核苷酸、包括其的重組載體、細胞、組合物及它們的應用的制作方法

專利名稱：核苷酸、包括其的重組載體、細胞、組合物及它們的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種核苷酸、包括所述核苷酸的重組載體、含有該重組載體的細胞、含有選自它們中一種或幾種的藥物組合物、以及它們的應用。具體地，本發明涉及一種治療眼科疾病的核苷酸、包括所述核苷酸的重組載體、含有該重組載體的細胞、含有選自所述核苷酸、重組載體和細胞中一種或幾種的藥物組合物、以及所述核苷酸、重組載體和細胞在制備治療眼科疾病的藥物中的應用。
背景技術：
對于眼科領域的疾患而言，不適當的治療會導致致盲性重癥的發生。由于缺乏根本性的治療方法，不得不依賴對癥療法治療的眼科疾病不在少數。最近，發現眼科領域中一部分重癥疾病的發生和惡化是與細胞凋亡相關的。視網膜色素變性，是一種具有明顯家族遺傳傾向的神經退行性疾病，是由于視網膜上的視神經細胞層和色素上皮層廣泛受損而導致細胞死亡的一種難治性疾病。該病病程發展較為緩慢，視細胞變性過程可長達數年至數十年，一般在30歲以前發病，最常見于兒童或青少年起病，至青春期癥狀加重，到中老年時期視力幾乎全部喪失。流行病學調查顯示我國該病的群體發病率為1/3500，全國約有50-100萬患者，這給患者家庭和社會都造成了沉重的經濟負擔和社會負擔。青光眼是指視神經乳頭及視野的特征形變化至少出現了一項，通常情況下，通過充分降低眼內壓可以改善視神經損害或者阻止進一步惡化的眼部功能性結構異常為特征的疾患。關于青光眼，如果不能夠得到適當的治療，常常會導致失明，青光眼引起的失明占我國后天失明原因的第二位。據報道40歲以上的人群中大約5. 8%患有青光眼，依據2000年的統計，我國的40歲以上的人口大約有6500萬人來推算，40歲以上的青光眼患者超過370萬人。這也給患者家庭和社會都造成了沉重的負擔。基因治療(gene therapy)是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受體細胞中，使外源基因制造的產物能治療某種疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療疾病的措施。目前采用何種基因對眼科疾病進行持續有效的基因治療屬于亟待解決的問題。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于采用何種基因對眼科疾病進行持續有效的基因治療。本發明提供了一種治療眼科疾病的核苷酸，所述核苷酸的序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中(I)SEQ ID Nos. 1-19所示的核苷酸序列；以及(2)分別與SEQ ID Nos. 1_19所示的核苷酸序列相比具有至少80%同源性的核苷酸序列。本發明還提供一種治療眼科疾病的重組載體，所述重組載體包括載體及其攜帶的外源基因，其中，所述外源基因為本發明所述的核苷酸。本發明還提供了一種治療眼科疾病的細胞，其中，所述細胞含有本發明的重組載體。本發明還提供了一種治療眼科疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物含有藥學上可接受的賦形劑，以及選自上述重組載體和細胞中一種或幾種。本發明還提供了所述核苷酸、重組載體和細胞分別在制備治療眼科疾病的藥物中的應用。前述應用中所述的眼科疾病為伴隨眼組織細胞凋亡變性的疾病，優選青光眼、視網膜色素變性、視網膜脫落和視網膜缺血性疾患，最優選可以為視網膜色素變性。本發明通過分別將具有選自由SEQ ID Nos. 1-19所組成的組中所示的核苷酸序列以及分別與SEQ ID Nos. 1-19所示的核苷酸序列相比具有至少80%同源性的核苷酸序列導入上述載體中，然后將負載有本發明核苷酸的載體再分別導入宿主體內細胞中持續表達多肽，從而起到治療眼科疾病尤其是青光眼、視網膜色素變性、視網膜脫落和視網膜缺血性疾患的作用，最優選可以為視網膜色素變性。


圖I通過光學顯微鏡得到的重組腺相關病毒治療的視神經細胞核計數結果柱狀圖；圖2通過光學顯微鏡得到的重組慢病毒治療的視神經細胞核計數結果柱狀圖。
