專利名稱：一種從雞血中提取大量高純度dna的方法
技術領域：
本發明涉及，尤其涉及的是一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法。
背景技術：
提取高質量、高濃度和高純度的基因組DNA是開展分子生物學實驗的重要技術步驟，從動物血液中提取基因組DNA，具有不殺死動物，經濟實用等優點。常規血液DNA的提取方法多采用苯酚氯仿法提取，這種方法具有耗時長、實驗試劑毒性大，操作復雜等缺點。而試劑盒提取費用相對較高，提取的DNA純度和濃度均低，只適合近期實驗的需要，提取的DNA量較少不利于多次反復使用；且由于提取量少，提取的DNA容易降解不易長期保存利 用，時間稍長就不能進行下游PCR擴增反應。為了更有效、快速地提取高質量高濃度的雞血基因組DNA，在借鑒和改進前人工作的基礎上，研究建立了一種從雞血中快速大量提取高質量基因組DNA的方法，現將試驗過程報道如下。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法。本發明的技術方案如下一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法，包括以下步驟吸取100 ill解凍的DNA保存液保存的雞血樣品100 u I到含300 u I試劑X的I. 5ml離心管中；用移液槍反復垂懸，直到使原血樣變為澄清的液體狀；4000rpm離心5min，棄掉上清液；加入Iml的試劑Y,輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入I的Rnase A,混勻后，37°C溫浴30min ;加入250 V- I的5mol/L高氯酸鈉，手動振蕩混合IOmin ;55°C水浴20min,期間每隔5min手工晃動一次；加入300 ill預冷的三氯甲烷，混合5min ；12000r/min離心5min，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動，即可見絮狀DNA ;用預冷的75%乙醇洗滌2次，晾干，用適量的TE溶解，4°C存放一周，轉至_20°C長期保存；所述的DNA 保存液TrisCl 3. 03g,,Na2EDTA 9. 31g，SDS 2. 50g 加水攪拌溶解，定容至250ml ；所述的試劑X配制方法將lmol/LTrisCl (pH 8. 0), lmol/LMgCl2,體積百分比10%的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的蔗糖，使混合液中各成分的終濃度為10mmol /T, Tris Cl ；0. 32mol/L 鹿糖；5mmoI /T, MgCl2 ； I % Triton X-100 ;然后用 NaOH 調整pH值至8.0，高壓滅菌；所述的試劑Y配制方法將lmol/LTrisCl、pH 8. 0,0. 5moI/LNa2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固體和水，使混合液中各成分的終濃度為400mmol/L TrisCl ；60mmol/L Na2EDTA ；150mmol/L NaCl。然后高壓滅菌。再加入一定量的10% SDS，使SDS在試劑Y混合液中的質量百分比濃度為I%。采用上述方案提取DNA耗時較短、提取的DNA樣品純度高，A260Jk280rm在I.696-1. 857，濃度大(100 yl雞血可提取46. 317 iig DNA)、質量好，能完全滿足下游分子生物學實驗的要求。
圖I為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測雞血中提取的基因組DNA結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。本發明的方法為一種快速、高效的從雞血中提取高純度、大濃度的基因組DNA的方法。I、雞血樣品的制備雞翅下靜脈采血后與等體積的DNA保存液(配方見主要試劑的配制部分)混勻，-20°C低溫保存。2、提取DNA的主要試劑及配制所用試劑為:TrisCl，Sucrose,MgCl2, Triton X-100, NaOH, Na2EDTA, NaCl，SDS,NaClO4 H2O, RNaseA0(1)0嫩保存液1'1^8(1 3. 03g,,Na2EDTA 9.31g，SDS 2. 50g加水攪拌溶解，定容至250ml。(2) lmol/LTrisCl :在800ml水中溶解121g Tris堿，用濃鹽酸調pH值到8. 0，加水至1L。(3) lmol/L MgCl2 :20. 3g MgCl2 6H20 加水至 100ml。(4) 0. 5moI/LNa2EDTA (pH 8.0):在 800ml 水中加入 186. Ig 的 EDTA,用 NaOH (約20g)調pH值至8. 0,定容至1L。高壓滅菌。(5)10% SDS :在 900ml 水中加入 100g SDS，加熱至 68°C助溶，加 HCl 調 pH 為 7. 2，
