專利名稱：利用酒糟發酵生產乙偶姻和轉化生產四甲基吡嗪的方法
技術領域：
本發明涉及一種以酒糟為原料，通過微生物發酵生產乙偶姻和轉化生產四甲基吡嗪的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
食品添加劑產業是現代食品工業的核心組成，在食品工業的產業升級中發揮著極其重要的作用。目前，全球各類食品添加劑的總消費量已接近1000萬噸，品種有25000多種，而香精和香料則是其中用量最大、種類最多的一類食品添加劑。目前，在人們對食品添加劑營養、健康、安全性的強烈要求下，采用工業生物技術開發綠色、安全的香精香料等食品和飼料添加劑已成為該行業實現可持續發展的重要途徑，對于催生我國高效、安全、健康、天然的香精香料產業，帶動我國食品行業整體水平的發展，具有極其重要的意義。乙偶姻，即3-羥基-2-丁酮，天然存在于乳品、黃油、干酪、酒類、玉米、葡萄、蘋果、草莓、可可等各類食品中，是一種應用廣泛的食用香料，其具有明顯的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、酸奶等香料的生產。國家標準GB2760-86規定其為容許食用的香料，美國食品和萃取協會(FEMA)安全號為2008。此外，乙偶姻作為一種平臺化合物，廣泛應用于食品、制藥、化工、IT等行業。乙偶姻的生產方法主要分為兩類化學合成法與生物合成法。化學法生產乙偶姻存在著產品收率低、高能耗、高污染、且產品質量難以達到食用香料的要求。生物合成法生產的乙偶姻，有效地避免了上述問題，產品綠色天然、反應條件溫和、污染少、能耗低，是一種十分具有發展前景的合成方法。目前有應用微生物采用合成培養基液態發酵生產乙偶姻的方法，但是存在原料成本高，發酵廢液處理等問題。至今還沒有采用酒糟等作為原料培養基進行固態發酵生產乙偶姻的報道。四甲基吡嗪，是吡嗪環碳原子上均連接甲基的含氮雜環化合物。四甲基吡嗪具有烘烤、花生、榛子、可可香氣，被廣泛用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、卷煙等香精的調配；同時，四甲基吡嗪作為中藥材川芎根莖的主要活性生物堿成分，具有擴張血管、改善微循環及抑制血小板集聚等藥理作用，現已廣泛應用于心腦血管疾病、呼吸系統疾病、腎小球疾病等的治療。四甲基吡嗪的生產方法可分為生物合成轉化法、直接從植物中提取法和化學合成法三種。其中，直接萃取法存在原料供應問題，化學法存在較嚴峻的環保問題，反應條件一般較劇烈，對設備要求較高，且產品不屬于‘天然’或‘生物合成’范疇。隨著人們對綠色產品需求的日益提高，利用生物工程的手段生產四甲基吡嗪具有產品綠色天然、成本低、反應條件溫和、環境污染小等優點而廣受消費者關注。目前有報道采用大豆來固態發酵生產四甲基吡嗪的方法，但是該法不但所用原料為糧食性作物，而且具有較高的原料成本；并且該法中需要添加大量的前體乙偶姻，由于乙偶姻屬于較為昂貴的生物香料，因此通過添加外源前體乙偶姻的方法經濟價值較低，難以實現工業化生產水平。2011年中國白酒產量1055萬噸，產生酒糟四千多萬噸。酒糟中含有大量的淀粉(10%)，粗蛋白(7%-10%)和微生物，氨基酸，有機酸，離子等營養成分。當前酒糟的處理方式是直接用來做飼料，但是該應用的附加值極低，其中大部分的營養成分均未有效開發與利用。因此，有效開發利用酒糟，生產高附加值物質，不僅能減少酒糟對環境的污染，還能帶來巨大的經濟效益。目前報道的利用酒糟的技術主要有烘干去稻殼直接生產飼料；經微生物發酵生產菌體蛋白飼料；進行固態發酵，生產酶類飼料添加劑；厭氧發酵生產沼氣；也有利用酒糟的水解液發酵生產丁二酸的報道，但這屬于液態發酵，且需要對酒糟進行水解，該過程不但復雜，而且液態發酵也存在廢水污染等問題等。而對于利用酒糟為原料直接固態發酵生產生物香料入乙偶姻和四甲基吡嗪的報道目前沒有報道。由于四甲基吡嗪可由前體物乙偶姻和銨鹽反應生成，因此可通過在發酵產物中是否添加銨鹽來有選擇的控制生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的生產，具有重要的應用價值。
發明內容
I)要解決的技術問題
本發明要解決的一個技術問題是提供了一種以酒糟為原料生產生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法；本發明提供的另一個技術問題是提供了一種通過是否添加銨鹽來有選擇的生產乙偶姻或四甲基吡嗪的方法。(2)本發明的技術方案 乙偶姻的發酵生產
