專利名稱：細胞培養基及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及毛囊干細胞與毛發再生研究領域。具體地，本發明涉及細胞培養基及其用途。更具體地，本發明涉及細胞培養基及其在體外培養毛乳頭細胞中的用途、用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒及其用途、體外培養毛乳頭細胞的方法、毛乳頭細胞或其衍生物、體外培養毛乳頭細胞的系統以及鑒定制劑對毛囊組織是否具有影響的方法。
背景技術：
近年來隨著生活節奏的加快，受到外界壓力、環境等多種因素的影響，脫發人群有明顯增長的趨勢。自體毛囊移植是目前治療脫發的唯一有效措施，但手術復雜，且對大面積脫發患者而言，供區毛囊有限，無法滿足治療需求。因此，現階段主要將分離的毛囊干細 胞進行擴增后移植于毛發缺失部位，誘導形成新的毛囊，以便實現毛發的再生。而毛乳頭細胞能夠誘導毛囊再生，即使體外培養的毛乳頭細胞仍具有這種特性。因此，毛乳頭細胞的分離、富集及體外擴增對毛發再生的應用至關重要。然而，目前的體外培養毛乳頭細胞的方法仍有待改進。
發明內容
本發明g在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的ー個目的在于提出ー種體外培養毛乳頭細胞的手段。根據本發明的ー個方面，本發明提供了ー種細胞培養基。根據本發明的實施例，該培養基包含基礎培養基,該基礎培養基為AminomaxC-IOO培養基(GIBCO，Cat 17001)；AminomaxC-100 supplement (GIBCO,Catl2556) ;bFGF ;以及 DM0G。發明人發現，利用本發明的細胞培養基對分離的毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠有效地獲得具有干細胞特性和毛囊誘導能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的另一方面，本發明提供了一種用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒中含有bFGF和DM0G。發明人發現，利用本發明的用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒對毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，并且獲得的毛乳頭細胞的毛囊再生能力好。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包含前面所述的本發明的培養基。根據本發明的實施例，利用本發明的用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒對毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠有效地獲得具有毛囊再生能力的毛乳頭細胞或其衍生物。 根據本發明的另一方面，本發明提供了前面所述的根據本發明實施例的細胞培養基在體外培養毛乳頭細胞中的用途。由此，能夠利用本發明的細胞培養對毛乳頭細胞進行體外培養，并且獲得的毛乳頭細胞的毛囊再生能力好。根據本發明的另一方面，本發明提供了前面所述的根據本發明實施例的兩種試劑盒在體外培養毛乳頭細胞中的用途。由此，能夠利用本發明的試劑盒對毛乳頭細胞進行體外培養，從而能夠有效地獲得具有毛囊再生能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的又一方面，本發明提供了ー種體外培養毛乳頭細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟利用根據本發明實施例的培養基，培養CD133陽性毛乳頭細胞。發明人發現，利用本發明的體外培養毛乳頭細胞的方法，能夠有效地對毛乳頭細胞進行體外培養，使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠獲得具有干細胞特性和毛囊誘導能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的實施例，該毛乳頭細胞或其衍生物是通過根據本發明實施例的體外培養毛乳頭細胞的方法獲得的。發明人發現，根據本發明實施例的毛乳頭細胞或其衍生物能夠在適當的條件下分化成毛囊細胞。根據本發明的另一方面，本發明提供了ー種體外培養毛乳頭細胞的系統。