專利名稱：生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的重組菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物(P(3HP-CO-4HB))的重組菌及其應用。
背景技術：
利用代謝工程技術改造微生物已成為一種行之有效的方法來生產化學產品以及新型的生物材料。聚輕基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHA)是ー類在微生 Fuchtenbusch, B. ,1998. Bacterial and other biological systems for polyesterproduction. Trends Biotechnol. 16,419-427.)。隨著對其深入的研究,聚輕基脂肪酸酯在環保材料、生物醫學和生物能源方面將極具應用價值。根據單體的結構組成，PHA可分為短鏈和中長鏈兩類前者的単體組成為C3到C5，后者的単體組成為C6到C14。3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物(P(3HP-co-4HB))是ー種新型的生物可降解高分子聚合物，屬于短鏈共聚物的ー種，之前報道的利用生物技術生產出的此聚合物中4-羥基丁酸的含量均低于 2mol% (Zhou, Q.，Shi，Z. Y.，Meng, D. C.，Wu, Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. ,2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinant Escherichia coli.Metab. Eng. 13, 777-785.) 除本申請之外，至今國際上還沒有關于P (3HP-co_4HB)熱力學性質的報道。
發明內容
本發明的目的本發明的ー個目的是提供產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物(P (3HP-co-4HB))的重組菌的構建方法并用這個重組菌生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物。本發明提供的方法，包括如下步驟將1，3-丙ニ醇脫氫酶編碼基因(dhaT)、醛脫氫酶編碼基因(aldD)、3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因(pcs’)、4_羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因(orfz)和PHA聚合酶編碼基因(phaC)導入出發菌，得到重組菌。所述1，3-丙ニ醇脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列8 ;所述醛脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列9 ;所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶的氨基酸序列為序列表中序列10 ；所述PHA聚合酶的氨基酸序列為序列表中序列11 ;所述4-羥基丁酸輔酶A轉移酶的氨基酸序列為序列表中序列12。所述1，3-丙ニ醇脫氫酶基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;自序列I的5'端第1-1185位核苷酸為編碼序列。所述醛脫氫酶基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ；自序列2的5'端第1-1521位核苷酸為編碼序列。所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ；自序列3的5'端第1-2571位核苷酸為編碼序列。所述PHA聚合酶基因的核苷酸序列為序列表中序列4;自序列41的5'端第1-1770位核苷酸為編碼序列。所述4-羥基丁酸輔酶A轉移酶的核苷酸序列為序列表中序列5 ;自序列5的5'端第1-1290位核苷酸為編碼序列。所述出發菌為大腸桿菌，優選為Escherichia coli S17-1。但不限于大腸桿菌(Eschericnia coliノ。