具體實施例方式本發明提供了一種治療眼科疾病的核苷酸，所述核苷酸的序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中(I)SEQ ID Nos. 1-19所示的核苷酸序列；以及(2)分別與SEQ ID Nos. 1-19所示的核苷酸序列相比具有至少80%同源性的核苷酸序列。所述(2)中優選地分別與SEQ ID Nos. 1_19所示的核苷酸序列相比具有至少85%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少90%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少91%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少92%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少93%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少94%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少95%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少96%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少97%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少98%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少99%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少99. 5%同源性的核苷酸序列。所述核苷酸的序列優選選自由以下核苷酸序列所組成的組中(I)SEQ ID NO USEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列；以及(2)分別與SEQ ID NO USEQ ID NO :3和SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列相比具有至少90%同源性的核苷酸序列，尤其優選為SEQ ID NO :5。所述(2)中優選地分別與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5所示的核、苷酸序列相比具有至少91%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少92%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少93%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少94%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少95%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少96%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少97%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少98%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少99%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少99. 5%同源性的核苷酸序列。所述核苷酸的序列優選選自SEQ ID NO :8_19所示的核苷酸序列以及分別與SEQID Nos. 8-19所示的核苷酸序列相比具有至少90%同源性的核苷酸序列所組成的組中，其中進一步優選以下核苷酸序列所組成的組中(I)SEQ ID No 8和SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列；以及(2)分別與SEQ ID No :8和SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列相比具有至少90%同源性的核苷酸序列。所述(2)中優選地分別與SEQ ID No :8和SEQID NO : 12所示的核苷酸序列相比具有至少91%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少92%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少93%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少94%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少95%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少96%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少97%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少98%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少99%同源性的核苷酸序列，更優選具有至少99. 