根據本發明的實施例，該系統包括分離裝置，該分離裝置用于從人頭皮或小鼠背部皮膚組織分離真皮細胞；分選裝置，該分選裝置與分離裝置相連，并且適于利用CD133抗體從所分離的真 皮細胞中分選CD133陽性毛乳頭細胞；以及培養裝置，該培養裝置與分選裝置相連，并且設置有根據本發明實施例的培養基，用于對CD133陽性毛乳頭細胞進行培養。發明人發現，利用本發明的體外培養毛乳頭細胞的系統，能夠方便有效地對毛乳頭細胞進行體外培養，并且獲得的毛乳頭細胞或其衍生物能夠在適當的條件下分化成毛囊細胞。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種鑒定制劑對毛囊組織是否具有影響的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟將根據本發明實施例的毛乳頭細胞或其衍生物與制劑接觸；以及對接觸前后的毛乳頭細胞或其衍生物進行檢測，其中，基于毛乳頭細胞或其衍生物的形態變化，以及其干細胞特性和毛囊誘導能力標志物的表達變化，判斷制劑對毛囊組織是否具有影響。利用該方法能夠有效地鑒定制劑對毛囊組織是否具有影響。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中
圖I顯示了根據本發明一個實施例的利用流式細胞儀分選CD133陽性毛乳頭細胞的結果；圖2顯示了根據本發明一個實施例的體外培養傳代的第I代毛乳頭細胞體外培養5天時倒置顯微鏡下的形態(X40)；圖3顯示了根據本發明一個實施例，利用細胞免疫化學染色檢測體外培養的毛乳頭細胞中表皮干細胞標志物CK19，非真皮成纖維細胞標志物α -SM,間充質來源標志物Vimentin以及毛乳頭細胞標志物Versican、⑶133的表達的結果；圖4顯示了根據本發明一個實施例，利用流式細胞儀檢測體外培養的毛乳頭細胞中⑶200表達的結果；圖5顯示了根據本發明一個實施例的第3代毛乳頭細胞的AB-PAS組織化學染色結果;圖6顯示了根據本發明一個實施例的第3代毛乳頭細胞的甲苯胺藍組織化學染色
結果;圖7顯示了根據本發明一個實施例，利用CCK-8檢測體外培養的毛乳頭細胞的生長曲線；以及圖8顯示了根據本發明一個實施例，接種毛乳頭細胞的裸鼠皮膚組織及陰性對照的石蠟切片HE染色結果。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。根據本發明的ー個方面，本發明提供了ー種細胞培養基。根據本發明的實施例，該培養基包含基礎培養基，所述基礎培養基為AminomaxC-100培養基(GIBCO，Cat 17001)；AminomaxC-100 supplement (GIBCO,Catl2556) ;bFGF ;以及DMOG。發明人發現，利用本發明的細胞培養基對分離的毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠有效地獲得具有干細胞特性和毛囊誘導能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的實施例，在本發明的細胞培養基中，AmnioMaxC-100supp I ement (GIBCO, 12556)與 AmnioMaxC-IOO 基礎培養基的體積比為I 6。由此，能夠提供細胞培養所需要的各種細胞因子以及谷氨酰胺。根據本發明的實施例，bFGF的濃度有一定的范圍，本領域技術人員可以根據實際實驗情況選擇相應的濃度。根據本發明的ー些具體示例，bFGF的濃度可以為4-10ng/ml，優選5ng/ml。根據本發明的實施例，DMOG的濃度并不受特別限制。根據本發明的ー些具體示例，DMOG的濃度為200-500 μ Μ，優選30 μ Μ。由此，本發明的細胞培養基能夠使得毛乳頭細胞快速有效地進行體外擴增，從而能夠獲得具有毛囊再生能力的毛乳頭細胞。根據本發明的另一方面，本發明提供了一種用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒中含有bFGF和DM0G。發明人發現，利用本發明的用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒對毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，并且獲得的毛乳頭細胞的毛囊再生能力好。