所述1，3-丙ニ醇脫氫酶編碼基因和所述醛脫氫酶編碼基因通過重組載體A導入所述出發菌中；所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因、所述4-羥基丁酸輔酶A轉移酶基因和所述PHA聚合酶編碼基因通過重組載體B導入所述出發菌中；所述重組載體A 為 pZQOl (Zhou, Q.，Shi，Z. Y.，Meng, D. C.，Wu, Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. ,2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinant Escherichia coli.Metab. Eng. 13,777-785.公眾可從清華大學獲得)；所述重組載體B為將4-羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因反向插入到pZQ03 (Zhou,Q. , Shi, Z. Y. , Meng, D. C. , ffu, Q. , Chen, J. C. , Chen, G. Q. , 2011. Production of3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) copolymer by recombinant Escherichia coli. Metab. Eng. 13, 777-785.公眾可從清華大學獲得)的BamH I識別位點間得到的載體。由上述的方法構建的重組菌也屬于本發明的保護范圍本發明的另ー個目的是提供生產不同単體比例的3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟搖瓶培養所述的重組菌，收集產物，即得到3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物。所述生產溫度為30°C -40°C，所述生產培養基的pH為6-8 ；所述生產溫度具體為37°C，所述生產培養基的pH具體為7。所述生產過程中，在所述搖瓶接種前，向所述搖瓶中添加1，3_丙ニ醇和/或1，4_ 丁ニ醇，使搖瓶中培養基中的1，3_丙ニ醇或1，4_ 丁ニ醇含量均不高于20g/L。所述培養基中的I，3-丙ニ醇或I，4-丁ニ醇濃度均為lg/L_20g/L ;所述培養基中的 I，3-丙ニ醇和 I，4-丁ニ醇濃度具體為 lg/L 和 10g/L，5g/L 和 15g/L，5g/L 和 10g/L，IOg/L 和 10g/L，10g/L 和 5g/L。所述培養時間具體為48h ;所述共聚物為3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物。可采用生物工程領域中常用的方法將含有1，3_丙ニ醇脫氫酶、醛脫氫酶、3-羥基丙酸輔酶A連接酶、4-羥基丁酸輔酶A轉移酶及PHA聚合酶基因的表達載體轉化大腸桿菌宿主菌，如電擊轉化法、化學轉化法或氯化鋰轉化法，優選為電擊轉化法。可采用大腸桿菌的常規培養條件對重組大腸桿菌進行培養。
在搖瓶中，可采用如下的TB培養基進行生產，培養基成分含有24g/L酵母提取物，12g/L 蛋白胨，4mL/L 甘油，0.017mol/L KH2PO4,0. 072mol/L K2HPO4，余量為水。溶液先在15psi高壓下蒸汽滅菌20min，當冷至60°C或60°C以下時加入無菌的KH2PO4和K2HPO4的水溶液。在實際的培養過程中，可向上述培養基中再添加一定濃度的抗生素以維持質粒的穩定性，如100 V- g/mL氨節青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素。本發明的第三個目的是提供一種生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的兩種載體組合。本發明提供的組合物，由所述的方法中的重組載體A和重組載體B組成。上述方法制備的3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物也屬于本發明的保護范圍。本發明提供的3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物這種新型生物材料具有優良的熱力學性質，以供應用開發之用。
本發明的實驗證明，本發明提供了ー種含有1，3_丙ニ醇脫氫酶基因，醛脫氫酶基因，3-羥基丙酸輔酶A連接酶基因，4-羥基丁酸輔酶A轉移酶基因及PHA聚合酶基因的專用表達工程菌，該工程菌可高效表達I，3-丙ニ醇脫氫酶及醛脫氫酶基因，在脫氫酶的作用下轉化底物I，3丙ニ醇或I，4- 丁ニ醇為3-羥基丙酸或4-羥基丁酸，同時該工程菌也高效表達3-羥基丙酸輔酶A連接酶和4-羥基丁酸輔酶A轉移酶基因，使3-羥基丙酸或4-羥基丁酸轉化為3-羥基丙酸輔酶A或4-羥基丁酸輔酶A，該工程菌同時也高效表達PHA聚合酶基因，使3-羥基丙酸輔酶A和4-羥基丁酸輔酶A聚合為3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物P(3HP-co-4HB)。搖瓶實驗表明將本發明的工程菌在500mL容積搖瓶中生產后，P (3HP-co-4HB)的產量最高可達6. 2g/L，P (3HP-co_4HB)最高可達細胞干重的63%。本發明生產エ藝簡單，開生產的聚合物其熱力學性能可以通過調節3HP和4HB的比例實現變化；應用前景廣闊。
