專利名稱：一種纖維素酶系的選擇性失活方法
技術領域：
本發明涉及纖維素酶，具體涉及ー種纖維素酶系的選擇性失活方法
背景技術：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是研究和制備纖維素酶最常用的經典菌株之一，通過底物的誘導和發酵調控作用它可以分泌出多種不同類型的聚糖水解酶蛋白組分，進而組成不同的酶系或復合酶系；其中，纖維素酶系主要包括內切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanase, EC 3. 2. I. 4,簡稱EG)、外切葡苷聚糖酶(exo-1, 4_β-D-glucanase, EC 3. 2. I. 91,又稱 CBH)和纖維 ニ糖酶(3-l，4-D-glucosidase，EC 3. 2. I. 21，又稱β -葡萄糖苷酶，簡稱β-G或BG)三大酶系，目前已經發現了 8 個 EG (EGI EGVIII)、2 個 CBH (CBHI 和 CBHII)和 7 個 BG (BGI BGVII)酶家族。在木質纖維原料聚糖類的酶水解過程中，通過上述三大酶系的協同作用可以催化纖維素或半纖維素為聚糖最終水解生成單糖。隨著功能性多糖和低聚糖類在細胞生物合成和調控領域、食品、保健品、醫藥和飼料等領域的基礎研究和應用的快速發展，聚糖定向酶水解技術的研究和開發備受關注，對具有單一功能或催化活性的酶家族或酶組分的需求日益增長。目前采用的主要技術途徑一是通過外源単一內切酶或外切酶基因的重組表達，ニ是對天然酶制劑進行蛋白質拆分以控制和除去纖維素系中的BG酶組分，它們在大規模エ業化生產中存在著技術復雜、研發周期長、設備及操作要求高、前期投入和運行成本高等不足，因此尋求簡單低廉的酶組分活力的定向控制技術和方法顯得尤其重要，具有重要的理論和實用價值。
發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種纖維素酶系的選擇性失活方法，以里氏木霉產天然纖維素酶及其他相關的復合酶系為材料，通過采用簡單的PH值處理的方法對其三大酶系進行選擇性失活處理，實現對纖維素酶系的簡單、快速和選擇性失活。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種纖維素酶系的選擇性失活方法控溫5 40で，調節纖維酶液的pH不小于8，靜置處理l(T80min，即可選擇性失活纖維素酶系；其中，CMCase和CBH選擇性保留，BG選擇性失活。所述的纖維素酶系為里氏木霉產的天然纖維素酶復合酶系及其他相關的復合酶系O用含有Na+的堿液或緩沖液,或用含有K+的堿液或緩沖液,調節纖維酶液pH。所述的ρΗ=8· 8 9. 2。有益效果本發明的纖維素酶系的選擇性失活方法，簡單，快速，容易操作，僅需通過采用簡單的pH值處理的方法就可以實現對纖維素酶系中的三大酶系進行選擇性失活處理，是ー種簡單低廉的酶組分活力的定向控制技術和方法，具有重要的實用價值，有很好的實用性，能夠產生較好的經濟效益和社會效應。
圖I是纖維素酶系堿性失活的酶活力測定結果 圖2是處理溫度對纖維素酶系堿性失活的影響結果 圖3是處理時間對纖維素酶系堿性失活的影響結果 圖4是堿性條件下處理前后纖維素酶水解動力學的比較結果圖；
圖5是堿處理纖維素酶定向水解紙漿的糖組成測定結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進ー步的說明。以下實施例是使用的纖維素酶系采用發酵制備，所使用的菌種為里氏木霉(Trichoderma reesei Rut C_30),方法為采用Mandels營養鹽添加12 g/L紙衆和蒸汽瀑破玉米秸桿混合底物為碳源，在250 mL玻璃搖瓶中裝液45 mL并接入5 mL活化后的里氏木霉菌絲體,于30°C和170 r/min振蕩發酵產酶96h得發酵液,經4000 r/min離心10 min后取上清液即得到纖維素酶系原液，分裝后冷凍保藏備用。酶活力測定方法為采用雙平行實驗，控制平行誤差< 5%。濾紙酶活力、內切葡聚糖酶活力(CMCase)和外切葡聚糖酶活力(CBH)均采用DNS法測定，β -葡萄糖苷酶(BG)采用對硝基苯酚葡萄糖苷法測定。上述各種酶活力測定均采用O. 05 mol/L檸檬酸ー氫氧化鈉緩沖液體系(PH4.80)和50°C ±1。纖維素酶原液中上述各種酶活力值依次為5.81 FPIU/mL、38.01 IU/mL、3.60 IU/mI^P1.13 IU/mL。實施例I