根據本發明的實施例，在本發明的試劑盒中，可以進一歩包含AmnioMaxC-lOOsupplement (GIBCO, Catl2556)，由此，能夠提供細胞培養所需要的各種細胞因子以及谷氨酰胺。根據本發明的實施例，bFGF、DMOG和AmnioMaxC-lOOsupplement分別設置在不同的容器中。根據本發明的實施例，bFGF的濃度并不受特別限制。根據本發明的ー些具體示例，bFGF的濃度可以為4-10ng/ml，優選5ng/ml。根據本發明的實施例，DMOG的濃度并不受特別限制。根據本發明的ー些具體示例，DMOG的濃度為200-500 μ Μ,優選300 μ Μ。由此，本發明的細胞培養基能夠使得毛乳頭細胞快速有效地進行體外擴增，從而能夠獲得具有毛囊再生能力的毛乳頭細胞。根據本發明的一些實施例，本發明的試劑盒可以進ー步包含基礎培養基，該基礎培養基可以為AminomaxC-100培養基(GIBC0，Catl7001)。根據本發明的實施例，在本發明的試劑盒中，AmnioMaxC-lOOsupplement (GIBC0,12556)與AmnioMaxC-IOO基礎培養基(GIBCO，Cat 17001)的體積比為I 6。由此，能夠提供細胞培養所需要的各種細胞因子以及谷氨酰胺。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包含前面所述的本發明的培養基。根據本發明的實施例，利用本發明的用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒對毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠有效地獲得具有毛囊再生能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的再一方面，本發明提供了前面所述的根據本發明實施例的細胞培養基在體外培養毛乳頭細胞中的用途。由此，能夠利用本發明的細胞培養對毛乳頭細胞進行體外培養，并且獲得的毛乳頭細胞的毛囊再生能力好。根據本發明的另一方面，本發明提供了前面所述的根據本發明實施例的兩種試劑 盒在體外培養毛乳頭細胞中的用途。由此，能夠利用本發明的試劑盒對毛乳頭細胞進行體外培養，從而能夠有效地獲得具有毛囊再生能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的又一方面，本發明提供了ー種體外培養毛乳頭細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟利用根據本發明實施例的培養基，培養CD133陽性毛乳頭細胞。發明人發現，利用本發明的體外培養毛乳頭細胞的方法，能夠有效地對毛乳頭細胞進行體外培養，使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠獲得具有干細胞特性和毛囊誘導能力的毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的實施例，在本發明的體外培養毛乳頭細胞的方法中，CD133陽性毛乳頭細胞的來源不受特別限制。根據本發明的ー些具體示例，CD133陽性毛乳頭細胞可以來源于人頭皮或小鼠背部皮膚組織，其中人頭皮為自愿捐獻者頭皮。根據本發明的實施例，上述⑶133陽性毛乳頭細胞是通過下列步驟獲得的首先，從人頭皮或小鼠背部皮膚組織分離真皮細胞。然后，利用CD133抗體對所分離的真皮細胞進行分選，以便獲得CD133陽性毛乳頭細胞。根據本發明的一個實施例，CD133抗體可以為APC-CD133抗體。根據本發明的實施例，利用CD133抗體對所分離的真皮細胞進行分選可以進ー步包括將所分離的真皮細胞懸浮于PBS中；向培養基中添加APC-⑶133抗體，其中，按照每100微升培養基，每IO6個細胞添加APC-⑶133抗體I μ g，即5微升；以及利用流式細胞儀分選⑶133陽性毛乳頭細胞。根據本發明的實施例，在本發明的體外培養毛乳頭細胞的方法中，培養CD133陽性毛乳頭細胞的設備及條件并不受特別限制。根據本發明的ー些具體示例，可以于37°C、5% CO2的培養箱中培養⑶133陽性毛乳頭細胞。具體地，根據本發明的實施例，培養⑶133陽性毛乳頭細胞可以進一歩包括每3天更換一次培養基，且每9-10天進行一次傳代培養，培養至第3代。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種毛乳頭細胞或其衍生物。根據本發明的實施例，該毛乳頭細胞或其衍生物是通過根據本發明實施例的體外培養毛乳頭細胞的方法獲得的。發明人發現，根據本發明實施例的毛乳頭細胞或其衍生物能夠在適當的條件下分化成毛囊細胞。根據本發明的另一方面，本發明提供了ー種體外培養毛乳頭細胞的系統。根據本發明的實施例，該系統包括分離裝置，該分離裝置用于從人頭皮或小鼠背部皮膚組織分離真皮細胞；分選裝置，該分選裝置與分離裝置相連，并且適于利用CD133抗體從所分離的真皮細胞中分選CD133陽性毛乳頭細胞；以及培養裝置，該培養裝置與分選裝置相連，并且設置有根據本發明實施例的培養基，用于對CD133陽性毛乳頭細胞進行培養。