專利名稱：一種長白山牛皮杜鵑基因組dna提取的方法
技術領域：
本發明涉及一種高山植物基因組DNA提取的方法，屬于基因工程技術領域，具體的說涉及一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法。
背景技術：
由于高山植物環境條件惡劣，所以高山植物通常被認為是陸地上最為極端的生物，但是高山植物卻也擁有豐富極具價值的基因資源。自1896年以來，作為生物進化研究中的熱點和難點，高山和極地植物對生境的適應機制和策略一直倍受研究者們的關注。高山植物基因組DNA的提取技術是進行植物分子生物學研究的基本技術之一，DNA產率的高低，質量的好壞直接影響到后續實驗的成敗。探討高山植物基因組DNA的提取方法是一項非常有意義的工作，為確保在農作物環境脅迫抗性育種方面提供優異種質和選擇指標、為農業基礎研究與基因工程提供相關基因。將這種特殊的基因資源應用在觀賞陸地植物，將保護與合理利用有效結合，走人與自然和諧發展的可持續性發展道路，這不僅有利于該區域植被的生長發育、生態系統的穩定，更有利于地區經濟的發展。高山植物的基因組提取方法有多種，近年來，人們一直致力于研究一種高效快速的提取方法，但是由于物種的特異性，高山植物的基因組提取起來并不是那么方便，。高山植物生存的環境溫度低，輻射強，在這樣的環境中，植物生長極其緩慢，產物消耗減少，為提高其抵御寒冷和生理干旱方面，使部分糖分和脂類物質積累并儲存于葉片組織細胞中，使得高山植物基因組DNA的提取難度加大。王卓偉，等在對桑葉DNA提取方法研究過程中發現PVP還能有效地去除多糖。羅志勇等在研究中對這種方法進行了幾點改進:①提高CTAB的濃度；②對于含多酚類較多的植物，增加CTAB提取緩沖液中β_巰基乙醇的含量，同時加入PVP使其與多酚類物質結合形成復合物；③增加低鹽沉淀緩沖液的量；④增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA;Porebski,等在沉淀粗提DNA時，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5 mol.Γ1以使DNA在高鹽緩沖條件下優先沉淀，`可更有效地除去多糖。余志雄對火龍果總DNA提取方法比較研究驗證了 CTAB法對火龍果基因組提取是有效，而且應雄美對兩種不同甘蔗基因組DNA提取方法的比較，同時證明了 SDS和CTAB法都能提取到基因組DNA并且對兩種方法進行了改進。長白山杜鵑是一種有代表性高山植物，在海拔1700 m-2500 m海拔帶均有分布，其生理生化指標較為特殊，關于本研究中提到的長白山杜ill基因組提取的方案也有多種，但是不同方法對不同植物的基因組提取效果大不相同。對于杜鵑的基因組DNA提取方面的研究還是很少的。趙喜華，等以杜鵑屬常綠杜鵑亞屬井岡山杜鵑樹葉為材料分別采用CTAB法、堿裂解法、SDS法提取杜鵑基因組DNA，三種方法所提取的DNA純度及產率有差別，其中CTAB法較好。莊得鳳，曹后男，采用CTAB法(①取0.2 g左右研磨好的新鮮葉片置于1.5mL 離心管中，加 800 ul 經 65°C預熱的 CTAB ( 2% CTAB; 100 mmol.Γ 1 Tris -HCl，pH8.0 ；20 mmol.17 1 EDTA ；1.4 mol.17 1 NaCl ；2% PVP )提取緩沖液，研磨前加入 2%β-巰基乙醇；充分混勻后，在水浴鍋中65°C溫浴Ih ;等)提取幾個品種長白山杜鵑的基因組DNA，所得的DNA純度高、質量好，但是牛皮杜鵑及孢葉杜鵑基因組未能提取出來。本實驗用SDS法提取植物基因組(魏群.分子生物學實驗指導[M].北京:高等教育出版社，2007.)的方法:“取0.2g新鮮植物葉片，在液氮中研磨成粉末狀；轉移至2 mL離心管中，加入 800 ul 細胞提取液(pH 8.0,100 mmol.I/1 Tris.HCl, 5 mmol.L-1 EDTA, 500mmol.Γ1 NaCl,1.25% SDS, 100 ul β-巰基乙醇)，充分混勻；65°C水浴保溫20分鐘；從水浴中取出離心管，加入250 ul 5 mol -T1 KCl溶液，混勻，冰浴20分鐘；等”來提取長白山杜鵑的基因組，未能成功提取出其基因組DNA。
發明內容
