一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法

專利名稱：一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法。
背景技術：
志賀氏菌(Shigella spp.)俗稱痢疾桿菌，作為ー種具有高度傳染性革蘭氏陰性腸道致病菌，主要通過侵入人結腸上皮細胞最終定位于大腸，而引起典型細菌性痢疾(發熱、腹痛、里急后重、大便膿血)，而毒カ大質粒則是其致病性的最主要的因素，包含有大概32個與毒力有關的基因，主要包括與III型分泌系統有關的mxi-spa基因，與細菌侵入上皮細胞密切相關的ipaB⑶，以及ipgC等毒力基因。志賀氏菌感染劑量極低(10-100個細菌)，2010年我國衛生部公布的全年法定 50-70%，次于病毒性肝炎，肺結核和梅毒。目前治療痢疾的主要方式是抗生素，但不同菌群及血清型之間雖然無交叉免疫，但存在交叉抗藥性，加上臨床分離多重耐藥菌株的不斷增カロ，常規的抗生素治療遇到了巨大的挑戰；由于急性期治療不及時、對耐藥菌株用藥不當、治療不徹底等原因可導致急性菌痢轉變成慢性菌痢，故對細菌性痢疾的治療方式受到越來越嚴峻的挑戰。因此，開發針對細菌的多糖疫苗重新引起了人們的研究興趣。在疫苗生產中，通常是使用的減毒(或無毒)病原菌(病毒)，所以需獲得無毒菌株，而志賀氏菌的毒力大質粒是其致病性的主要因素。

發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種重組菌A。本發明提供的重組菌A，為去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因得到的重組菌。上述福氏2a志賀氏菌為福氏2a志賀氏菌301，上述毒カ大質粒為pCP301。本發明的另ー個目的是提供一種制備上述重組菌A的方法，包括如下步驟去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因，得到重組菌A。上述方法中，所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因為依次去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因。上述方法中，所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟
I)將與所述毒カ大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌I (通過抗生素抗性篩選)；2)去除所述中間重組菌I中的所述與毒カ大質粒不相容的質粒，得到去除毒カ大質粒的重組菌B ；
所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因的方法包括如下步驟3)將抗性篩選標記物基因替換掉所述重組菌B基因組中的O-抗原連接酶基因，得到去除O-抗原連接酶基因的中間重組菌2 ；4)去除所述中間重組菌2中的所述 抗性篩選標記物基因，得到所述重組菌A。上述方法中，步驟2)包括如下步驟在40°C _42°C培養所述中間重組菌1，以去除其中的毒カ大質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B;所述培養為至少培養3代，所述毒カ大質粒為PCP301 ；步驟3)包括如下步驟先將含有編碼λ -Red重組系統所需酶的質粒導入所述重組菌B，得到中間重組菌3，再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中，得到中間重組菌4 (通過抗生素抗性篩選);再將所述中間重組菌4在40°C -42°C培養，得到中間重組菌2，所述培養為傳代至少2次，毎次至少13小時；步驟4)包括如下步驟先將編碼FLP重組酶的質粒導入中間重組菌2中，得到中間重組菌5，再將所述中間重組菌5在40°C _42°C培養，得到所述重組菌A，其中，所述培養為連續培養2代，培養時間為至少12小吋。上述福氏2a志賀氏菌為福氏2a志賀氏菌301，上述毒カ大質粒為pCP301。上述方法中，步驟I)中，所述與毒力大質粒不相容的質粒為pKDinc ;步驟3)中，所述抗性篩選標記物基因為卡那霉素基因；所述含有編碼λ -Red重組系統所需酶的質粒為質粒pKOBEG ；所述含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列I ;步驟4)中，所述編碼FLP重組酶的質粒為質粒pCP20。上述方法中，步驟3)中，在所述再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中的步驟前還包括將所述中間重組菌3經L-阿拉伯糖誘導培養的步驟。