發明人發現，利用本發明的體外培養毛乳頭細胞的系統，能夠方便有效地對毛乳頭細胞進行體外培養，并且獲得的毛乳頭細胞或其衍生物能夠在適當的條件下分化成毛囊細胞。根據本發明的實施例，分選裝置中的CD133抗體的熒光標記種類并不受特別限制。根據本發明的ー些具體示例，CD133抗體可以為APC-CD133抗體。根據本發明的實施例，可以作為分選裝置的設備型號、廠家并不受特別限制，只要該設備適于利用APC-CD133抗體從所分離的真皮細胞中分選CD133陽性毛乳頭細胞即可。根據本發明的ー些具體示例，分選裝置為流式細胞儀。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種鑒定制劑對毛囊組織是否具有影響的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟將根據本發明實施例的毛乳頭細胞或其衍生物與制劑接觸；以及對接觸前后的毛乳頭細胞或其衍生物進行檢測，其中，基于毛乳·頭細胞或其衍生物的形態變化，以及其干細胞特性和毛囊誘導能力標志物的表達變化，判斷制劑對毛囊組織是否具有影響。利用該方法能夠有效地鑒定制劑對毛囊組織是否具有影響。需要說明的是，本發明的細胞培養基及其用途，是本申請的發明人經過艱苦的創造性勞動和優化的工作而完成的。下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例I :毛乳頭細胞(DPCs)分離培養按照以下步驟進行毛乳頭細胞分離培養I.分離毛乳頭細胞I. I取自愿捐獻者頭皮(也可以采用小鼠背部皮膚)，浸泡于70%こ醇中2_3min后，利用IXPBS將其進行洗滌；I. 2利用手術刀片去除人頭皮上的毛發后，利用PBS將其進行洗滌；I. 3將上述處理好的人頭皮轉移至含O. 25%胰蛋白酶(消化液)的皿中，并置于4°C下過夜，以便獲得消化過的頭皮，其中，處理好的人頭皮表皮朝上，漂浮于消化液中；I. 4利用刀片將皿中消化過的頭皮去除表皮，保留真皮，并將真皮切成小塊，然后，將皿中的混合物轉入50ml離心管中，并利用IOml吸管反復吹打，至消化完全，以便獲得含有毛乳頭細胞的真皮細胞混合物；I. 5利用100 μ m濾網將上述含有毛乳頭細胞的混合物進行過濾，并于500xg離心5min，然后利用PBS洗滌沉淀，以便分離獲得真皮細胞，備用。2.分選⑶133陽性毛乳頭細胞將上述分離的真皮細胞懸于PBS中，并按照每100 μ I體系，每IO6個細胞添加APC-⑶133抗體5 μ 1，即1“8，置于4で下301^11后，利用I XPBS將分離的真皮細胞進行洗滌，并利用流式細胞儀對進行分選，以便獲得CD133陽性的毛乳頭細胞，備用。其中，圖I顯示了利用流式細胞儀分選⑶133陽性毛乳頭細胞的結果。
3.體外培養⑶133陽性毛乳頭細胞將上述獲得的⑶133陽性毛乳頭細胞接種于細胞培養皿中，并向其中添加含 300ymDM0G、5ng/ml bFGF 以及 AmnioMaxC-lOOsupplement (GIBC0，12556)的AmnioMaxC-IOO培養基(GIBCO，Cat 17001)，然后于37°C、5% CO2的培養箱中進行培養，在培養過程中，每3天更換一次培養基，且9天-10天進行第I次傳代培養，培養至第3代，獲得體外擴增的毛乳頭細胞。其中，AmnioMaxC-lOOsupplement與AminomaxC-100基礎培養基的體積比為1:6。實施例2 :體外培養的毛乳頭細胞的形態觀察及多能性鑒定通過下列實驗，對實施例I中體外培養的毛乳頭細胞進行形態觀察及多能性鑒定I.形態觀察一般方法細胞培養至80%-90%融合，PBS洗滌細胞，再用0.25%胰酶-0.03%EDTA消化細胞，中止消化反應，細胞傳代。次日細胞貼壁后即可于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。按照上述一般方法，于倒置顯微鏡下觀察實施例I中培養了 5d的第I代⑶133陽性毛乳頭細胞的細胞形態，結果見圖2。由觀察結果可知，培養了 5d的第一代毛乳頭細胞增殖明顯，呈凝集性生長，形態似成纖維狀，即為真皮間充質來源的毛乳頭細胞形態。此外，按照上述一般方法，將實施例I中生長至80% -90%融合的⑶133陽性毛乳頭細胞用胰酶消化，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞胞質回縮、細胞間隙増大，細胞變圓，終止反應，離心后加入新鮮培養液，傳代。2.