圖I為1，3_丙ニ醇、1，4-丁ニ醇、3-羥基丙酸和4_羥基丁酸的共聚物的轉化關系不意圖。圖2為P (3HP)，5種不同単體比例的P (3HP-co_4HB)，P (4HB)的實物3A 和 3B、圖 4 為 P (3HP-co_37· 89mol % 4HB)的核磁圖譜。圖5為pZQOl (圖5中A)和pZQ03_orfz (圖5中B)的質粒圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。所用酶試劑均購自MBI Fermentas公司，提取質粒所用的試劑盒購自北京博邁德科技發展公司，回收DNA片段所用的試劑盒購自美國omega公司，相應的操作步驟按照產品說明書進行；所有培養基如無特別說明均用去離子水配制。培養基配方I)種子液搖瓶培養基
LB培養基5g/L酵母提取物(購自英國OXID公司，產品目錄號LP0021)，IOg/L蛋白胨(購自英國OXID公司，產品目錄號LP0042)，10g/L NaCl，其余為水。調pH值至7. 0-7. 2,高壓蒸汽滅菌。2)生產搖瓶培養基TB培養基配置方法將下列組分溶解在O. 9L水中蛋白胨(購自英國OXID公司，產品目錄號LP0042) 12g，酵母提取物(購自英國OXID公司，產品目錄號LP0021) 24g，甘油4mL0各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C,再加IOOmL滅菌的170mmol/L KH2PO4,0. 72mol/L K2HPO4的溶液(2. 31g的KH2PO4和12. 54gK2HP04溶在足量的水中，使 終體積為100mL。高壓滅菌或用O. 22um的濾膜過濾除菌)。K2HPO4, KH2PO4均購自國藥集團化學試劑有限公司，目錄號分別為10017528,1017628。以上生產培養基補料成分1，3-丙ニ醇和1，4_ 丁ニ醇。在實際培養過程中，可向上述培養基中再添加一定濃度的抗生素以維持質粒的穩定性，如100 μ g/mL氨節青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素。1,3-丙ニ醇、1，4- 丁ニ醇、3-羥基丙酸、4_羥基丁酸、3_羥基丙酸和4_羥基丁酸的共聚物的結構式及轉化關系見圖I所示，圖I中的I表示I，3-丙ニ醇脫氫酶，2表示醛脫氫酶，3表示3-羥基丙酸輔酶A連接酶，4表示4-羥基丁酸輔酶A轉移酶，5表示聚羥基脂肪酸聚合酶。實施例I、表達工程菌的構建一、表達載體pZQ03_orfz的構建I)以質粒 pKSSE5. 3 (Song, S. S.，Hein, S.，Steinbiichel, A.，1999. Productionof poly (4-hydroxybutyric acid)by fed-batch cultures of recombinant strains ofEscherichia coli. Biotechnol. Lett. 21,193-197 ;該 pKSSE5. 3 質粒是目前熟知的質粒，公眾可從清華大學獲得)為模板，以orfz Sense和orfz Antisense為引物,用pfu酶進行PCR反應擴增目的基因4-羥基丁酸輔酶A轉移酶基因(orfz)，并在片段兩端設計引入酶切位點。orfz Sense :5’ CGGTGTGGATCCCAAGGTGATG3’(序列 6)BamH Iorfz Ant i sense :5’ ATATAGGATCCCCGACTGGAAAGCG 3，(序列 7) BamH IPCR反應條件先94°C預變性 IOmin ;再 94°C變性 30 秒，58°C退火 30 秒，72°C延伸 lmin20 秒，30次循環；然后72°C后延伸10分鐘。PCR擴增目的片斷(20 μ L體系)模版DNA 0. 4 μ L (0. 05ug),引物 orfz Sense O. 5 μ L (0. 5ug),引物orfz Antisense 0. 5 μ L (0. 5ug) , pfu buffer 2. 0 μ L, pfu 酶 0.2yL(lU), dNTPI. 5 μ L (0. 0002mol)，ddH20 14. 9 μ しPCR擴增體系配制時，DNA聚合酶最后加入。得到的PCR產物，經過測序，該PCR產物具有序列表中的序列5的核苷酸序列，序列5由1290個核苷酸組成，即為4-羥基丁酸輔酶A轉移酶基因(orfz)核苷酸序列，自序列5的5'端第1-1290位核苷酸為編碼序列，編碼氨基酸殘基序列為序列表中序列12的蛋白。用BamH I 單酶切質粒 pZQ03 (Zhou, Q.，Shi，Ζ· Y.，Meng, D. C.