本發明的第三個目的是提供一種制備重組菌B的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟去除福氏2a志賀氏菌中的毒カ大質粒，得到重組菌B。上述方法中，所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟I)將與所述毒カ大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌I (通過抗生素抗性篩選)，2)去除所述中間重組菌I中的所述與毒カ大質粒不相容的質粒，得到去除毒カ大質粒的重組菌B ；步驟2)具體包括如下步驟在40°C _42°C培養所述中間重組菌1，得到去除毒力大質粒的重組菌B ;所述與毒力大質粒不相容的質粒具體為pKDinc。上述福氏2a志賀氏菌為福氏2a志賀氏菌301，上述毒カ大質粒為pCP301。由上述的方法制備得到的重組菌B也是本發明保護的范圍；或ー種DNA分子也是本發明保護的范圍，該DNA分子為如下(I)或⑵或(3):(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的DNA分子。本發明的實驗證明，本發明首先依據質粒不相容原理首先將野生福氏2a志賀菌301株的毒カ大質粒驅除，構建得到了毒力大質粒無痕缺失突變株301 Δ pCP，即ー株無毒福氏志賀氏菌，然后利用基于λ噬菌體Red重組酶作用的同源重組技術，其原理是將一段與靶基因兩翼400-600bp同源線性序列導入宿主菌細胞；在λ噬菌體Red重組酶的作用下，線性DNA片段兩側的同源臂與染色體(或載體)的靶序列發生同源重組，靶基因被標記基因置換下來；隨后抗性基因通過轉座酶的作用從宿主菌種脫落，從而得到無毒志賀氏菌的waal缺失株。



圖I為毒カ大質粒無痕缺失突變株(301 Δ pCP)的PCR驗證圖2為突變體檢測引物位置示意3為同源重組原理敲除基因示意4為301 ApCPAraaI基因缺失突變株PCR驗證圖5為301 ApCPAwaaI和野生型301的銀染圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌一、缺失O-抗原連接酶(waal)基因的無毒福氏志賀氏菌2a 301的制備I、福氏志賀氏菌2a 301毒力大質粒缺失株301 ApCP的構建A、制備了福氏志賀氏菌2a 301野生株感受態I)將福氏志賀氏菌301野生株(即為福氏2a志賀氏菌301 (Shigellailexneri2a)j01, benome sequence of bnigella rlexneri 2a insights intopathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coll K12and 0157，Nucl. Acids Res 2002,30(20) :4432_4441，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，毒カ大質粒為PCP301)接于LB液體培養基中，30°C過夜培養后，按I 100轉接至IJ IOOmL低鹽LB液體培養基中，放于30°C培養至OD600達到O. 6。2)離心收集菌體，用高壓滅菌過的10%甘油洗滌四次，最后用400uL的10%的滅菌甘油重懸細菌，即可獲得電擊轉化用感受態細胞，分裝待用。B、毒力大質粒的缺失inc是志賀氏菌毒力大質粒pCP上與其復制相關的一段序列片段，將實驗室構建的帶有 inc 片段的 pKDinc 重組質粒(Global Analysis of a Plasmid-Curred Shigellailexneri Strain New Instghts into the Interaction between the Chromosome and aVirulence Plasmid，Journal of Proteome Research，2010，9 (2) :843-854.溫敏型質粒，抗性為氨芐青霉素，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得)電轉導入志賀氏菌301野生株(以下簡稱為301)中，得到中間重組菌。將中間重組菌在氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中連續傳代3次以上，以保證毒カ大質粒的丟失，之后將培養的菌液涂布在氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上，待長出單菌落之后通過毒カ基因ipaA、ipgB、mxiD、virG的PCR檢驗毒力大質粒是否丟失，PCR結果中四個毒カ基因都沒有擴增產物說明毒力大質粒成功丟失，因此該重組菌利用質粒不相容原理將毒カ大質粒驅除而只保留有pKDinc質粒，命名為301 ApCP/pKDinc。