5%同源性的核苷酸序列。最優選SEQ ID N0:8。還優選 SEQ ID NO 170本發明還提供一種治療眼科疾病的重組載體，所述重組載體包括載體及其攜帶的外源基因，其中，所述外源基因為本發明所述的核苷酸。所述載體選自由DNA載體和病毒載體所組成的組中。所述DNA載體選自由DNA質粒載體、結合其的脂質體、結合其的分子耦聯體和結合其的多聚物所組成的組中；所述病毒載體選自由腺相關病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體所組成的組中。其中，所述外源基因還可以包括調控序列，例如所述一種或幾種外源基因表達的啟動子、終止子和增強子。所述外源基因也可以包括標記基因(例如，編碼β_半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白或其它熒光蛋白的基因)或其產物調節其它基因表達的基因。所述外源基因除可以是DNA外，還可以是mRNA、tRNA或rRNA，還可以包括通常與轉錄序列相關的轉錄調控序列，例如轉錄終止信號、聚腺苷酸化位點和下游增強子元件。所述載體可以是本領域常用的各種能攜帶外源基因的載體以及技術發展改進的可用的各種能攜帶外源基因的載體。所述載體例如，質粒(裸DNA)、脂質體、分子耦聯體、多聚物和病毒載體。所述質粒(裸DNA)載體可以攜帶目的基因，該攜帶有目的基因的質粒載體可以直接注射或通過基因槍、電穿孔及電融合技術導入到組織細胞中。此外，超聲波有助于提高質粒的轉移效率。超聲波配合微泡回聲比差劑可提高細胞膜的通透性，從而顯著提高裸DNA的轉移和表達效率。這項胞膜滲透技術可在細胞膜表面瞬間制造小孔，DNA則趁機進入細胞內。 所述脂質體是由脂質雙分子層組成的顆粒，可介導目的基因或攜帶目的基因的質粒載體穿過細胞膜。所述脂質可以是來源于蛋黃和大豆的以卵磷脂(磷脂酰膽堿，PC)為主的天然磷脂；也可以是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)等合成磷脂；還可以含有膽固醇。優選的脂質體為陽離子脂質體，其主要由帶正電荷的脂類及中性輔助脂類以等摩爾混合而成。該帶正電荷的脂質體與帶負電荷的DNA之間可有效地形成復合物，并通過內吞作用移入細胞內。
所述分子耦聯體是將攜帶目的基因的質粒載體共價結合到細胞表面特異受體的配基或單克隆抗體或病毒胞膜蛋白上，利用特異的結合特性介導外源性基因導入至特定類型的細胞中。所述多聚物，即利用陽離子多聚體，如多聚左旋賴氨酸上的正電荷與質粒載體上的負電荷結合發生電性中和胍，而形成穩定的多聚物/DNA復合物。所得陽離子多聚體與DNA的復合物仍帶正電荷，可與細胞表面帶負電荷的受體結合，而被滲入至細胞內。病毒通常可以高效率地進入特定的細胞，表達自身蛋白，產生新的病毒粒子，因此，被改造的病毒首先成為了基因治療的載體。例如，逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純皰疹病毒載體等。所述載體優選選自由腺相關病毒載體和慢病毒載體所組成的組中。其中，所述腺相關病毒屬于非致病性的微小病毒科家族成員，只有依賴于輔助病毒才可能增殖。腺相關病毒基因組很小，如2型腺相關病毒是由4681個核苷酸組成的單鏈DNA,包含2個基因，即rep基因(編碼負責調節病毒復制、結構基因表達和整合到宿主基因組中的蛋白)及cap基因(編碼衣殼結構蛋白)，基因組的I個末端存在I個145bp的末端重復區。腺相關病毒可感染分裂期及靜止期細胞，能插入到宿主細胞染色體內，或以染色體外串聯體DNA的形式長期穩定表達，可有效地轉導腦、骨骼肌及肝臟等類型的細胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特點。本發明的優選載體為腺相關病毒載體。其具有安全性好、宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。優選的載體可以為慢病毒載體。慢病毒類包括一系列感染靈長類動物的病毒如人類免疫缺陷病毒HIV-I和HIV-2，猴免疫缺陷病毒SIV，和感染非靈長類動物的病毒如梅迪/維斯那病毒(MVV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、和牛免疫缺陷病毒(BIV)。