針對上述不足，本發明的目的在于克服現有技術對長白山杜鵑基因組DNA提取方法中，基因組提取困難、純度低、易降解的不足，提供一種新的長白山杜鵑基因組DNA提取的方法，從而獲得純度高、穩定性強的長白山杜鵑基因組DNA。本發明是按以下技術方案實現的:該方法采用CTAB法與SDS法相結合，即首先采用CTAB法提取牛皮杜鵑基因組，然后再采用SDS法純化所提取的牛皮杜鵑基因組DNA。該方法的具體步驟如下:
(I )、CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA:
向提取容器內加入CTAB提取緩沖液，預熱至65 V ;將牛皮杜鵑新鮮葉片在研磨前加入B-巰基乙醇，加入量為CTAB提取緩沖液體積的4.3%V/V，經液氮研磨成凍粉狀后迅速加入到上述預熱的CTAB提取緩沖液中，充分混勻；于65 °C溫浴4小時；然后按常規方法提取出基因組DNA ；
(2)、結合SDS法純化所提取的基因組DNA:
向上述CTAB法提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積(SDS體積:基因組DNA溶液體積=1:10) 2%的SDS，冰浴10分鐘；加入1/10體積5 mol.I/1 KAc，冰浴30分鐘；18 1:下12，000 rpm離心10分鐘，取上清液；加入1/20體積2%的SDS，冰浴10分鐘；加入1/20體積5 mol.Γ1 KAc，冰浴30分鐘；離心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗滌沉淀，溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。所述的CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA的具體步驟如下:
取2.0 ml離心管，加入700 ul的CTAB提取緩沖液，65 °C預熱；取新鮮幼嫩牛皮杜鵑材料0.3 g，研磨前加入30 ul β_巰基乙醇，液氮中研磨成凍粉末狀并迅速將該凍粉轉入上述離心管中，充分混勻；水浴中65 °C溫浴4小時；然后按常規方法提取出牛皮杜鵑基因組DNA粗品；
所述的結合SDS法純化所提取的基因組的具體步驟如下:
向上述CTAB法提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積2% 的SDS，冰浴10分鐘；加入1/10體積5 mol.Γ1 KAc，冰浴30分鐘；18 1:下12，000 rpm離心10分鐘，取上清液；加入1/20體積2%的SDS，冰浴10分鐘；加入1/20體積5 mol噸―1 KAcJjC浴30分鐘；離心，取上清 液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗滌沉淀，溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。以上牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法中，所述的CTAB提取緩沖液是由:2% CTAB,100 mmol.L-1 Tris-HCl pH 8.0, 20mmol.L-1 EDTA,1.4 mol.L-1 NaCl，4% PVP 組成；所述的酚氯仿是苯酚與氯仿按1:1體積比配制而成。本發明具有以下有益的效果:1、本發明的牛皮杜鵑基因組提取方法中，首次采取了 CTAB法與SDS法結合，即CTAB法提取基因組之后，結合SDS法純化所提取的基因組。2、本發明的方法對現有的CTAB法和SDS法進行了有創造性的改進，具有突出的實質性特點和顯著的進步，具體體現在:
步驟(I) CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA過程中:較常規的CTAB法比:CTAB提取緩沖液中的PVP用量增加了 2%，即由2%增加至4% ;研磨前β-巰基乙醇用量較常規的CTAB法，增加了約I倍，即由2%增加至4.3% ;溫育時間由常規的CTAB法I小時延長至4小時。步驟(2)結合SDS法純化所提取的基因組過程中:SDS加量分別為0.2%(1/10體積2%的SDS)與0.1% (1/20體積2%的SDS)，且是在基因組提取出來之后單獨加入的，而常規的SDS法中，SDS的加量為1.25%，且是在基因組提取出來之前混合在細胞提取液中加入的；純化步驟還分別用0.5 mol.1/1與0.25 mol Γ1的KAc代替了常規SDS法中的1.56mol.L 1 的 KCl。由于CTAB法與SDS法的結合與改進并用，克服了高山植物基因組與其它多糖、多酚類等次生代謝物難分離的困難。提取得到了用常規方法不易提取的牛皮杜鵑基因組DNA。3、本發明的方法與其他植物基因組提取的方法相比，經檢測，本發明獲得的牛皮杜鵑基因組DNA，不僅提取效率高，而且基因組DNA的純度高，不容易降解，為后續分子生物學的研究奠定了堅實基礎，且操作簡單可行，實用性強。