，Wu，Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. ,2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinant Escherichia coli.Metab.Eng. 13,777-785.公眾可從清華大學獲得)得到線性酶切片段，與經BamH I酶切上述PCR產物得到的片段連接，得到連接產物，轉化到大腸桿菌E. coli Transl-Tl (北京全式金生物技術有限公司，CD501-01)中，得到轉化子，提取轉化子的質粒，測序，結果為該質粒為將序列表中的序列5反向插入到pZQ03的BamH I酶切位點得到的載體，該質粒記作pZQ03-orfz (質粒圖譜如圖5中B所示，orfz為4-羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因，pcs’為3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因，phaC為聚羥基脂肪酸聚合酶編碼基因，Amp為氨芐青霉素抗性基因，Re promoter表示來自于真氧產堿桿菌(Ralstonia eutropha)的啟動子序列，BamHI表示orfz兩端的BamHI酶切位點)。上述質粒pZQ03的序列中含有3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因和PHA聚合酶編碼基因；3_羥基丙酸輔酶A連接酶基因的核苷酸序列為序列表中序列3，自序列3的5'端第1-2571位核苷酸為編碼序列，其編碼的蛋白為3-羥基丙酸輔酶A連接酶；3_羥基丙酸輔酶A連接酶的氨基酸序列為序列表中序列10 ;PHA聚合酶基因的核苷酸序列為序列表中序列4，自序列41的5'端第1-1770位核苷酸為編碼序列，其編碼的蛋白為PHA聚合酶，PHA聚合酶的氨基酸序列為序列表中序列11。ニ、重組工程菌 E. coli S17-l(pZQ01, pZQ03-orfz)的構建將步驟一構建的表達載體pZQ03_orfz和pZQOl (質粒圖譜如圖5中A所示，dhaT為1，3_丙ニ醇脫氫酶編碼基因，aldD為醛脫氫酶編碼基因，Km為卡那霉素抗性基因，Repromoter表示來自于真氧產堿桿菌(Ralstonia eutropha)的啟動子序列,rep為復制起始子序列)。用電擊轉化法同時轉入到E. coii S17-1(ATCC編號47055，可購自美國菌種保藏中心 American Type Culture Collection)中，得到重組菌 I ；pZQ01 (Zhou, Q.，Shi, Z. Y.，Meng, D. C.，Wu, Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. , 2011. Production of 3-hydroxypropionatehomopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer byrecombinant Escherichia coli. Metab. Eng. 13, 777-785.公眾可從清華大學獲得)的序列中含有1，3_丙ニ醇脫氫酶編碼基因和醛脫氫酶編碼基因，1，3_丙ニ醇脫氫酶基因的核苷酸序列為序列表中序列1，自序列I的5'端第1-1185位核苷酸為編碼序列，編碼的蛋白為1，3-丙ニ醇脫氫酶，其氨基酸序列為序列表中序列8。將重組菌I涂布于添加100 μ g/mL氨節青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素的LB固體培養平板上，在37°C靜置培養12小時，挑取在固體平板上長出的單克隆，將其接種到添加100 μ g/mL氨芐青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中，在37°C、200rpm下搖床培養12小吋。從重組菌I中提取質粒，用引物orfz Sense和orfz Antisense進行PCR驗 證，可以擴增得到1290個核苷酸的片段的即為陽性重組菌，將獲得的陽性重組菌命名為E.coliS17-l(pZQOl, pZQ03-orfz)。