慢病毒家族中HIV-I和HIV-2、SIV、FIV、EIAV和CAEV等被研究用作基因治療的載體。而基因治療潛在靶細胞許多為非分裂細胞，主要有肝細胞、神經元細胞、造血干細胞、肌細胞、巨噬細胞等，慢病毒可以介導目的基因高效轉導非分裂細胞，因此在人類基因治療方面逐漸受到重視。本發明還提供了一種治療眼科疾病的細胞，其中，所述細胞含有本發明的重組載體。這里所述的“治療眼科疾病的細胞”不僅包括直接施用于受治者的含有本發明重組載體的細胞；還包括在實現治療過程中所使用到的細胞，例如用于擴增培養本發明重組載體的細胞，但該細胞并不直接用于給藥于受治者。所述細胞可以是內源性(來自受治者本身的細胞)，也可以是外源性的(例如來自同種異體的細胞甚至異種細胞，其中包括可商購的細胞系)。所述細胞選自293T細胞、多能干細胞、視網膜色素上皮細胞、虹膜色素上皮細胞、結膜上皮細胞和視網膜感光細胞中的一種或幾種。所述多能干細胞優選選自胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞、造血干細胞和角膜緣干細胞中的一種或幾種。所述直接施用于受治者的含有本發明重組載體的細胞在用于治療眼科疾病時，常用的方法例如①自體移植取材于患者自體，優點是無免疫排斥反應。缺點是供材有限，需要較好的分離培養技術。②同種異體移植取自他人組織，例如可以來自新鮮尸體(與角膜移植所需要求相當)，也可取自患者親屬(活體)，還可以購自商業上可供的細胞系。優點是供材較易；缺點是可出現免疫排斥反應。③異種移植取自其他動物，通常有更明顯的排斥反應，需用組織工程方法加以克服。其中，所述細胞優選視網膜色素上皮細胞。例如視網膜色素上皮細胞ARPE-19可以作為本發明真核表達載體的宿主細胞。所述視網膜色素上皮細胞可以是商購的細胞系，也可來自于例如視網膜色素變性患者的受治者。在基因治療過程中，優選來自于受治者自體的視網膜色素上皮細胞ARPE，導入含本發明的核苷酸的重組載體后，重新移植至該受治者不容易發生免疫排斥反應。本發明還提供了一種治療眼科疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物含有藥學上可接受的賦形劑，以及選自上述重組載體和細胞中一種或幾種。優選地，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的賦形劑以及選自本發明所述的重組載體和本發明所述的細胞中的一種或幾種。 優選地，所述藥學上可接受的賦形劑為維持所述藥物組合物pH為7. 2 7. 6的IOmM三羥甲基氨基甲烷(Tris)，優選地PH為7. 4 ;每毫升注射液中含有IO6-IO12Vg的所述重組載體，優選地每毫升注射液中含有IOltVg的所述重組載體。優選地，所述藥學上可接受的賦形劑為pH值為5. 0-9. O的磷酸緩沖液；每毫升注射液中含有IO6-IO12Vg的所述重組載體，優選地每毫升注射液中含有IOiciVg的所述重組載體。所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為O. 01-30重量％，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀和/或氯化鎂。使用所述注射液時，每次給予受治個體IO6-IO12Vg的所述重組載體，優選IO8-IO11Vg,更優選IOltl-IO1Vg,尤其優選IO8 ;進一步優選所述重組載體是重組腺相關病毒載體，每次給予受治個體IO6-IO12Vg的該腺相關病毒載體，優選IO8-IO11Vg,更優選101(Vg。當注射本發明所述藥用組合物時，注射用量可以為本領域常用的劑量，至多300微升、一般1-200微升、優選50-150微升；如選擇視網膜下腔注射方式時，人每只眼睛一次注射劑量為50 150微升，優選100微升。本發明所述注射液給藥次數可以根據各種參數、尤其根據待治療患者的年齡、體重和病癥、疾病或病癥的嚴重程度以及給藥途徑來確定。本發明所述注射液給藥次數為多次，優選為I 5次，最優選為I次。因為本領域技術人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量僅作為參考。所述劑量可以根據各種參數、尤其根據待治療患者的年齡、體重和病癥、疾病或病癥的嚴重程度以及給藥途徑來確定。本發明所述藥物組合物注射液也可以系統給藥，也可以將本發明的藥物組合物注射液注射到局部部位(例如，視網膜下腔給藥)。在視網膜下腔給藥的情況下，所述的給藥I次是指每給藥I只患病眼為I次，優選給藥次數為I次。本發明還提供了所述核苷酸、重組載體和細胞分別在制備治療眼科疾病的藥物中的應用。前述應用中所述的眼科疾病為伴隨眼組織細胞凋亡變性，尤其優選青光眼、視網膜色素變性、視網膜脫落和視網膜缺血性疾患。前述應用中所述的眼科疾病最優選可以為視網膜色素變性。