在恒溫水浴和溫和攪拌的條件下，向纖維素原酶液中緩慢滴加少量NaOH溶液調節pH值至穩定值，密封靜置處理后得處理后的酶液，再采用酶活力測定方法重新測定處理后酶液的三種酶組分的酶活力。采用雙平行實驗進行酶系選擇性失活，控制平行誤差<5%。殘余酶活力的計算方法以處理前后酶液的各種酶活力測定值相對百分比來表示。堿性處理后纖維素酶液離心分離條件8000 r/min離心堿性處理后的纖維素酶液IOmin后完全傾出離心上清液，以10% (v/v)體積的檸檬酸緩沖液(pH4. 80)清洗離心管壁得離心沉淀物。在25°C的恒溫條件下直接添加4. 0% NaOH或KOH試劑或對應的緩沖液(w/w)調節纖維酶系的PH值并靜置處理60min后，測定三大酶組分的酶活力。結果如圖I所示，在不同PH值的堿性處理條件下三大酶類的酶活力呈現出兩種不同類型的變化特征。以pH8.00以分界點，CMCase為兩段階梯式變化，而CBH和BG則為線性衰減。pH5. 00 7. 00的范圍內，CMCase和CBH的酶活力相對較為穩定,可保留90%以上，而BG酶類的酶活力穩定性略低,繼續提高PH值導致CBH和BG的酶活力快速線性下降。在高于pH8. 00的環境中CMCase的酶活力相對較為穩定。當PH值增至9. 00吋，BG的殘余酶活力僅為5. 6%，而CMCase和CBH仍然可殘留57. 0%和52. 1%, CMCaseXBH與β -G的殘留酶活力的相對比率分別為10. 3和
9.4 ;至pH10. 00時，可以基本上消除BG和90%以上的CBH酶活力，但仍然可以保留48. 4%的CMCase酶活力，即可以得到幾乎不含BG酶活力的纖維素酶制劑。實施例2
在pH9. 00的條件下，將纖維素酶原液分別置于5 40°C ±1的恒溫水浴條件下同步靜置處理60min，測定三大酶組分的酶活力。結果如圖2所示，在pH9. 00的堿條件下，低于10°C的處理溫度對BG酶組分存在一定的保護作用，在15 30°C的溫度范圍內堿性pH對纖維素酶液都起到較好的選擇性失活作用，但是超過30°C的溫度也會導致CMCase和CBH的殘余酶活呈現出下降的趨勢。這有利于纖維素酶在常溫下進行堿處理操作。圖3顯示不同處理時間(l(T80min)的結果，在pH9. 00和25°C ±1的條件下處理30min后，三種酶類的殘余酶活力就可以達到穩定狀態，其中CMCase、CBH和BG的殘余酶活力分別為58. 8%,56. 6%和5. 7%，相對比例達到10. 3和9. 9，可實現選擇性失活的效果。堿處理時間超過70min后，CMCase和CBH的酶活力會表現出下降的趨勢，顯然，優選使用2(T60min，更優選使用30 60mino
實施例3
分別采用PH9. 00 土 O. 20和ρΗΙΟ. O ± O. 20的兩種堿性條件在25°C ± I處理纖維素酶液30min后得到處理后的酶液(方法同實施例1)，以纖維素酶原液為對照，在10 g/L紙漿的酶解體系中分別加入O. 1% (v/v)用量的三種酶液，進行酶水解反應
