除自由基活性(楊成，菌物學報，2006,25(1) 63-69)。其水煎劑能明顯減輕由四氯化碳引起的肝組織損傷作用(吳真列，溫州醫學院學報，1995,25(4) :206-207)。從子實體中分離到的麥角甾醇過氧化物對人胃癌細胞、肝癌細胞、大腸癌細胞、小鼠肉瘤細胞具有強烈的抑制作用(Nam KS, Life Sciences，2001，69 :229-237)。從細腳擬青霉提取的水溶性多糖能加速大鼠和人單核細胞中的乳酸脫氫酶和酸性磷酸酶活性，增強巨噬細胞的胞飲活性，提高人外周血單核細胞腫瘤壞死因子-a數量(Chen X, International Journal of BiologicalMacromolecules, 2008,43 :252-256)。細腳擬青霉多糖對乙肝表面抗原和乙型肝炎病毒DNA的合成與分泌有抑制作用(李寶劍，中藥材，2007，30 (2) =200-202)。有文獻報道，地理來源不同、寄主不同的細腳擬青霉菌株，其次生代謝產物方面具有較大的變異性(萬水霞，安徽農業大學學報，2006，33 (4) :483-486)。從采用不同來源、不同培養方式的細腳擬青霉進行種內篩選將可能獲得產生特殊活性物質的重要菌株。
發明內容
本發明目的在于提供一種細腳擬青霉菌株，具有在食品、保健品、藥品、化妝品領域應用價值。本發明的菌株具有易于培養、產量高、培養性狀穩定的特點，其培養產物具有多重功效，因此具有廣泛的應用價值。本發明經大量試驗研究比對，從采集的鱗翅目幼蟲感病體中分離純化得到一細腳擬青霉菌株 Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson。該菌株已于2010年9月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 4176。經中國科學院微生物研究所形態特征鑒定，細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176的主要形態特征為在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基上菌落白色，致密，初期背面淺黃色，后期菌落上形成大量孢梗束，背面呈淺黃褐色。菌絲無色，分枝，平滑，具隔膜，寬I. 5-3. Oy m。分生孢子梗從菌絲上伸出，無色，平滑，分枝，長達110. 0 y m，寬達4. 0 y m。孢梗束白色至奶油黃色，長10-30厘米，產孢細胞瓶狀，無色，2-6個簇生在孢子梗上呈帚狀，頂部變細窄，
5.0-8. 0 X 2. 5-3. 2 u m。分生孢子大部分圓柱形，部分橢圓形，也有臘腸形彎曲，單孢，無色，平滑，鏈生，5. 0-6. 7X2. 0-2. 5(3. 0) Um0在查氏培養基上，灰白色，拱起，蓬松，絨毛狀，孢梗束生長差或不長。在薩氏培養基上未見菌落生長。對葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、鼠李糖、甘露糖、肌醇、甘油、山梨酸、木糖、可溶性淀粉等碳源的研究，利用最好的為蔗糖，其次為葡萄糖、麥芽糖、果糖和可溶性 淀粉，不能利用木糖和山梨酸，鼠李糖，山梨醇生長勢差。對硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二銨、亞硝酸鈉、檸檬酸氨、硫脲等氮源實驗結果，除硫脲和亞硝酸鈉上不生長外，以檸檬酸氨和磷酸氫二銨生長最佳，有利用氨基氮比硝基氮好的現象。該菌生長最適溫度為24-26°C，在pH 3-11之間均能夠生長，但pH5. 0-6. 7之間生長最佳。在固體谷物培養基上發酵，菌苔灰白色，子實體(孢梗束)色澤鮮黃，生育甚佳，采收期30-40天。在含蔗糖、銨鹽、磷酸氫二鉀、硫酸鎂的液體培養基進行培養，獲得菌絲體，培養時間為10-14天。此菌培養產物通過分析表明，化學組分均含天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等；微量元素含鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鎳、硒等；此外，多糖、腺苷、甘露醇、留醇、有機酸和生物堿類與冬蟲夏草活性成分上基本一致或超過冬蟲夏草。本發明的細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176的ITS序列含有如SEQ ID NO : I所示多核苷酸序列。本發明的細腳擬青霉菌株Paecilomyces tenuipes CGMCC No. 4176可廣泛應用于食品、保健品、藥物和化妝品的制備。細腳擬青霉菌株Paecilomyces tenuipes CGMCC No. 4176的發酵產物可作為主要藥效成分或主要藥效成分之一的原料用于食品、保健品、藥物和化妝品的制備。食品、保健品、藥物和化妝品制備時其他原料的添加及處理可參考常規。本發明的細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176的發酵產物可用于制備免疫調節、改善營養、護肝、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、提高耐缺氧能力、鎮靜或鎮痛功能的藥物。