專利名稱：小麥抗赤霉病擴展基因Fhb1的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于作物育種學領域，涉及小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記及其應用。
背景技術：
小麥是世界上最重要的糧食作物之一，提供人類大約20%的能量。在小麥生產中許多生物與非生物逆境直接影響小麥的產量與品質。赤霉病就是其中最重要的ー種生物逆境，嚴重影響小麥的品質和產量。抗病品種的選育和應用是控制赤霉病最經濟有效的方法，抗病基因的發掘是抗病育種的前提和基礎，而開發與抗病基因緊密連鎖的分子標記更是應 用抗病基因的關鍵。小麥對赤霉病的抗性主要有五種類型(Mesterhazy 1995),其中抗擴展(Type I)和抗擴展(Type II) (Schroeder and Christensen 1963)是最主要的兩種類型。Type I 抗性主要反映小麥抵抗病原菌的初擴展，是小麥抵御赤霉菌危害的第一道屏障，在抗性反應中起著至關重要的作用。許多研究表明小麥對赤霉病的抗性是典型的數量性狀，受多基因控制。迄今為止已經定位了大約200多個抗赤霉病QTL，其中位于3B染色體上的抗赤霉病擴展QTL存在于多個抗性種質中，表達穩定且效應最強，且具有很好的抗病育種潛カ(Liu and Anderson2003)。Liu et al. (2006)將該 QTL 精細定位到相距 I. 2cM 的 XSTS3B-189-XSTS3B-206 區間，并將其命名為Fhbl。Lin et al (2006)利用望水白X南大2419重組自交系群體在望水白的3B染色體上也檢測到該QTL，定位于Xbarc 147-Xgwm493區間，解釋30%左右的表型變異。由于小麥赤霉病抗性具有典型的數量性狀特征，易受環境影響，早期世代很難對其進行選擇。此外，許多抗赤霉病種質的農藝性狀較差，且地區適應性較強，利用傳統育種方法培育抗性品種費時費カ可能也得不到預期的結果。分子標記輔助選擇育種與傳統育種相比，可以在早期世代確定目標基因型，且選擇不受基因表達及環境條件的影響，能夠提高選擇的準確性，從而加快育種進程(Collard and Mackill 2008)。因此與其更緊密連鎖分子標記的開發有利于提高對Fhbl的應用效率。此外，Fhbl目前所在區間對應的物理區間在望水白中還不知有多大，有必要開發更緊密連鎖的分子標記加快該基因的克隆研究。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供與小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl更加緊密連鎖的分子標記。本發明的另ー個目的是提供該小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記的應用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記，用標記引物MAG6067-F :SEQ ID NO. I,MAG6067-R SEQ ID NO. 2擴增小麥品種DNA，獲得的擴增片段為280bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標記MAG6067，該標記為顯性分子標記，與Fhbl緊密連鎖，利用Mapmaker Macintosh V 3. 0測得該標記與Fhbl基因的遺傳距離為0. 05cM ；或用標記引物MAG6660-F :SEQ ID NO. 3, MAG6660-R SEQ ID NO. 4 擴增小麥品種DNA,獲得的擴增片段為510bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標記MAG6660，該標記為共顯性分子標記，與Fhbl緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3.0測得該標記與Fhbl基因共分離。所述的分子標記在小麥種質資源中抗赤霉病擴展基因Fhbl的鑒定中的應用。小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記方法，用上述的任意ー對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物，如果用分子標記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能夠擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標志著待檢小麥存在抗赤霉病擴展基因Fhbl。