酶水解性能的檢測采用雙平行實驗，控制平行誤差< 5%。在100 mL螺ロ玻璃三角瓶中進行，加入O. 05mol/L朽1檬酸緩沖液(pH 4. 80)配制而成的10 g/L Whatman濾紙紙衆粉(20目)溶液25 mL作為酶解底物，再加入適量酶液并密封，于50°C ±1和100 r/mim振蕩反應。定時取樣O. 5mL加入10 μ L的1% (v/v) H2S04終止酶反應得酶水解產物，經適當稀釋后進行色譜分析。酶解得率計算以水解反應體系中所測定的產物糖的物質濃度除以紙漿的初始物質濃度再乘以轉換系數O. 9。比較3種酶液的酶水解反應歷程，結果如圖4所示，在低底物和較少酶用量的反應條件下，與原酶液相比，經過PH9. 00堿處理后的酶制劑仍然可保存50%以上的CMCase和CBH酶活力，二者對紙漿酶水解反應的動力學和總糖得率基本上相近。由于堿處理可選擇性地抑制酶系中BG酶活力(殘余酶活力5%左右)，因而可以有效地保護紙漿酶水解過程中生成的纖維低聚糖組分。O. 1%(ν/ν)用量的堿處理酶催化水解10g/L紙漿反應24h后，反應體系中各種酶解產物組成基本趨于穩定，對應的總糖酶解得率為8. 60%，其中纖維低聚糖的酶解得率為6. 73%，低聚糖占總糖的比例由原酶液的50. 9%增長到78. 2%，提高幅度達到53. 0%。這說明，堿性理對天然纖維素酶系的選擇性失活作用可顯著提高定向水解纖維素制備纖維低聚糖的生產性能，可用于纖維低聚糖的酶法生產。提高酶液堿度至ρΗΙΟ. O會導致三大酶類進ー步失活，尤其是CBH顯著失活，造成酶水解性能和低聚糖的得率大幅度下降，但對酶解產品品質即低聚糖比例的貢獻較小。酶水解產物的色譜分析葡萄糖的測定依照NREL方法采用高效液相色譜法(色譜儀Agilent 1200),以Bio-Rad HPX -87H色譜柱(7. 8mm X 300mm)測定。纖維低聚糖的分析測定采用高效液相離子交換色譜一脈沖安培法(色譜儀Dionex ICS-3000)，以CarboPacTMPA200陰離子交換色譜柱(3mmX 250mm)測定。葡萄糖和纖維低聚糖的標準品來自Magazyme公司。采用高效離子液相色譜對酶解產物糖組成進行分析，結果如圖5所示，采用堿失活纖維素酶水解紙漿只生成纖維ニ糖和少量的纖維三 糖，不會生成其它聚合度的纖維低聚糖，兩種糖分別約占總低聚糖類的90%和10%。
權利要求
1.一種纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于控溫5 40°C，調節纖維酶液的pH不小于8，靜置處理l(T80min，即可選擇性失活纖維素酶系；其中，CMCase和CBH選擇性保留，BG選擇性失活。
2.根據權利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于所述的纖維素酶系為里氏木霉產的天然纖維素酶。
3.根據權利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于用含有Na+的堿*液或緩沖液，或用含有K+的堿液或緩沖液，調節纖維酶液pH。
4.根據權利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于pH=8.8^9. 2。
5.根據權利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于所述的溫度為15 30°C。
6.根據權利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于所述的處理時間為30 60min。
全文摘要
本發明公開了一種纖維素酶系的選擇性失活方法，控溫5~40℃，調節纖維酶液pH不小于8，靜置處理10~80min，即可選擇性失活纖維素酶系；其中，CMCase和CBH選擇性保留，BG選擇性失活。本發明的纖維素酶系的選擇性失活方法，簡單，快速，容易操作，僅需通過采用簡單的pH值處理的方法就可以實現對纖維素酶系中的三大酶系進行選擇性失活處理，是一種簡單低廉的酶組分活力的定向控制技術和方法，具有重要的實用價值，有很好的實用性，能夠產生較好的經濟效益和社會效應。
文檔編號C12N9/99GK102653752SQ20121012710
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者余世袁, 勇強, 徐勇, 杭琪, 范麗, 蔡鵬 申請人:南京林業大學