再利用pKDinc質粒的溫度敏感特性，將301 ΔpCP/pKDinc在無抗的液體LB培養基中42°C連續培養2代，再在無抗LB固體培養基上可以生長，但在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上不長的菌株即為目的菌株301 ApCP (去除毒力大質粒pCP301的福氏2a志賀氏菌)。將上述目的菌株301 Δ pCP進行PCR檢測毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG和inc, 其中，ipaA 的引物為ipaApl AAGATTCTGCCTTTGGACC ；ipaAp2 GTGGTTGAAGAGTTCTGTATG ；ipgB 的弓I 物為ipgBlU :TGCTTTGACGGTATACAGC ; ipgBIL :ACTTCCACAGGTTGAATTCG ；mxiD 的弓 I 物為mxiDU : A A G C A GG T T T C T T C T A T T G G ；mxiDL GAACACATTACCGATTACAGG ；virG 的引物為VirGpl CATCAATCCGTTACTCACT ；VirGp2 ACTACCAGCAACAATACG ；inc 的引物為incF TGCGAGAGAGAGGGGATAAC ；incR CGCCTTTTCCATCAGTTTC ；以福氏志賀氏菌301野生株(301)為對照。結果如圖I所示，圖I左圖為ipaA、ipgB、mxiD、virG的PCR檢測結果，右圖為inc的PCR檢測結果，可以看出，301擴增得到888bp的ipaA(genbank號為AF386526的第 107794-108682 位核苷酸)、595bp ipgB (genbank 號為 AF386526 的第 113531-114126位核苷酸)、986bp mxiD (genbank 號為 AF386526 的第 124460-125446 位核苷酸)、777bpvirG (genbank 號為 AF386526 的第 151011-151788 位核昔酸)、488bp inc (genbank 號為AF386526的第209074-209561位核苷酸)，而301 Λ pCP中均無這些片段，ipaA、ipgB、mxiDD、virG這些片段為毒カ大質粒上的片段，inc為pKDinc質粒的片段。以上結果說明構建得到的目的菌株301 ApCP其毒力PCR結果為陰性，說明該菌株已經丟失了毒カ大質粒，同時目的菌株inc的PCR結果也為陰性，證明該菌株也缺失了pKDinc質粒，這就說明301毒力大質粒缺失株301 ApCP構建成功。2、線性打靶DNA片段的制備I)、PCR引物的設計本研究所用的引物是依據NCBI上福氏2a志賀氏菌301株全基因組序列(NC-004337)中所列 waal 基因(genbank 號為 AE005674 的第 3769440-3770648 位)及其上、下游序列，采用Primerf. O軟件完成(詳見表I)。在waal基因的上游(N端)和下游(C端)各設ii^一對引物，即waalu5/waalu3和waald5/waald3。為了方便操作，限制性酶切位點BamH I和Sal I將被添加到上游同源臂up的引物末端，限制性酶切位點HIndIII和XhoI被添加到下游同源臂down的引物末端。同時，為了驗證突變體是否夠構建成功，設計了基因組上waal基因上下游同源臂以外的一對引物(waalw5/waalw3),內部檢測引物(waaln5/waaln3)，kan 基因引物(KanP5/KanP3)及 kan 基因內部引物(Kanf5/Kanf3)，進行 PCR 驗證，同時進行測序驗證，如圖2所示。表I為引物列表
Primers Primer sequences( 5， —3， ) Length/bp Introduction
waalu5CGGGATCCGGGTATGGGAAGAATCAAG628擴增 up 片段
waalu3GCGTCGACTCAGAMTGCTACGGTGT
waald5CCAAGCTTTGGACCTTTAGACAATCM680擴增 down 片段
waal d3CCCTCGAGATGTTAGGMGCATACCG
waaln5TGGGTGGGATTACMGGT562突變株的鑒定
waaln3CCAATGACTMCACGGAM
waalw5CTACAGATGCTGGCGAATA1777突變株的鑒定
waalw3TCACTACAGTTGGGATGG
Kan5AGCCGATTGTCTGTTGTGCC1600突變株的鑒定
Kan3TTGTCACTGAAGCGGGAAGG