實施例2、用重組工程菌生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物P (3HP-CO-4HB)的實驗—、搖瓶培養摸索試驗‘I、以TB為培養基生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物P (3HP-co_4HB)重組工程菌Ε· coliS17-l(pZQ01, pZQ03-orfz)用 LB 培養基，在 37°C，200rpm 過夜培養；然后按5%接種量(v/v，10nCfu/ml)，分別接種至50mL含1，3_丙ニ醇(PDO)、1，4_ 丁ニ醇的TB培養基(BDO) (1，3_丙ニ醇、1，4_ 丁ニ醇的添加量如表I所述)中，于37°C，200rpm，搖瓶培養48小時，得到菌液。每個實驗處理設置三組平行實驗。運用氣相色譜儀(GC，GC-2014, SHIMADZU)驗證細胞中聚合物進行初步定性和定量分析(Kato，Μ.，Bao, H. J.，Kang, C. K.，Fukui，T.，Doi，Y.，1996. Production of a novel copolyesterof 3-hydroxybutyric acid and medium chain length3-hydroxyalkanaic acids byPseudomonas sp 61-3 from sugars. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45，363-370.)。氣相檢測3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的方法設定爐溫為80°C，進樣器溫度為200°C，檢測器溫度為220 °C，柱頭壓カ為
O.25Mpa，程序升溫條件為80°C停留I. 5分鐘，以30°C /min的速度升溫至140°C，接著以400C /min的速度升溫至220°C并在此溫度保持O. 5分鐘。樣品的進樣量為I μ 1，使用島津公司生產的自動進樣器。氣相樣品準備取40-60mg待測樣品的干細胞(菌液lOOOOrpm，10分鐘條件下離心，所得細胞沉淀水洗一次之后，冰干(真空度< lOPa，冷阱溫度為-50°C，處理10小吋)，得到冰干細胞，聚合物產于細胞中)，加2mL氯仿，2mL酯化液(純甲醇中含3% (v/v)的濃硫酸及2g/L苯甲酸作內標)于酯化管中，加蓋密封后于100°C下加熱4小吋。冷卻后加入ImL蒸餾水，充分振蕩后靜置，待氯仿相與水相完全分層后，取下層氯仿于進樣瓶中，運用氣相色譜儀(GC，GC-2014, SHIMADZU)進行定量和定性分析。標準樣品準備取30 μ I左右的30%濃度(體積濃度)3-羥基丙酸3ΗΡ(日本東京化成エ業株式會社(TCI)，產品目錄號Η0297)水溶液于酯化管中，加2mL氯仿，2mL酷化液，加蓋密封后在100°C進行酯化。在本實施例中的氣相檢測條件下，標準樣品在第2. 7分鐘有明顯出峰，表征酯化樣品中的3-羥基丙酸。取ΙΟμΙ的99%濃度的Y-丁內酯(美國Sigma-Aldrich公司,目錄號cat. B10, 360-8)于酯化管中，加2mL氯仿,2mL酉旨化液,加蓋密封后在100°C進行酯化。經氣相檢測，標準樣品在第3. Omin有明顯出峰，表征酯化樣品中的4-羥基丁酸。Y - 丁內酯是4-羥基丁酸的內酯結構，可替代市面上少見的4-羥基丁酸作為氣相檢測的標準樣品。以標準樣品為對照，如果待測細胞的酯化樣品(待測樣品)在2. 7分鐘有明顯的出峰，在第3. O分鐘也有明顯出峰，且無其它特異峰出現，說明待測細胞的酯化樣品存在3-羥基丙酸(3HP)單體和4-羥基丁酸(4HB)單體。因為在冰干細胞中3HP和4HB只能以聚合物的形式存在(因為單體3HP和4HB會從細胞里分泌到細胞外，所以細胞內檢測到的應該是聚合物)，所以可以證明有P(3HP-co-4HB)的積累。結果為E. coli S17-l(pZQ01,pZQ03-orfz)在2. 7分鐘有明顯的出峰，在第3. O分鐘也有明顯出峰，說明產生P (3HP-co-4HB)共聚物。通過分析氣相檢測得到的出峰面積和樣品量，可得到干細胞中含有共聚物的比重(wt%，重量百分含量)，以及培養體系中能夠生產的共聚物的濃度(g/L)。在含有1，3-丙ニ醇和/或1，4-丁ニ醇的TB培養基中培養E. coli S17_l(pZQ01，pZQ03-orfz)，48h后將菌液離心、水洗、冰干后得到干細胞待測樣品，并通過氣相色譜檢測，結果如表I所示。該結果證實了細胞中3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的產生。結果如表I所示。表ITB培養及不同條件下搖瓶培養的共聚物檢測結果
權利要求