定容至1L，用濾器過濾以除菌。(6)試劑 X 配制將 lmol/L TrisCl (pH 8. 0)，lmol/L MgCl2,10% (體積百分比)的Triton X-100按比例混合,再加入一定量的固體鹿糖(Sucrose),使混合液中各成分的終濃度為:10mmol /T, Tris Cl ；0. 32mol/L Sucrose 5mmol/L MgCl2 ； I % TritonX-IOO0 然后用NaOH調整pH值至8. 0，高壓滅菌。(7)試劑 Y 配制將 lmol/LTrisCl (pH 8. 0)，0. 5moI/LNa2EDTA 按比例混合，再加入一定量的NaCl固體和水，使混合液中各成分的終濃度為400mmol/L TrisCl ；60mmol/LNa2EDTA ；150mmol/L NaCl。然后高壓滅菌。再加入一定量的10% SDS，使SDS在試劑Y混合液中的質量百分比濃度為1%。(8) 5mol/L 高氯酸鈉(NaClO4) :70. 24g NaClO4 H2O 溶解于 IOOml 水中。(9) 10mg/ml RNaseA IOOmg RNaseA 加水到 10ml,分裝后忙存在 _20°C冰箱中。(10) TE (pH 8.0) :2ml I. 0mol/L TrisCl (pH 8. 04)和 400 y I 0. 5mol/LNa2EDTA(pH 8.0)混合，加水定容至200ml。高壓滅菌。3基因組DNA的提取方法與步驟吸取100 U I解凍的DNA保存液保存的雞血樣品100 Ul到含300 U I試劑X的、I.5ml離心管中；用移液槍反復垂懸，直到使原血樣變為澄清的液體狀；4000rpm離心5min，棄掉上清液；加入Iml的試劑Y,輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入I的RnaseA,混勻后，37°C溫浴30min ;加入250 的5mol/L高氯酸鈉，手動振蕩混合IOmin ;55°C水浴20min,期間每隔5min手工晃動一次；加入300ii I預冷的三氯甲燒,混合5min ；12000r/min離心5min，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動，即可見絮狀DNA ；用預冷的75% (v v)乙醇洗滌2次，晾干，用100-200 ill的TE溶解，4°C存放一周，轉至-20°C長期保存。4提取的DNA的濃度和純度的檢測結果參考圖1，圖I為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測雞血中提取的基因組DNA結果，可見瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一，清晰，無拖尾及掛孔等現象，表明提取的DNA純度較高。參考表I，采用本方法提取的雞血基因組DNA的純度A26cimiA28cinm在I. 696-1. 857之間，平均值為I. 791，本方法用雞血量僅100 iil，但可一次提取到31. 3-58. 2 ii g左右的基因組DNA，平均值為46. 317。利用提取的雞血DNA進行PCR特異性基因擴增，結果顯示，PCR擴增效果理想，該方法提取的DNA樣品能滿足雞基因組方面研究的要求。與傳統的苯酚-氯仿法相比，該方法提取DNA耗時短(平均I. 2h)、提取的DNA純度高、濃度大、實驗試劑以及成本低，是一種較好的雞血DNA提取方法。表I本方法提取的100份雞血基因組DNA純度和提取總量結果
權利要求
1. 一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟吸取IOOiU解凍的DNA保存液保存的雞血樣品100 u I到含300 u I試劑X的I. 5ml離心管中；用移液槍反復垂懸，直到使原血樣變為澄清的液體狀；4000rpm離心5min,棄掉上清液；加入Iml的試劑Y,輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入5 ii I的RnaseA,混勻后,37°C溫浴30min ;力口A 250 ii I的5mol/L高氯酸鈉，手動振蕩混合IOmm ;55°C水浴20min,期間每隔5min手工晃動一次；加入300 ill預冷的三氯甲烷，混合5min ；12000r/min離心5min，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動，即可見絮狀DNA ;用預冷的75%乙醇洗滌2次，晾干，用適量的TE溶解，4°C存放一周，轉至_20°C長期保存； 所述的DNA保存液=TrisCl 3. 03g,，Na2EDTA9. 31g，SDS 2. 50g加水攪拌溶解，定容至250ml ； 所述的試劑X配制方法:將ImoVLTrisCl (pH 8. 0)，lmol/LMgCl2，體積百分比10%的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的蔗糖，使混合液中各成分的終濃度為10mmol/LTris Cl ;0. 32mol/L 蔗糖；5mmol/L MgCl2 ；1% Triton X-100 ;然后用 NaOH 調整 pH 值至.8.0,聞壓滅囷； 所述的試劑Y配制方法將lmol/L TrisCUpH 8.0,0. 5mol/L Na2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固體和水，使混合液中各成分的終濃度為400mmol/LTriSCl ；60mmol/LNa2EDTA ；150mmol/L NaCl。然后高壓滅菌。再加入一定量的10% SDS，使SDS在試劑Y混合液中的質量百分比濃度為1%。
全文摘要
本發明公開了一種從雞血中提取大量高純度DNA的方法，包括以下步驟吸取解凍的DNA保存液保存的雞血樣品到含試劑X的離心管中；用移液槍反復垂懸，直到使原血樣變為澄清的液體狀；離心，棄掉上清液；加入試劑Y，輕輕懸浮上一步離心后的沉淀物；加入Rnase A，混勻后，37℃溫浴30min；加入5mol/L高氯酸鈉，手動振蕩混合10min；水浴，期間每隔5min手工晃動一次；加入預冷的三氯甲烷，混合5min；離心，吸取上清到另一離心管中；加入等體積的異丙醇，緩慢搖動，即可見絮狀DNA；用預冷的75％乙醇洗滌2次，晾干，用適量的TE溶解，4℃存放一周，轉至-20℃長期保存；本發明提取DNA耗時較短、提取的DNA樣品純度高，濃度大、質量好，能完全滿足下游分子生物學實驗的要求。
文檔編號C12N15/10GK102660537SQ20121012692
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者劉麗仙, 苗永旺, 霍海龍, 霍金龍 申請人:云南農業大學