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。除非特別說明本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。
實施例中采用的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆實驗指南》第三版。實施例I化學合成本發明核苷酸交由大連寶生物公司分別合成SEQ ID Nos. 1-19，并在它們兩端加上合適的限制內切酶酶切位點Cla I (ATCGAT)和Bgl 11 (AGATCT)，連于pMD_18T載體上，分別記為pMD-18T-Sl、pMD-18T-S2、pMD-18T-S3、pMD-18T-S4、pMD-18T-S5、pMD-18T-S6、pMD-18T-S7、PMD-18T-S8、pMD-18T-S9、pMD-18T_S10、pMD_18T_Sll、pMD_18T_S12、pMD_18T_S13、pMD-18T-S14、pMD-18T-S15、pMD-18T-S16、pMD-18T-S17、pMD-18T-S18 和 pMD_18T_S19。經測序，合成序列SEQ ID Nos. 1-19正確。實施例2重組腺相關基因轉移載體(以下簡稱AAV)的構建I)將pMD-18T-Sl轉化感受態大腸桿菌DH5a，在含100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養基平板上過夜培養，長出的陽性克隆在含氨芐青霉素的LB液體培養基中過夜培養，離心收集菌體，用質粒提取試劑盒提取PMD-18T-S1，提取產物送測序公司測序，確認連入的序列正確，測序結果正確的置_80°C保存備用；2)用限制性內切酶 Cla I (ATCGAT)和 BglII (AGATCT)將 SEQ ID No :1 片段從PMD-18T-S1載體中切出，凝膠電泳回收目標產物SEQ ID No 1片段各30ul ；3)用限制性內切酶酶Cla I (ATCGAT)和BglII(AGATCT)酶切pAAV-hrGFP (Stratagene公司)，凝膠電泳回收載體片段各50ul ；4)在T4連接酶的作用下將步驟2)回收的SEQ ID No : I片段與步驟3)回收的載體片段連接，按照上述I)中的方法進行轉化測序，確認連入的序列正確。鑒定正確的即為腺相關病毒外源基因轉移載體pAAV-Sl，_80°C下保存備用。按照上述方法制備獲得其余十八個序列的腺相關病毒外源基因轉移載體pAAV-S2、pAAV-S3、pAAV_S4、pAAV_S5、pAAV_S6、pAAV_S7、pAAV_S8、pAAV_S9、pAAV-S10、pAAV-Sll、pAAV-S12、pAAV-S13, pAAV-S14, pAAV-Sl5, pAAV_S16、pAAV_S17、pAAV_S18、pAAV-S19。負載有SEQ ID No. USEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4、SEQ IDNo.5、SEQID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ IDNo. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQID No. 18和SEQ ID No. 19的腺相關病毒載體(pAAV)分別與腺相關病毒外源基因轉移載體 pAAV-Sl、pAAV-S2、pAAV_S3、pAAV_S4、pAAV_S5、pAAV_S6、pAAV_S7、pAAV_S8、pAAV_S9、pAAV-S10、pAAV-Sll、pAAV-S12, pAAV-S13, pAAV_S14、pAAV-Sl5, pAAV-S16, pAAV_S17、pAAV-S18 和 pAAV-S19 相對應。實施例3攜帶治療基因的rAAV載體的大量制備及濃縮3-1、攜帶SEQ ID No 1片段的rAAV-Sl載體制備以改造型基因轉移載體pAAV-Sl、Cap/Rep輔助質粒R2C2、腺病毒輔助病毒(pAdhelper) 3 種質粒系統(stratagene 公司,AAV Helper-Free System)為基礎，對 AAV載體進行制備。攜帶治療基因的載體以每20個15cm培養皿為單位進行生產。按照每一個15cm的塑料培養皿接種大約IO7的293T細胞，培養24小時后，將培養基用OPTI-MEM培養基置換，在37°C，5%二氧化碳培養箱中孵育，準備用于轉染。