KanP5 GCGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 突變株的鑒定KanP3 _ CCAAGCTTATGGGAATTAGCCATGGTCC _2)、線性打靶的構建(I)以福氏2a志賀氏菌301為模板，用waalu5/waalu3和waald5/waald3分別擴增出waal的上下游同源臂up和down。PCR條件如下94°C IOmin, 94°C 30s, 56°C 30s,72°C lmin，30 個循環，72°C lOmin，體系為 100 μ し結果分別得到長約500bp的waal的上游同源臂up片段和waal的下游同源臂down片段。用0. 6%瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠上切下目標條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，操作步驟按說明書進行。(2)分別將上游同源臂up片段和下游同源臂down回收，連入pMD18_T載體中，并送公司測序，up片段的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第7-634位核苷酸，down片段的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第2143-2822位核苷酸。(4)將上述up片段BamHI和SalI酶切后與經過同樣酶切的質粒pETKan (pETKan構建方法將卡那霉素抗性基因(序列I自5’末端第641-2136位核苷酸)插入pET_22b質粒(購自Novagen公司，產品目錄號69744)的SalI和HindIII位點間)連接，得到中間載體I ;再將down片段經過HindIII和XhoI酶切后與經過同樣酶切的中間載體I連接，得到中間載體2 ；(5)用BamHI和XhoI雙酶切中間載體2，用凝膠回收試劑盒回收2828bp目的打靶片段，獲得兩側為同源臂中間含kan基因的目的打靶DNA，經過測序，該目的打靶片段具有序列表中序列I所示的核苷酸，為含有所述卡那霉素抗性基因的片段。其中，序列表中序列I自5’末端第7-634位核苷酸為up片段，自5’末端第641-2136位核苷酸為kan基因，自5’末端第2143-2822位核苷酸為down片段。(6)以回收的目的打靶DNA片段為模板，以waalu5和waald3為引物，再次擴增打靶片段，用凝膠回收試劑盒回收目的片段，即可獲得濃度高達300ng/ μ L的線性打靶DNA片段。3、缺失O-抗原連接酶(waal)基因的無毒福氏志賀氏菌2a 301l)301ApCP/pK0BEG 感受態的制備(I)將由上述I得到的毒力大質粒無痕缺失突變株301 ApCP接于LB液體培養基中，30°C過夜培養后，按I : 100轉接到IOOmL低鹽LB液體培養基中，放于30°C培養至OD6tltl 達到O. 6。(2)離心收集菌體，用高壓滅菌過的10%甘油洗滌四次，最后用400uL的10%的滅菌甘油重懸細菌，即可獲得電擊轉化用感受態細胞，分裝待用。(3)由于 pKOBEG 質粒(A rapid method for efficient gene replacement inthe filamentous fungus Aspergillus nidulans [J]. 2000, 28 (22) ;e97溫敏型質粒，抗性為氯霉素自5’末端第641-2136位核苷酸，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得)含有編碼λ-Red重組系統所需各種酶，將pKOBEG質粒電擊轉化至毒力大質粒無痕缺失突變株301 ApCP感受態細胞中，涂于氯霉素抗性(pKOBEG質粒的抗性，氯霉素)的LB平板上，30°C培養過夜，得到的陽性克隆即為301 ApCP/pKOBEG菌株。2)線性打靶DNA片段的電擊轉化(I)將上述得到的301 ApCP/pKOBEG于30°C培養過夜，以I : 100傳代于低鹽LB液體培養基(LB培養基(500mL)配方5g蛋白胨，2. 5g酵母粉，2. 5g NaCl，pH7. 0)，繼續培養。(2)在OD6tltl值達到0. 6前Ih加入L-阿拉伯糖誘導Red重組系統的表達，其終濃度為lmmol/L，待0D_值為0. 6時，制備301 Δ pCP/pKOBEG感受態細胞，步驟同前所述。(3)取由上述2得到的300ng/ μ L的線性打靶DNA片段(序列I) 5 μ L，電擊轉化至分裝待用的301 Λ pCP/pKOBEG感受態細胞中。(4)快速加入提前預冷的ImL低鹽LB培養基，30°C復蘇2. 5h左右，然后涂布于卡那霉素抗性的LB平板，放于30°C培養箱培養過夜。(5)篩選出的陽性克隆即為帶有卡那霉素抗性的waal缺失突變株。