其人體使用方法及劑量可參照冬蟲夏草，當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。用細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176子實體給大鼠灌胃，可顯著提高大鼠腹腔巨噬細胞內乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶和精氨酸酶的活性，并增強巨嗜細胞對中性紅的攝取能力，對大鼠血液中血紅蛋白水平也有顯著提高。用細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176子實體給大鼠灌胃，能顯著減輕四氯化碳誘導的肝損傷并且正常大鼠血清、腦、肝.脾、腎組織中脂質過氧化物水平下降，還原型谷胱甘肽水平升高。用細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176子實體水提物體外抑制腫瘤試驗，能抑制肝癌細胞的增殖和抑制乙型肝炎病毒DNA的合成與分泌。通過腹腔注射細腳擬青霉子實體水煎劑，明顯提高小鼠耐缺氧能力、并具有鎮靜、鎮痛等效果。細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176的發酵產物具有易于培養、產量高、培養性狀穩定等特點，培養產物具有免疫調節、改善營養、護肝、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、提高耐缺氧能力、具有鎮靜、鎮痛等功能。
圖I感病蟲體圖2細腳擬青霉I產孢結構，2分生孢子，3分生孢子鏈圖3細腳擬青霉菌落圖4細腳擬青霉子實體
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步描述本發明的技術方案。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例I、細腳擬青霉菌株[Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson]的平板培養將細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176接于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基上，25°C培養14天，菌落直徑30-60mm。菌絲體絨毛狀，絮狀，灰白色，蓬松。背面淺黃色，培養后期形成大量蛋黃色孢梗束。產孢細胞(瓶梗)組成的輪生體簇生于分生孢子梗的短枝上。瓶梗基部球形膨大，向上變細窄，5-7. 8 (3) X 2. 3-3. 5 u m。分生孢子多數圓柱形，也有臘腸樣彎曲，單孢，壁光滑，鏈生，5. 0-6. 7X2. 0-2. 5(3) Um0在PDA培養基上，菌絲體絨毛狀，致密，淺黃色，孢梗束密集，發達。在查氏培養基上，菌落灰白色，拱起，蓬松，絨毛狀，孢梗束生長差或不長。在薩氏培養基上未見菌落生長。實施例2、細腳擬青霉菌株對碳、氮源的利用將細腳擬青霉菌株CGMCC No. 4176接種到葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、鼠李糖、甘露糖、肌醇、甘油、山梨酸、木糖、可溶性淀粉等碳源培養基上，利用最好的為蔗糖，其次為葡萄糖、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉，不能利用木糖和山梨酸，鼠李糖，山梨醇生長勢差。對硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二銨、亞硝酸鈉、檸檬酸氨、硫脲等氮源實驗結果，除硫脲和亞硝酸鈉上不生長外，以檸檬酸氨和磷酸氫二銨生長最佳，有利用氨基氮比硝基氮好的現象。實施例3、細腳擬青霉菌株[Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson]發酵產物的
培養將細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176接于谷物培養基(小麥培養基)中23 26°C培養，菌苔繁茂。開始出現灰白色茸毛狀菌絲體，裹覆著培養基質。以后菌苔逐漸加厚，形成菌被，并見許多針尖樣大小突起物，之后長出金黃或蛋黃色子實體。孢梗束外形變化較大，有成圓柱狀，頂尖不分枝；也有樹枝狀，鹿角狀，珊瑚狀分枝，29-54X0. 5-1. 8iim。培養25 30天收集子實體，烘干后粉碎獲得子實體粉末。將細腳擬青霉CGMCC No. 4176接種在含蔗糖、蛋白胨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂的液體培養基(1000ml液體培養基中，鹿糖IOg,蛋白胨5g,磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂0. 