準備轉染復合物，用磷酸鈣轉染試劑進行轉染。轉染后的次日，用新鮮的30ml含10%胎牛血清的DMEM培養基進行交換培養。轉染兩天后，回收上清和細胞。參照吳小兵等的文獻(吳小兵等，一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法，科學通訊，2000，45 (19)，2071-2075)進行高速分離純化rAAV-Sl載體，得到濃縮和純化的病毒液。將病毒液用孔徑為O. 45 μ m的過濾器進行過濾，濾液經陽離子柱(SP sepharose4FF)純化(上樣流速5ml/min), D-PBS洗至平衡,用含lmol/1 的 NaCl 的 D-PBS 溶液洗脫,用超濾管(100KD,milipore) 2000rpm/min 超濾 3min 后，再用孔徑為O. 22 μ m的過濾器進行過濾。收集濾液，濾液中的AAV病毒載體保存在D-PBS中。分裝后在在_80°C下進行保存，取其中一份進行滴度檢測。按照上述方法大量制備攜帶SEQ ID Nos. 2-19片段的rAAV_S2—19載體及不攜帶目的基因的空載體pAAV-hrGFP的病毒液。3-2、滴度測定使用點雜交方法測定AAV載體滴度的含義為每ml病毒液中含有病毒顆粒的基因組拷貝數(vector genomes/ml,簡稱vg/ml)。用負載有人源化綠色突光蛋白的病毒載體pAAV-hrGFP (Stratagene公司)作為AAV載體滴度測定的標準品，用啟動子/目的基因序列標記探針與標準和供試樣品在膜上進行雜交，通過比較雜交膜上待測樣品與標準系列的雜交信號的強弱，判斷待測的AAV載體樣品點所含啟動子/目的基因的拷貝數，從而推算出AAV載體滴度(vg/ml)。
載體滴度測定所需溶液I)預雜交液5 X SSCU % (W/V)封阻試劑(Roche 公司，Cat#l 1096176001)、0· 1% (W/V)N_ 十二烷酰肌氨酸鈉和O. 02% (ff/V) SDS。2)雜交液5XSSCU% (ff/V)封阻試劑、(λ 1% (W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉、(λ 02% (ff/V) SDS和新變性的探針DNA(20ul)(探針現用現加)。3) 2 X SSC/0. I % (ff/V) SDS用5 X SSC 和 10% 的 SDS 按比例稀釋成 2XSSC/0. 1% (ff/V) SDS04)0. IX SSC/0. I % SDS用5 X SSC 和 10% 的 SDS 按比例稀釋成 O. 1XSSC/0. 1% (ff/V) SDS05)緩沖液I順丁烯二酸(IOOmmoI/L)；NaCl (150mmol/L) ；pH7. 5(20°C )。6)緩沖液2I % (ff/V)封阻試劑，配制于緩沖液I中。7)緩沖液3Tris-HCl(IOOmmoI/L) ；NaCl(IOOmmoI/L) ；pH9. 5(20°C )。8)緩沖液4Tris-HCl (lOmmol/1) ；EDTA (ImmoI/L) ；pH8. 0(20°C )。
9)顯色溶液新鮮配制，在IOml緩沖液3中，加45 μ I NBT溶液(Roche公司，Cat#11383 213001)和 35 μ I BCIP (Roche 公司，Cat#l I 383 221 001)。10)5mol/L LiCl。3-2-1探針標記與純化I) PCR方法探針標記反應體系如下所示
10 X緩沖液5μ1
IOxdNTPΙμ
上游引物(25μΜ)Ιμ 下游引物(25μΜ) Ιμ Taq 酶(5ιι/μ1)Ιμ
標準品IOOng補ddH20至總體積為50 μ I。其中，上游引物5’ -GTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA-3 ’下游引物5，-GGTCCCGGTGTCTTCTATGGA-3，。反應條件94。。，300s ；94°C,30s ；55°C,30s ；72°C, I 分鐘；—30 個循環的 72。。，300s。其中，所使用的PCR儀為TECHNE Techgene公司的儀器編號為PCR-02 04的儀器。2)探針的純化a)向50 μ I的PCR反應溶液中加入4 μ I 5mol/L LiCl和150 μ I預冷(0°C下20分鐘)的無水乙醇，置于_70°C 30分鐘或_20°C 2h。b)4°C以12000rpm離心10分鐘，沉淀加入200ul70%乙醇水溶液輕輕上下顛倒2次，4°C以12000rpm離心5分鐘，吸棄上清，重復離心I次。c)室溫下干燥10分鐘，用20 μ I ρΗ8. O的TE緩沖液溶解沉淀。