圖1是海拔2000 m左右的長白山牛皮杜鵑實物照片圖。圖2是長白山極地杜鵑基因組DNA電泳檢測結果圖，其中1-為試劑盒快速提取的長白山杜鵑基因組DNA，2-為SDS法提取的長白山杜鵑基因組DNA，3，4-均為CTAB-SDS法提取的長白山牛皮杜鵑基因組DNA。
具體實施例方式下面結合實施案例對本發明作進一步說明:
一、CTAB-SDS法提取長白山杜鵑基因組DNA
(一)、改進CTAB法提取植物基因組DNA1、取0.4 g左右的長白山牛皮杜鵑新鮮葉片，液氮研磨成粉末狀，置于2 ml離心管中，管中預先加入700 ul經65 °C預熱的CTAB提取緩沖液(2% CTAB, 100 mmol.Γ1Tris-HCl pH 8.0，20mmol.171 EDTA ；1.4 mol.171 NaCl，4% PVP)，研磨前加入30 ul β-巰基乙醇。2、迅速充分混勻后，在水浴鍋中65 °C溫浴4小時，每隔30分鐘輕輕搖勻。3、加等體積(730 ul)的酚:氯仿(I:1)混合液，顛倒混勻混合物，18 0C下12000rpm離心10分鐘；重復一次。4、取上清液，加3倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，-20°C醇沉1-2小時。
5、18°C下12000 rpm離心30分鐘，棄上清液。6、加入I ml 70%乙醇，清洗沉淀，18°C下12000 rpm離心6分鐘；重復2次。7、棄上清，風干沉淀。8、加入適量103 ul (ddH20:胰RNA酶預混液)(100 ul:3 ul)溶解沉淀，37 0C水浴I小時。9、加入等體積的酚:氯仿(1:1)混合液，顛倒混勻混合物，18 0C下12000 rpm離心10分鐘。10、取上清液，加1/10體積3 mol.I/1 NaAc (pH 5.2)，3倍體積的無水乙醇，-200C靜置1-2小時。11、18 0C下12000 rpm離心30分鐘,棄上清液。12、加入I ml 70%乙醇，清洗沉淀，12000 rpm 18 °C離心6分鐘；重復2次。13、棄上清，風干沉淀。 14、加入適量(30-80 ul) (ddH20:胰RNA酶預混液)溶解沉淀。(二)、結合SDS法純化植物基因組DNA
15、在上述所提基因組DNA溶液中加入1/10體積2% SDS，冰浴10分鐘。16、加入 I /10 體積 KAc (5mo I /L )，冰浴 30 分鐘。17、18 0C下12000 rpm離心10分鐘，取上清液。18、重復上述步驟15 —18，但1/10改為1/20。19、加入1/10體積3 mol.L^1NaAc,再加入3倍體積無水乙醇,-20 0C醇沉2小時，有白色絮狀沉淀出現時取出。20,18 0C 下 12000 rpm 離心 30 分鐘，棄上清。21、加入I ml 70%乙醇，清洗沉淀，18 1:下12000 rpm離心6分鐘；重復2次。22、棄上清，風干沉淀，加入20ul ddH20溶解沉淀。23、短期用存于4°C，長期保存存于_20°C。三、瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)
用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳緩沖液為1XTAE，上樣緩沖液為10XLoadingBuffer,分子量標準Marker為DL2, 000,記錄點樣順序及點樣量(樣品:5ul,Marker:DL2，000)。用紫外凝膠成像儀在紫外燈312nm下觀察電泳結果,照相,保存。
權利要求
1.一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法，其特征在于:該方法采用CTAB法與SDS法相結合，即首先采用CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA，然后再采用SDS法純化所提取的基因組DNA。