5g)中24 26°C下進行140 160rpm震蕩培養，通過離心、烘干，獲得菌絲體。獲得菌絲體時間為5 10天。實施例4、化學組分分析將細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176接于小麥培養基上培養，獲得子實體。氨基酸含量分析采用氨基酸含量自動分析儀、微量元素分析采用火焰發和石墨爐法，通過留醇薄層 層析、糖醇類紙層層析、有機酸類紙層析、生物堿類薄層層析。分析表明細樣本含天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等；微量元素含鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鎳、硒；此外，多糖、腺苷、甘露醇、甾醇、有機酸和生物堿類與冬蟲夏草活性成分上基本一致。I、腺苷含量測定I. I儀器與試藥Waters 高效液相色譜儀(1525BINARY HPLC PUMP, 2998PhotodiodeArrayDetector，美國Waters公司)；SB25_12DT超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Millipore Simplicity超純水儀(美國Millipore公司)；乙腈(HPLC級，Fisher);磷酸二氫鉀(AR級，國藥集團化學試劑有限公司)；石油醚(AR級，60-90°C，國藥集團化學試劑有限公司)；腺苷(A9251-1G, Sigma 公司)。I. 2 方法I. 2. I色譜條件色譜柱XBridgeC18 色譜柱(Waters, 4. 6mmX 250mm, 5 u m);流動相乙腈-0. 04mol/L磷酸二氫鉀(5 95);流速1. OmL/min ;檢測波長260nm ;柱溫35°C;進樣量20 u L0I. 2. 2對照品溶液的制備精密稱取50mg腺苷對照品，置50mL容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度制成lmg/mL溶液。精密移取適量lmg/mL腺苷對照品溶液,分別配制成IOOii g/mL>50 u g/mL、30 u g/mL、10 u g/mL>5 u g/mL 和 I ii g/mL 腺苷對照品溶液,備用。I. 2. 3供試品溶液的制備精密稱取I. 0118g來自實施例3獲得的細腳擬青霉子實體粉末，于IOOmL具塞錐形瓶中，加IOmL石油醚(60-90°C )，超聲30min。過濾，揮干石油醚，連同濾紙一并放入瓶中。在瓶中加入20mL超純水，稱總重(包括錐形瓶重量)，超聲30min。快速冷卻后稱重，以超純水補至總重，混勻后離心，取上清液，過針筒式濾器得樣品提取液。I. 2. 4標準曲線繪制將對照品I ii g/mL>5 u g/mL、10 u g/mL、30 u g/mL、50 u g/mL、100 U g/mL 溶液進樣，按I. 2. I項下色譜條件測定，以樣品濃度(U g/mL)為橫坐標，峰面積(微伏 秒)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。I. 2. 5供試樣品腺苷含量測定取I. 2. 3項下制備的供試樣品溶液與超純水以I : I的比例混勻，制成待測液。取待測液按I. 2. I項下色譜條件進樣，由回歸方程得待測液腺苷濃度X，根據下列公式得到供試品腺苷含量(mg/g)。計算公式
權利要求
1.一種細腳擬青霉菌株 Paecilomyces tenuipes CGMCC No. 4176。
2.如權利要求I所述細腳擬青霉菌株Paecilomycestenuipes CGMCC No. 4176,其特征在于，所述細腳擬青霉菌株的ITS序列含有如SEQ ID NO :1所示多核苷酸序列。
3.如權利要求I或2所述細腳擬青霉菌株Paecilomycestenuipes CGMCC No. 4176在食品、保健品、藥物和化妝品制備中的用途。
4.如權利要求3所述細腳擬青霉菌株的用途，其特征在于，將所述細腳擬青霉菌株的發酵產物用于制備具有免疫調節、改善營養、護肝、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、提高耐缺氧能力、鎮靜或鎮痛功能的藥物。
全文摘要
本發明屬于微生物領域，具體涉及具有在食品、保健品、藥品、化妝品領域應用價值的一種細腳擬青霉菌株。本發明所提供的是細腳擬青霉菌株PaecilomycestenuipesCGMCCNo.4176具有易于培養、產量高、培養性狀穩定的特點，其培養產物具有調節免疫、抗腫瘤、抗病毒、護肝、改善營養、抗衰老、提高耐缺氧能力、鎮靜、鎮痛等功能，因此具有廣泛的應用價值。
文檔編號C12N1/14GK102676396SQ20121006212
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月9日 優先權日2011年3月14日
發明者孫長勝, 李成, 譚悠久, 陳祝安, 魏寧 申請人:上海泛亞生命科技有限公司