培養基的制作新鮮酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液調節酸度為O 5，補充葡萄糖O 100g/kg酒糟。菌株種子培養物枯草芽孢桿菌UaciBw1S subtilis、Q￡K￡ NO M208157和地衣芽孢桿菌licheniformis ) CGMCC 3961，CGMCC 3962，CGMCC 3963 中任一株，以液體或固體麩皮培養基，挑取一環菌株接種，37°C培養16 48h。所述枯草芽抱桿菌{Bacillus subtil is、CCTCC NO M 208157已在申請號200810235366. 1，申請日2008年12月8日，發明名稱“一株高產四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌及其發酵生產四甲基吡嗪的方法”中公開。所述地衣芽孢桿菌UaciBw1S licheniformis) CGMCC 3961，CGMCC 3962，CGMCC3963已在申請號201010238685. 5，申請日2010年7月28日，發明名稱“一種生產四甲基吡嗪的方法及其生產菌株”中公開。液體種子培養基以白酒釀造所用的原料為培養基成分，原料選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取液體種子培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調節糖度為1(Γ 5°Βχ，調節pH為4 6。固體種子培養基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取固體種子培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : 0.5 2 (w/v)的比例混合后,80 10CTC 蒸煮 30min。乙偶姻的固體酒糟發酵條件液體種子培養基按2% 10%(v/w)接種,或固體種子培養基按2% 10% (w/w)接種，37°C培養I 3d，即可大量發酵產生乙偶姻。四甲基吡嗪的發酵生產培養基的制作新鮮酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液調節酸度為O 5，補充葡萄糖O 100g/kg酒糟菌株種子培養物枯草芽孢桿菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液體或固體麩皮培養基，挑取一環菌株接種，37°C培養16 48h。液體種子培養基以白酒釀造所用的原料為培養基成分，原料選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取液體種子培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調節糖度為1(Γ 5°Βχ，調節pH為4 6。固體種子培養基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取固體種子培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : 0.5 2 (w/v)的比例混合后,80 10CTC 蒸煮 30min。四甲基吡嗪的固體酒糟發酵轉化條件液體種子培養基按2% 10%(v/w)，或固態種子培養基2% 10% (w/w)接種，接種后，37°C培養I 3d后；補加銨鹽10 30g/kg酒糟，包括磷酸氫二銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨中的一種，四甲基吡嗪轉化生產條件為30 90°C反應I 3d。上述所述的酒糟為釀造廢棄的黃酒酒糟或白酒酒糟。酒糟發酵產生的乙偶姻的提取方法
固態發酵培養物按照I : I 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經減壓蒸餾，控制溫度為50-80°C，除去不揮發性雜質；收集餾分經50 80°C二次減壓蒸餾除去水分，得到液態乙偶姻產物。酒糟發酵轉化產生的四甲基吡嗪的提取方法
固態發酵培養物，按照I : I 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經減壓蒸餾，控制溫度為50-80°C，除去不揮發性雜質；收集餾分經低溫冷卻，產物析出，得到四甲基吡嗪濕晶體，在冷凍干燥得到粉末狀四甲基吡嗪結晶。(3)本發明的有益效果