置_20°C保存備用。3-2-2樣品和標準品的預處理a)取 3-1 中制備的待檢載體 10μ 1，加入 9μ I (ΜΗ20、1μ1 DNaseI (SIGMA 公司)，至總體積20 μ I。37°C孵育lh。b)將標準品經紫外分光光度計(S0P-ZJ01-YQ005)定量，用TE(pH8. O)稀釋，使之濃度分別為 10. 4ng/ μ I, 7. 8ng/ μ I, 5. 2ng/ μ I, 2. 6ng/ μ I, I. 3ng/ μ I, O. 65ng/ μ I。c)將樣品和步驟b)系列稀釋的標準品于100°C煮沸10分鐘變性后，立即置于冰水中。d)將變性后的樣品和系列稀釋的標準品各取1μ I點于尼龍膜(正電荷標記，Roche公司，Cat#l 209 299)上，待點于所述膜上的液體完全干后，把所述膜用兩張濾紙夾好，放在一個玻璃盤中，放入120°C烤膜20分鐘。3-2-3 預雜交將所述膜用小鑷子夾住一角放入塑料袋，加入2ml預雜交液，排除氣體后密封，在68°C水浴預雜交3小時。3-2-4 雜交將所述預雜交袋剪一個小口，倒出大約I. 8ml預雜交液，加入2ml雜交液，于68°C水浴雜交過夜(18小時)。3-2-5洗膜雜交a)將所述膜取出放到一個干凈的一次性平皿中，室溫下加入20ml 2XSSC/0. 1%(ff/V) SDS溶液，放在搖床上以80rpm，洗5分鐘，2次。b)取出所述膜放到一個50ml的三角瓶中，加入30ml O. I X SSC/0. I % SDS在68°C條件下溶液漂洗，15分鐘，2次。3-2-6免疫測定c)將所述膜放到一個一次性的平皿中，加入緩沖液120ml中，室溫，短暫洗滌5分鐘。d)再將所述膜放到20ml的緩沖液2中，室溫放置15分鐘，不時搖動。e)再用20ml緩沖液I洗滌30秒。f)用IOml緩沖液2稀釋抗地高辛抗原結合片段(Anti-DIG-Fab)得到150U/L(I 5000)的抗體結合物溶液，所述膜在前述抗體結合物溶液中室溫放置30分鐘。g)用20ml緩沖液I搖洗，以除去未結合的抗體結合物，15分鐘，共洗2次。h)所述膜在IOml緩沖液3中平衡5分鐘。i)將所述膜放入IOml顯色溶液中，避光顯色反應3小時。j)當標準品顯色出現明顯的梯度，即顯色完成，用IOml緩沖液4洗膜10分鐘以終止反應。k)掃描顯色結果，用Bandscan 4. 3軟件處理數據(S0P-ZJ01-01027)。根據雜交信號，確定待檢樣品的滴度。滴度(vg/ml)=對應的拷貝數X2X稀釋倍數上述測定滴度的方法按照地高辛DNA標記和檢測試劑盒(Roche公司)說明書所記載的步驟進行。按照上述方法測定的實施例3-1制得的攜帶SEQ ID Nos. 1-19片段的rAAV-Sl-S19載體及空載體pAAV-hrGFP的病毒液滴度均為I X 1012vg/mlo實施例4重組慢病毒載體(以下簡稱Len)的構建及大量制備
4-1重組慢病毒基因轉移載體Len-Sl的構建以pMD-18T-Sl質粒為模板，以如下引物做PCR擴增正向引物 S 1-Forward atgcaggccctggtgctactcc反向引物 S 1-Reverse tcatctcacagccttcctgctgPCR反應循環條件:95°C變性5分鐘，然后在95°C，30秒；，60°C，I分鐘，72°C，45秒40個循環，最后72°C延伸IOmin。凝膠回收后將得到的序列(長度為1737bp)按照說明書采用TA克隆的方法連入pLenti6.3/V5-TOPO 載體(Invitrogen K5315-20)，測序確認連入的片段序列正確，則.得到的即為Len-Sl。按照上述方法，不同的是，以表I中的模板、引物進行PCR擴增凝膠回收后將得到的序列按照上述方法制備并測定攜帶其余18個序列(SEQ IDNos. 2-19)的重組慢病毒基因轉移載體Len_S2 Len_S19。表I
權利要求
1.一種治療眼科疾病的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中 (1)SEQID Nos. 1-19所示的核苷酸序列；以及 (2)分別與SEQID Nos. 1_19所示的核苷酸序列相比具有至少80%同源性的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中 (1)SEQID NO USEQ ID NO :3和SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；以及 (2)分別與SEQID NO USEQ ID NO :3和SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列相比具有至少90%同源性的核苷酸序列。