(6)將陽性克隆接種于液體LB培養基(有卡那霉素抗性，濃度為50μ g/mL)中，42°C培養傳代兩次(每次培養12h時間)，即可除去pKOBEG質粒，最終獲得含卡那霉素抗性waal缺失突變株命名為301 Λ pCPAraaI ::kan，即為缺失O-抗原連接酶(waal)基因的無毒福氏志賀氏菌2a 301。利用λ _Red重組原通敲除基因原通及流程如圖(圖3)。ニ、脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌的制備(卡那霉素抗性基因的去除)I、將上述一得到的突變株301 ApCP AraaI: :kan在30°C培養至OD6tltl值達到0. 6，離心收集菌體，用高壓滅菌過的10%甘油洗滌四次，最后用400μ L的10%的滅菌甘油重懸細菌，獲得電擊轉化用感受態細胞。
2、將編碼FLP重組酶(位點特異性重組酶，識別位點為FRT)的質粒pCP20(One-step inactivation of chromosomal genes in Escnerichia coll K—12 usingPCR products [J]. Proc. natl. Acad. Sci. U. S. A, 2000,97 (12) :6640_6645，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，抗性為氯霉素)電擊轉入突變株感受態細胞中，在含氨芐青霉素及不含卡那霉素的LB平板上30°C培養，篩選ApYms的陽性克隆。3、篩選到的陽性克隆，轉入液體LB中42°C培養12小時，即可獲得不含卡那霉素和質粒pCP20的目的基因缺失突變株301 ApCPAraaI,即為脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏國。三、脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌的分子鑒定以301 ApCPAraaI的基因組作為模板，用ー對內部引物(waaln5/waaln3)(表1)，一對外部引物(waalw5/waalw3)(表I),一對交叉引物(waalw5和kanf3)(表I)和kan弓丨 物(表1，kan5/kan3)進行PCR驗證，以野生株301為模板。PCR條件如下(20 μ L體系) 反應條件根據各引物退火溫度不同而變，延伸時間因擴增產物的大小不同而變。結果如圖4所示，1,5 waal內部引物；2,6 :waal外部引物；3,7 :waalw5和kanf3 ；4,8 :Kan基因引物；突變株內部引物沒有條帶，并且成功敲除了靶基因，其外部引物擴增條帶比野生株小，因去除了目的基因和kan基因，交叉引物和kan引物也沒有擴增條帯。而野生株內部引物有擴增條帶，同樣交叉引物和kan引物沒有擴增條帶。上述結果證明得到waal基因缺失、毒カ大質粒缺失、無抗生素基因、福氏2a志賀氏菌突變株301 Δ PCP Δ waal。四、脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌的表型鑒定取ImL由上述得到的突變株301 ApCPAraaI的過夜培養物，離心收集菌體，用PBS洗一次，加入100 μ L裂解緩沖液(10% SDS 2mL，2-巰基こ醇0. 4mL，100 %甘油lmL，2M Tris-HCL ρΗ6· 85mL，10 % 溴酚藍 20 μ L，ddH20 I. 6mL)充分混勻，沸水煮 10 分鐘，カロ4 μ L20mg/mL的蛋白酶K，60°C反應I至2小時，取15yL上樣，進行SDS-PAGE，分離膠為15%，濃縮膠為4%，待溴酚藍出膠后30分鐘終止電泳。將上述的聚丙烯酰胺凝膠于固定液中放置過夜，加入增敏液作用30分鐘，用去離子水洗3次，每次15分鐘，加硝酸銀溶液作用20分鐘，用去離子水洗2次，毎次I分鐘，加顯影液進行顯色，最后終止反應，用去離子水洗。以野生株301為對照。結果如圖5所示，野生株301有ladder形式的條帶，而突變株因敲除了 0_抗原連接酶waal，其功能是將O-PS連接到類脂A-核心寡糖上形成LPS，所以沒有ladder形式的條帶。
權利要求
1.一種重組菌A，為去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因得到的重組菌。
2.一種制備權利要求I所述的重組菌A的方法，包括如下步驟去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因，得到重組菌A0