細胞免疫化學染色將實施例I中體外培養的第3代毛乳頭細胞分別進行各種細胞免疫化學染色，以便檢測細胞中表皮干細胞標志物CK19、CD200,非真皮成纖維細胞標志物α -SM,間充質來源標志物Vimentin以及毛乳頭細胞標志物Versican、⑶133的表達情況，結果見圖3和圖4。圖3顯示了利用細胞免疫化學染色檢測體外培養的毛乳頭細胞中表皮干細胞標志物CK19，非真皮成纖維細胞標志物α-SMA，間充質來源標志物Vimentin以及毛乳頭細胞標志物Versican、⑶133的表達的結果。如圖3所示，①為陰性對照，②為Vimentin染色，③為Versican染色，④為⑶133，⑤為a-SMA染色，⑥為CK19染色。由圖3可知，體外培養的毛乳頭細胞中a-SMA、Vimentin、CD133、Versican均為陽性表達，CK19為陰性表達。圖4顯示了利用流式細胞儀檢測體外培養的毛乳頭細胞中CD200表達的結果。由圖4可知，體外培養的毛乳頭細胞中CD200為陰性表達，由此可知，本發明制備的毛乳頭細胞為來源于真皮的間充質細胞。3.細胞化學染色采用AB-PAS和甲苯胺藍對實施例I中的p3代毛乳頭細胞進行組織化學染色，其中，染色前將貼壁后的細胞用4%多聚甲醛RT固定lOmin，然后利用蒸餾水洗滌細胞，備用。AB-PAS 染色 將上述處理好的毛乳頭細胞，利用Alcian blue染色lOmin，然后利用蒸餾水洗漆。接著利用過碘酸將洗漆過的細胞處理IOmin,并再用蒸懼水洗漆,接下來向細胞滴加2mlSchiff液,進行染色IOmin后水洗5min,然后于倒置顯微鏡下觀察,結果見圖5。圖5顯示了第3代毛乳頭細胞的AB-PAS組織化學染色結果。如圖5所示，實施例I中的第3代毛乳頭細胞的酸性粘液物質被Alcian blue染成湖蘭色，中性粘液物質被PAS (periodie acidSchiff)染成紫藍色。由圖5可知，實施例I中的第3代毛乳頭細胞AB-PAS染色顯示為陽性，表明體外培養的毛乳頭細胞能夠合成酸性粘多糖和中性粘多糖，與體內功能相似。甲苯胺藍染色分別采用pHl.O和pH5.0的O. 2M磷酸氫ニ鈉緩沖液配制O. I %甲苯胺蘭，接著，于室溫下對上述處理好的毛乳頭細胞進行染色5min，然后于倒置顯微鏡下進行觀察，結果見圖6。圖6顯示了第3代毛乳頭細胞的甲苯胺藍染色結果。如圖6所示，①為pHl.O的甲苯胺藍的染色結果，②為PH5. O的甲苯胺藍的染色結果，其中，低pH甲苯胺藍(PH1.0)染色呈藍色，高PH甲苯胺藍(PH5.0)染色則呈紫紅色。由圖6可知，實施例I中的第3代毛乳頭細胞具有甲苯胺藍異染性，顯示經體外培養擴增到第3代的細胞具有毛乳頭細胞的特性。
4.細胞増殖情況檢測將實施例I中的體外培養的毛乳頭細胞培養至第3代，按照cck-8試劑盒說明書所述的方法，依據以下步驟，檢測毛乳頭細胞増殖情況將細胞接種于96孔板，每孔接種5 X IO4個細胞，每板接種5孔，共接種7塊細胞培養板，然后將細胞培養板置于37°C ,5% CO2的培養箱中進行培養。每天取ー塊板加入CCK-8試劑，并繼續培養3h，酶標儀測定450nm時細胞的吸光度值，并以培養時間為橫坐標，細胞的吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，結果見圖7。圖7顯示了利用CCK-8檢測體外培養的毛乳頭細胞的生長曲線。由圖7可知，每孔接種5X IO4個毛乳頭細胞時，隨著培養時間的延長，細胞數增多，培養6d后細胞進入平臺期，表明毛乳頭細胞在接種1-6天時增殖活力強，但當細胞密度達到一定程度，細胞不再擴增。5.裸鼠移植實驗選擇4-6周的Balb/c裸鼠，利用こ醚將其麻酔，然后于裸鼠背部兩側皮下分別注射體外培養的第3代人毛乳頭細胞(移植細胞組)和生理鹽水(對照組)，飼養3個月后，取接種部位皮膚制作石蠟切片，并將其進行HE染色，結果見圖8。圖8顯示了接種毛乳頭細胞的裸鼠皮膚組織及陰性對照的皮膚組織石蠟切片HE染色結果。由圖8可知，移植細胞組石蠟切片染色可見大的毛囊樣結構，而對照組毛囊小，且毛囊角化，毛干萎縮，表明接種的人毛乳頭細胞能夠在裸鼠體內發育成為完整的大的毛囊結構，且毛囊有多層結構組成，與未接種細胞的裸鼠毛囊結構不同。在本說明書的描述中，參考術語“ー個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“ー些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少ー個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解在不脫離本發明的原理和宗g的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。
權利要求