3.根據權利要求I所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中 (1)SEQID No 8和SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列；以及 (2)分別與SEQID No 8和SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列相比具有至少90%同源性的核苷酸序列。
4.一種治療眼科疾病的重組載體，所述重組載體包括載體及其攜帶的外源基因，其特征在于，所述外源基因為權利要求1-3中任意一項所述的核苷酸。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述載體選自由DNA載體和病毒載體所組成的組中。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述DNA載體選自由DNA質粒載體、結合其的脂質體、結合其的分子耦聯體和結合其的多聚物所組成的組中；所述病毒載體選自由腺相關病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體所組成的組中。
7.一種治療眼科疾病的細胞，其特征在于，所述細胞含有權利要求4-6所述的重組載體。
8.根據權利要求7所述的細胞，其特征在于，所述細胞選自293T細胞、多能干細胞、視網膜色素上皮細胞、虹膜色素上皮細胞、結膜上皮細胞和視網膜感光細胞中的一種或幾種。
9.根據權利要求8所述的細胞，其特征在于，所述多能干細胞選自胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞、造血干細胞和角膜緣干細胞中的一種或幾種。
10.一種治療眼科疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有藥學上可接受的賦形劑，以及選自權利要求4-6所述的重組載體和權利要求7-9所述的細胞中的一種或幾種。
11.根據權利要求10所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的賦形劑，以及權利要求4-6任意一項所述的重組載體。
12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的賦形劑為維持所述藥物組合物pH為7. 2 7. 6的IOmM三羥甲基氨基甲烷；每毫升注射液中含有IO6-IO12Vg的所述重組載體。
13.根據權利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的賦形劑為維持所述藥物組合物PH值為5. 0-9. O的磷酸緩沖液；每毫升注射液中含有IO6-IO12Vg的所述重組載體。
14.根據權利要求12或13所述的藥物組合物，其特征在于，所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為O. 01-30重量％，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑選自氯化鈉、氯化鉀和氯化鎂中的一種或幾種。
15.選自權利要求1-3所述的核苷酸、權利要求4-6所述的重組載體以及權利要求7-9所述的細胞和權利要求10-14所述的組合物在制備治療眼科疾病的藥物中的應用。
16.根據權利要求15所述的應用，其特征在于，所述眼科疾病為伴隨眼組織細胞凋亡變性的眼科疾病。
17.根據權利要求16所述的應用，其特征在于，所述眼科疾病選自青光眼、視網膜色素變性、視網膜脫落和視網膜缺血性疾患中的一種或幾種。
全文摘要
本發明提供了一種核苷酸，其中，所述核苷酸的序列選自由SEQ IDNos.1-19所示的核苷酸序列以及分別與之相比具有至少80％同源性的核苷酸序列所組成的組中。本發明還提供了包括所述核苷酸的重組載體、含有該重組載體的細胞、含有它們的藥物組合物，以及它們的應用。本發明通過分別將具有選自由SEQ ID Nos.1-19所組成的組中所示的核苷酸序列以及分別與之相比具有至少80％同源性的核苷酸序列的核苷酸導入病毒載體中，然后將負載有本發明核苷酸的病毒載體再分別導入宿主體內細胞中持續表達多肽，從而起到治療眼科疾病尤其是治療伴隨眼組織細胞凋亡變性疾病的作用。
文檔編號C12N15/63GK102618535SQ201210078288
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月22日 優先權日2011年3月22日
發明者周志文, 樊俊蝶, 蔣立新 申請人:北京三諾佳邑生物技術有限責任公司