本發明所述的分子標記在篩選抗赤霉病小麥中的應用。利用上述的分子標記篩選抗赤霉病小麥的方法為用上述的任意ー對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物，如果用分子標記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能夠擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標志著待檢小麥為存在抗赤霉病擴展基因Fhbl的抗赤霉病小麥。所述的分子標記的引物在克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl中的應用。上述小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記是通過以下方法獲得的(一)望水白Fhbl近等基因系NMAS016與其輪回親本綿陽99-323F2:3群體的創建與Fhbl區段重組體的篩選(1)NMAS016(早)與小麥品種綿陽99-323 (3)進行雜交得到雜種F15F1自交產生F2群體；(2)利用Fhbl的邊界標記篩選F2群體中在該區段發生重組的雜合單株，利用相同標記在其F3代篩選在該區段發生重組的純合單株。(ニ)重組體抗病表型的鑒定(3)重組體開花時采用單花滴注法接種。接種15天后分單株調查病小穗數和病軸長評價其抗擴展性；(三)分子標記分析(4)用SDS法提取抗病親本NMAS016、感病親本綿陽99_323及F2群體各單株的DNA ;用中國春3B序列開發的69個SSR標記對NMASO16，綿陽99-323，中國春以及中國春缺失系3BS8-0. 78-0. 87 (Endo and Gill 1996)進行多態性分析和特異性分析。(5)選擇在親本間擴增出多態、且能缺失定位到3BS8-0. 78-0. 87bin的分子標記在F2代群體單株中擴增獲取群體各單株的基因型資料，并且利用這些標記檢測雜合重組體后代F3家系各單株的基因型；PCR 反應體系為 12. 5 ii I，其中 10 X buffer I. 25 u I, 25mM MgCl2O. 75 u I,
2.5mMdNTPs I yl，左右引物各 0. 2 y M，Taq 酶(5u/yl) 0. I yl，模板 DNA 10ng，加水至12. 5u I ；PCR擴增程序為94°C預變性3min后，94°C變性30sec，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，循環35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結果。(四)分子標記獲得(6)根據連鎖交換規律，結合F2代群體各單株基因型資料與雜合重組體F3家系的田間抗病表型，利用軟件Mapmaker Macintosh V3. 0構建望水白Fhbl的遺傳連鎖圖，獲得了與Fhbl最為緊密連鎖的分子標記MAG6067和MAG6660。有益效果 本發明在國際上首次獲得了與Fhbl緊密連鎖的分子標記MAG6067和MAG6660。可以加速抗病基因Fhbl在小麥抗病育種中的應用，并且還可以用于Fhbl基因的克隆。I、獲得了與Fhbl緊密連鎖的分子標記MAG6067和MAG6660。在已知的分子標記中與Fhbl連鎖最為緊密的是MAG6660，與Fhbl基因共分離，能夠幫助該基因向推廣品種中轉移以及與其它抗病基因的聚合。2、鑒定方便。這兩個分子標記都為共顯性標記，具有檢測方便、擴增穩定、簡便等優點。用標記MAG6660檢測Fhbl基因，可以確定Fhbl的存在與否以及存在狀態，并預測小麥的赤霉病抗性，進而快速篩選攜有Fhbl的植株并用于抗病品種的選育。同時利用分子標記進行實驗室檢測可以避免環境對品種的影響。3、提高抗病品種的選擇鑒定效率，節約成本。在傳統的抗赤霉病育種過程中，需要將攜帶有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，對后代群體單株進行抗病性鑒定，并且需要多年多點的表型鑒定；并且抗病表型鑒定易受環境的影響，表型鑒定結果有一定的誤差。因此抗病品種的選育不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測與抗赤霉病擴展基因Fhbl緊密連鎖的分子標記，可以將表型鑒定的工作大大減少，并且在苗期就可鑒定出攜有抗病基因Fhbl的單株，從而淘汰非目標植株。因此，通過檢測與抗赤霉病擴展基因Fhbl共分離的分子標記MAG6660進行選擇，不僅節約育種成本同時大大提高抗病品種的選擇效率。4、可用于克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl研究。圖位克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl的前提在于獲得與Fhbl緊密連鎖的分子標記。MAG6067和MAG6660在所有已知分子標記中與Fhbl連鎖最為緊密。
圖1MAG6067和MAG6660與小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的遺傳連鎖圖，右邊為遺傳連鎖圖的標記，左側數據為標記間的遺傳距離。圖2MAG6067 擴增帶型。I 為 NMAS016，2 為綿陽 99-323，3、4、5、6、12、18、19，20、21為抗病基因型單株，其余為感病或雜合基因型單株。箭頭所指為特異擴增條帯。圖3MAG6660擴增帶型。M為PUM，左側是分子量標記條帶大小(bp)。I為NMAS016，2為綿陽99-323，3、8、15、16、17為抗病基因型單株，2、5、9、13、19、20為感病基因型單株，4、6、7、10、11、12、14、18、21為雜合基因型單株。箭頭所指為特異擴增條帯。
具體實施例方式實施例I