本發明以酒糟為原料發酵生產生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪，具有以下的特點和優點(I)可通過是否添加銨鹽來有選擇的控制生產乙偶姻或四甲基吡嗪，在生物香料的生產方面具有重要的實際應用價值；(2)發酵培養基中除了添加葡萄糖外，不需要額外添加其它營養成分，能夠盡可能充分的有效利用酒糟中的營養成分，對于資源的有效回收利用具有重要的價值；(3)利用酒糟發酵生產乙偶姻或四甲基吡嗪，能夠有效提高酒糟的附加值；(4)利用酒糟固態發酵生產乙偶姻或四甲基吡嗪，相對于液態發酵酒糟具有節省能源、減少廢水污染的實用價值。本發明生產的乙偶姻濃度能夠達到13.42g/kg酒糟；生產四甲基吡嗪的濃度能夠達到3. 02 g/kg酒糟。
圖I.枯草芽孢桿菌CCTCC NO :M208157利用白酒糟發酵生產乙偶姻轉化生產四甲基吡嗪的時間曲線圖。圖2.地衣芽孢桿菌CGMCC 3961利用白酒糟發酵生產并提純的產物乙偶姻和四甲基吡嗪的氣相色譜圖。圖3.乙偶姻的離子碎片圖。圖4.四甲基吡嗪的離子碎片圖。
具體實施例方式實施例I.黃酒糟發酵生產乙偶姻
培養基的制作新鮮酒糟加入NaOH溶液調節酸度為O 5，補充葡萄糖O 100g/kg。 菌株種子培養物枯草芽孢桿菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液體或固體麩皮培養基，挑取一環菌株接種，37°C培養16 48h。液體種子培養基以白酒釀造所用的原料為培養基成分，選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制取原料液體培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調節糖度為1(Γ 5°Βχ，調節pH為4 6。固體種子培養基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : O. 5 2 (w/v)的比例混合后，80 100°C蒸煮30mino乙偶姻的固體酒糟發酵條件液體種子培養基按2% 10%(v/w)，或固態種子培養基2% 10% (w/w)接種，接種后，37°C培養I 3d，即可發酵產生乙偶姻13. 42g/kg。實施例2白酒糟發酵轉化生產四甲基吡嗪
培養基的制作新鮮酒糟加入NaOH調節酸度為O 5，補充葡萄糖O 100g/kg。菌株種子培養物枯草芽孢桿菌(CCTCC NO M208157)和地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株，以液體或固體麩皮培養基，挑取一環菌株接種，37°C培養16 48h。液體種子培養基以白酒釀造所用的原料為培養基成分，選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制取原料液體培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : I 4 (w/v)的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調節糖度為1(Γ 5°Βχ，調節pH為4 6。固體種子培養基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水按I : 0. 5 2 (w/v)的比例混合后，80 100°C蒸煮30mino四甲基吡嗪的固體酒糟發酵轉化條件液體種子培養基按2% 10%(v/w)，或固態種子培養基2% 10% (w/w)接種，接種后，37°C培養I 3d后，補加銨鹽20g/kg酒糟，包括磷酸氫二銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨中任一種，四甲基吡嗪轉化生產條件為55°C反應I 3d，生成四甲基吡嗪3. 02g/kg酒糟。
實施例3白酒糟發酵生產乙偶姻的提取 Ikg固態發酵培養物，按照I: I 2 (w/v)加入蒸餾水，置于60°C水浴中超聲lh，浸出液SOOOrpm離心lOmin，所得上清液經70°C減壓蒸餾除去不揮發性雜質；收集餾分經80°C二次減壓蒸餾除去水分，得到液態乙偶姻產物9. 6mL。實施例4四甲基吡嗪提取方式
Ikg固態發酵培養物，按照1:1 2 (w/v)加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液SOOOrpm離心lOmin，所得上清液經80°C減壓蒸餾除去不揮發性雜質；收集餾分經4°C低溫冷卻，產物析出，得到四甲基吡嗪濕晶體，8000rpm，4°C離心lOmin，收集固體在冷凍干燥得到粉末狀四甲基吡嗪結晶2. Og。