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因為依次去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于 所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟 1)將與所述毒力大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌I ; 2)去除所述中間重組菌I中的所述與毒力大質粒不相容的質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B ； 所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因的方法包括如下步驟 3)將抗性篩選標記物基因替換掉所述重組菌B基因組中的O-抗原連接酶基因，得到去除O-抗原連接酶基因的中間重組菌2 ； 4)去除所述中間重組菌2中的所述抗性篩選標記物基因，得到所述重組菌A。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法,其特征在于 步驟2)包括如下步驟在40°C _42°C培養所述中間重組菌1，以去除其中的毒力大質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B ; 步驟3)包括如下步驟先將含有編碼λ -Red重組系統所需酶的質粒導入所述重組菌B，得到中間重組菌3，再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中，得到中間重組菌4 ;再將所述中間重組菌4在40°C _42°C培養，得到中間重組菌2 ; 步驟4)包括如下步驟先將編碼FLP重組酶的質粒導入中間重組菌2中，得到中間重組菌5，再將所述中間重組菌5在40°C _42°C培養，得到所述重組菌A。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述與毒力大質粒不相容的質粒為pKDinc ； 步驟3)中，所述抗性篩選標記物基因為卡那霉素基因； 所述含有編碼λ -Red重組系統所需酶的質粒為質粒pKOBEG ； 所述含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 步驟4)中，所述編碼FLP重組酶的質粒為質粒pCP20。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于 步驟3)中，在所述再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中的步驟前還包括將所述中間重組菌3經L-阿拉伯糖誘導培養的步驟。
8.一種制備重組菌B的方法，包括如下步驟去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒，得到重組菌B。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟1)將與所述毒力大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌I, 2)去除所述中間重組菌I中的所述與毒力大質粒不相容的質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B ； 步驟2)具體包括如下步驟在40°C _42°C培養所述中間重組菌1，得到去除毒力大質粒的重組菌B ; 所述與毒力大質粒不相容的質粒具體為pKDinc。
10.由權利要求8或9所述的方法制備得到的重組菌B ； 或一種DNA分子，為如下(I)或⑵或(3): (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的DNA分子。
全文摘要
本發明公開了一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法。本發明提供重組菌A，為去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因得到的重組菌。本發明的實驗證明，本發明首先依據質粒不相容原理將野生福氏志賀菌2a 301株的毒力大質粒驅除，構建得到了毒力大質粒無痕缺失突變株301ΔpCP，即一株無毒福氏志賀氏菌，然后利用基于λ噬菌體Red重組酶作用的同源重組技術，靶基因被抗性基因置換下來；隨后抗性基因通過轉座酶的作用從宿主菌種脫落，從而得到無毒志賀氏菌的waaI缺失株。
文檔編號C12N1/20GK102851226SQ20121008913
公開日2013年1月2日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者王恒樑, 朱力, 宋麗, 馮爾玲, 劉先凱 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所