2.—種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法，其特征在于:該方法的具體步驟如下: (I )、CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA: 向提取容器內加入CTAB提取緩沖液預熱至65 V ;將牛皮杜鵑新鮮葉片在研磨前加入β-巰基乙醇，加入量為CTAB提取緩沖液體積的4.3%V/V，經液氮研磨成凍粉狀后迅速加入到上述預熱的CTAB提取緩沖液中，充分混勻；于65 °C溫浴4小時；然后按常規方法提取出牛皮杜鵑基因組DNA ； (2)、結合SDS法純化所提取的基因組DNA: 向上述提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積2%的SDS’冰浴10分鐘；加入1/10體積5 mo I.Γ1 KAc，冰浴30分鐘；18 1:下12，000 rpm離心10分鐘，取上清液；加入1/20體積2%的SDS，冰浴10分鐘；加入1/20體積5 mol.L—1 KAc，冰浴30分鐘；離心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗滌沉淀，溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。
3.根據權利要求2所述的一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法，其特征在于:該方法的具體步驟如下: (I )、CTAB法提取牛皮杜 鵑基因組DNA: 取2.0 ml離心管，加入700 ul的CTAB提取緩沖液，65 °C預熱；取新鮮幼嫩牛皮杜鵑材料0.3 g，研磨前加入30 ul β_巰基乙醇，液氮中研磨成凍粉末狀并迅速將該凍粉轉入上述離心管中，充分混勻；水浴中65 °C溫浴4小時；然后按常規方法提取出牛皮杜鵑基因組DNA ； (2)、結合SDS法純化所提取的基因組: 向上述提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積2%的SDS’冰浴10分鐘；加入1/10體積5 mol.Γ1 KAc，冰浴30分鐘；18 1:下12，000 rpm離心10分鐘，取上清液；加入1/20體積2%的SDS，冰浴10分鐘；加入1/20體積5 mol.L—1 KAc，冰浴30分鐘；離心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗滌沉淀，溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。
4.根據權利要求2或3所述的牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法，其特征在于:所述的CTAB 提取緩沖液是由:2% CTAB, 100 mmol.I/1 Tris-HCl pH 8.0, 20mmol.L-1 EDTA,1.4mol.Γ1 NaCl，4% PVP組成；所述的酚氯仿是苯酚與氯仿按1:1體積比配制而成。
全文摘要
本發明屬于遺傳工程技術領域。公開了一種高山植物長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法。該方法首次將CTAB法與SDS法相結合提取純化長白山牛皮杜鵑基因組DNA，并且提取方法中，CTAB提取緩沖液中的PVP用量為4%，較常規方法增加了2%； -巰基乙醇用量為4.3%，較常規方法增加了約1倍；65℃溫浴時間由常規方法的1小時延長至4小時；并結合SDS法純化所提取的基因組，成功地提取出了純度高、質量好的長白山牛皮杜鵑基因組DNA。本發明克服了現有高山植物基因組提取困難、提取的基因組純度低、易降解的不足，對于后續的分子水平研究及高山植物基因組的研究均具有重要意義。
文檔編號C12N15/10GK103074326SQ201210113210
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者徐洪偉, 周曉馥, 未曉巍 申請人:吉林師范大學