權利要求
1.一種以酒糟為原料有選擇的控制發酵生產乙偶姻或轉化生產四甲基吡嗪的方法，其特征在于新鮮酒糟加入O. 1-lmol/L NaOH溶液調節酸度為O 5，補充葡萄糖O 100g/kg酒糟，加入菌株種子培養物發酵生產乙偶姻；在發酵產物中另外補充銨鹽10 30g/kg酒糟，轉化反應生產四甲基吡嗪； 所述的菌株種子培養物為枯草芽孢桿菌subtil is) CCTCC NO :M208157、地衣芽抱桿 1MiBacillus licheniformis') CGMCC 3961,地衣芽抱桿舊 QBacilluslicheniformis) CGMCC 3962,地衣芽抱桿菌 CfeciBw1S Iicheniformis) CGMCC 3963 中任一株，以液體或固體麩皮培養基，挑取一環菌株接種，37°C培養16 48h ； 液體種子培養基以白酒釀造所用的原料為培養基成分，原料選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取液體種子培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水w/v按I : I 4的比例混合后,蒸煮l-5h,冷卻后加入糖化酶10 50單位/g原料,于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，調節糖度為1(Γ 5°Βχ，調節pH為4 6 ; 固體種子培養基選用高粱、大麥、小麥、豌豆及其各種不同比例的混合配方制取固體種子培養基，制作方式為原料樣品經粉碎后，與水w/v按I : O. 5 2的比例混合后，80 10CTC 蒸煮 30min ； 乙偶姻發酵生產條件為液體種子培養基按2% 10% v/w接種，或固體種子培養基按2% 10% w/w接種，37 °C培養I 3d ; 轉化反應生產四甲基吡嗪的條件為30 90°C反應I 3d ; 所述補充銨鹽包括磷酸氫二銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨中的一種。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所用酒糟為釀造廢棄的黃酒酒糟或白酒酒糟。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于發酵生產的乙偶姻的提取方法為，固態發酵培養物，按照I : I 2 w/v加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經減壓蒸餾，控制溫度為50 80°C，除去不揮發性雜質；收集餾分經50 80°C二次減壓蒸餾除去水分，得到液態乙偶姻產物。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于轉化生產的四甲基吡嗪的提取方法為，固態發酵培養物，按照I : I 2 w/v加入水或乙醇，再于60°C水浴中超聲保持lh，浸出液離心或過濾，所得上清液經減壓蒸餾，控制溫度為50 90°C，除去不揮發性雜質；收集餾分經低溫冷卻，產物析出，得到四甲基吡嗪濕晶體，經冷凍干燥得到粉末狀四甲基吡嗪結晶。
全文摘要
本發明公開了以酒糟為原料，利用微生物發酵生產生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法，屬于生物工程技術領域。本發明在經酸度調節的新鮮酒糟中補充適量葡萄糖0～100g/kg，加入枯草芽孢桿菌(CCTCCNOM208157)或地衣芽孢桿菌(CGMCC3961，3962，3963)中任一株培養的種子培養物后37℃發酵1～3天，能夠大量產生生物香料乙偶姻。在此基礎上，還可通過向上述發酵產物中添加銨鹽來轉化生產另一種生物香料四甲基吡嗪。本發明突出的優點是利用酒糟為原料，通過是否添加銨鹽來有選擇的控制生產生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪的方法，既可有選擇的獲得不同高附加值的生物香料，又防止了酒糟污染環境，提升了酒糟的利用價值。
文檔編號C12P17/12GK102618587SQ20121008961
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者吳群, 徐巖 申請人:江南大學