1.產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的重組菌的構建方法，包括如下步驟將1，3_丙ニ醇脫氫酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因、3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因、4-羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因和PHA聚合酶編碼基因導入出發菌，得到重組菌。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述1，3-丙ニ醇脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列8 ;所述醛脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列9 ;所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶的氨基酸序列為序列表中序列10 ;所述PHA聚合酶的氨基酸序列為序列表中序列11 ；所述4-羥基丁酸輔酶A轉移酶的氨基酸序列為序列表中序列12。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述1，3-丙ニ醇脫氫酶基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述醛脫氫酶基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述PHA聚合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4 ;所述4-羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5 ;所述出發菌為大腸桿菌,優選為Escherichia coliS17_l。
4.根據權利要求I或2或3所述的方法，其特征在于 所述1，3_丙ニ醇脫氫酶編碼基因和所述醛脫氫酶編碼基因通過重組載體A導入所述出發菌中； 所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因、4-羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因和所述PHA聚合酶編碼基因通過重組載體B導入所述出發菌中； 所述重組載體A為pZQOl ； 所述重組載體B為將4-羥基丁酸輔酶A轉移酶的編碼基因插入到PZQ03的多克隆識別位點得到的重組載體。
5.由權利要求1-4中任一所述的方法構建的重組菌。
6.一種生產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的方法，包括如下步驟將權利要求4所述的重組菌用添加了 1，3_丙ニ醇和1，4_ 丁ニ醇的培養基培養，收集菌體，提取聚合物，即得到3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在干所述培養溫度為30°C-40°C，優選37°C；所述培養基的PH為6-8，優選為7。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在干所述培養基中的1，3_丙ニ醇或1，4_ 丁ニ醇含量均不高于20g/L;所述1，3_丙ニ醇、1，4_ 丁ニ醇在培養基中的濃度均優選為lg/L-20g/L ;所述培養時間為24-72小時，優選48小時；所述培養基為大腸桿菌培養基，優選為TB培養基，所述TB培養基含有24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，O. 017mol/L KH2PO4,0. 072mol/L Κ2ΗΡ04。
9.ー種產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的重組載體組合，重組載體A和重組載體B組成；所述重組載體A為pZQOl ;所述重組載體B為將4-羥基丁酸輔酶A轉移酶的編碼基因插入到PZQ03的多克隆識別位點得到的載體。
10.權利要求6-9中任意一項所述方法制備的3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物。
全文摘要
本發明公開了一種產3-羥基丙酸和4-羥基丁酸的共聚物的重組菌及其應用。該重組菌的構建方法，是將1，3-丙二醇脫氫酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因、3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因、4-羥基丁酸輔酶A轉移酶編碼基因和PHA聚合酶編碼基因導入出發菌，得到重組菌。本發明的工程菌在500mL容積搖瓶中生產后，P(3HP-co-4HB)的產量最高可達6.2g/L，P(3HP-co-4HB)最高可達細胞干重的63％。本發明生產工藝簡單，開生產的聚合物其熱力學性能可以通過調節3HP和4HB的比例實現變化；應用前景廣闊。
文檔編號C12N1/21GK102676567SQ201210132778
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者吳瓊, 周琴, 孟德川, 石振宇, 陳國強 申請人:清華大學