上述小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記是通過以下方法獲得的(一)望水白Fhbl近等基因系NMAS016與其輪回親本綿陽99-323F2:3群體的創建與Fhbl區段重組體的篩選(1)NMAS016(早)與小麥品種綿陽99-323 (3)進行雜交得到雜種F15F1自交產生包含有2875個單株的F2群體；(2)利用 Fhbl 的邊界標記 Xbarc 147 和 Xgwm493 (http://wheat, pw. usda. gov/GG2/)在F2群體中篩到71個在該區段發生重組的雜合單株，利用相同標記在其F3代篩選得到99個在該區段發生重組的純合單株。(ニ)重組體抗病表型的鑒定 重組體開花時采用單花滴注法接種。接種15天后分單株調查病小穗數和病軸長度評價其抗擴展性。鑒定結果表明這些重組體抗性分離明顯，攜帯有Fhbl基因的株系與感病親本相比，抗性有顯著提高(表I)。(三)多態性分子標記的篩選及重組體基因型分析(I)首先利用中國春3B序列開發的69個SSR標記Fhbl近等基因系NMAS016和綿陽99-323進行多態性篩選，最終得到2個在親本間有多態的SSR標記MAG6067和MAG6660。(3)利用在親本間有多態的分子標記BARC147、GWM493、MAG6067和MAG6660分析所有純合重組體，這些重組體僅可分成6種重組類型(表I)。(四)分子標記的獲得根據連鎖交換規律，結合F2代群體各單株基因型資料與雜合重組體F3家系的田間抗病表型(表I)，利用軟件Mapmaker Macintosh V3. 0構建了望水白Fhbl的遺傳連鎖圖，獲得了與Fhbl緊密連鎖的分子標記MAG6067和MAG6660，它們分別距Fhbl基因0. 05cM、OcM。MAG6067和MAG6660分子標記引物擴增帶型見圖2和圖3。表1NMAS016-綿陽99_323F2:3群體中純合重組體的基因型和表型
權利要求
1.小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記，其特征在于 用標記引物 MAG6067-F :SEQ ID NO. I, MAG6067-R SEQ ID NO. 2 擴增小麥品種 DNA，獲得的擴增片段為280bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標記MAG6067，該標記為顯性分子標記，與Fhbl緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. 0測得該標記與Fhbl基因的遺傳距離為0. 05cM； 或用標記引物 MAG6660-F :SEQ ID NO. 3, MAG6660-R SEQ ID NO. 4 擴增小麥品種 DNA，獲得的擴增片段為510bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標記MAG6660，該標記為共顯性分子標記，與Fhbl緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. 0測得該標記與Fhbl基因共分離。
2.權利要求I所述的分子標記在小麥種質資源中抗赤霉病擴展基因Fhbl的鑒定中的應用。
3.小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標記方法，其特征在于用權利要求I所述的任意ー對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物，如果用分子標記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能夠擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標志著待檢小麥存在抗赤霉病擴展基因FhbI。
4.權利要求I所述的分子標記在篩選抗赤霉病小麥中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于利用權利要求I所述的分子標記在篩選抗赤霉病小麥的方法為用權利要求I所述的任意ー對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物，如果用分子標記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標志著待檢小麥為存在抗赤霉病擴展基因Fhbl的抗赤霉病小麥。
6.權利要求I所述的分子標記的引物在克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl中的應用。
全文摘要
本發明屬于作物育種學領域，涉及小麥抗赤霉病擴展基因Fhb1的分子標記及其應用。所述的分子標記選自MAG6067或MAG6660中的任意一種，與Fhb1基因的遺傳距離分別為0.05cM和0cM。本發明在國際上首次獲得了與Fhb1最為緊密連鎖的分子標記。用標記MAG6660檢測Fhb1基因，可以確定Fhb1的存在與否以及存在狀態，并預測小麥的赤霉病抗性，進而快速篩選攜有Fhb1的植株并用于抗病品種的選育。同時利用分子標記進行實驗室檢測可以避免環境對表型的影響。利用本發明與Fhb1緊密連鎖的分子標記，可以大大節省抗病材料的篩選時間和勞力，并加強預測的準確性，還可以加快Fhb1基因的克隆。
文檔編號C12N15/10GK102653759SQ20121008519
公開日2012年9月5日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者李國強, 薛樹林, 郜忠霞, 馬正強 申請人:南京農業大學