1.ー種細胞培養基，其特征在于，包含 基礎培養基，所述基礎培養基為AminomaxC-IOO培養基；AmnioMaxC-I00supplement ；bFGF ;以及DMOG， 任選地，所述AmnioMaxC-100supplement與所述AminomaxC-IOO基礎培養基的體積比為 I : 6, 任選地，所述bFGF的濃度為4-10ng/ml,優選5ng/ml, 任選地，所述DMOG的濃度為200-500 μ Μ，優選300 μ Μ。
2.ー種用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有bFGF和DMOG， 任選地，進一步包含 AmnioMaxC-lOOsupplement, 任選地，所述bFGF、DMOG和AmnioMaxC-100supplement分別設置在不同的容器中， 任選地，進ー步包含基礎培養基，所述基礎培養基為AminomaxC-IOO培養基， 任選地，所述bFGF、DM0G和AmnioMaxC-100supplement的至少之一溶解于基礎培養基， 任選地，所述bFGF的濃度為4-10ng/ml,優選5ng/ml, 任選地，所述DMOG的濃度為200-500 μ Μ，優選300 μ Μ。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在干，進ー步包含AmnioMaxC-100 suppIement, 任選地，所述Amni oMaxC-100 supp I ement與所述AmnioMaxC-IOO基礎培養基的體積比為 I : 6。
4.一種用于體外培養毛乳頭細胞的試劑盒，其特征在于，包含權利要求I所述的培養基。
5.權利要求I所述的培養基在體外培養毛乳頭細胞中的用途。
6.權利要求2-4任一項所述的試劑盒在體外培養毛乳頭細胞中的用途。
7.—種體外培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 利用權利要求I所述的培養基，培養CD133陽性毛乳頭細胞， 任選地，所述CD133陽性毛乳頭細胞來源于人頭皮或小鼠背部皮膚組織， 任選地，所述⑶133陽性毛乳頭細胞是通過下列步驟獲得的 從人頭皮或小鼠背部皮膚組織分離真皮細胞； 利用CD133抗體對所分離的真皮細胞進行分選，以便獲得所述CD133陽性毛乳頭細胞， 任選地，所述⑶133抗體為APC-⑶133抗體， 任選地，利用CD133抗體對所分離的真皮細胞進行分選進一歩包括 將所分離的真皮細胞懸浮于PBS中； 向所述培養基中添加APC-CD133抗體，任選地按照每100微升體系，每IO6個細胞添加APC-CD133 抗體 1μ g ;以及 利用流式細胞儀分選CD133陽性毛乳頭細胞， 任選地，于37°C、5% CO2的培養箱中進行所述培養， 任選地，培養⑶133陽性毛乳頭細胞進ー步包括每3天更換一次培養基，9-10天進行第一次傳代培養，培養至第3代。
8.一種毛乳頭細胞或其衍生物，其特征在干，是通過權利要求7所述的體外培養毛乳頭細胞的方法獲得的。
9.ー種體外培養毛乳頭細胞的系統，其特征在于，包括 分離裝置，所述分離裝置用于從人頭皮或小鼠背部皮膚組織分離真皮細胞； 分選裝置，所述分選裝置與所述分離裝置相連，并且適于利用CD133抗體從所分離的真皮細胞中分選CD133陽性毛乳頭細胞；以及 培養裝置，所述培養裝置與所述分選裝置相連，并且設置有權利要求I所述的培養基，用于對所述CD133陽性毛乳頭細胞進行培養， 任選地，所述⑶133抗體為APC-⑶133抗體， 任選地，所述分選裝置為流式細胞儀。
10.一種鑒定制劑對毛囊組織是否具有影響的方法，其特征在于，包括以下步驟 將權利要求8所述的毛乳頭細胞或其衍生物與所述制劑接觸；以及 對接觸前后的毛乳頭細胞或其衍生物進行檢測， 其中， 基于所述毛乳頭細胞或其衍生物的形態變化，以及其干細胞特性和毛囊誘導能力標志物的表達變化，判斷所述制劑對毛囊組織是否具有影響。
全文摘要
本發明涉及細胞培養基及其用途。其中，培養基包含基礎培養基，該基礎培養基為AminomaxC-100培養基；bFGF；以及DMOG。利用本發明的細胞培養基對分離的毛乳頭細胞進行體外培養，能夠有效地使得毛乳頭細胞擴增，從而能夠有效地獲得具有干細胞特性和毛囊誘導能力的毛乳頭細胞。
文檔編號C12N5/071GK102676448SQ20121011344
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者習佳飛, 劉大慶, 呂洋, 姚海雷, 岳 文, 師偉, 張秀媛, 裴雪濤, 謝小燕, 陳琳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所