專利名稱：骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及細胞的培養方法。
背景技術：
巨噬細胞廣泛分布于全身各器官、組織，在保持內環境穩定、機體防御、炎癥調控、促進組織損傷修復方面起著重要作用。巨噬細胞在不同微環境下具有不同的表型，使巨噬細胞處于不同的功能狀態。這些功能狀態迥異的巨噬細胞在不同生理及病理條件下發揮不同的生理功能；與腫瘤、代謝綜合癥、糖尿病等嚴重疾病的發生、發展都有密切的聯系。靜息巨噬細胞在不同刺激條件下可激活分化為表型和功能迥異的兩大類型M1型和M2型。Ml型巨噬細胞主要引起Thl型免疫反應，起著細菌感染防御的作用；加重炎癥反應導致組織損傷。M2型巨噬細胞則主要誘導Th2型免疫反應，在防御寄生蟲感染，促進組 織修復和調節免疫反應方面起著重要作用。骨髓來源的巨噬細胞具有靜息巨噬細胞的特點即同源性好，通過不同的刺激條件可分別誘導分化為Ml型(經典激活型)和M2(選擇激活型)。另外，骨髓來源的巨噬細胞還具有產量高，易轉染，生長周期長等優點；其他巨噬細胞的體外培養方法，如從血液、腹腔、組織中分離提取獲得的巨噬細胞在體外培養。這種獲得巨噬細胞的方法雖簡單方便，得到的巨噬細胞往往均一性較差，產量低、存活時間短。特別是針對一些較難獲得的珍貴血液或組織標本，骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養尤為重要。
發明內容
本發明的目的在于提供一種巨曬細胞的體外誘導培養方法，該培養方法穩定性佳，能提高外誘導培養的骨髓來源的巨噬細胞的純度。為實現上述目的，本發明的技術方案為骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法，具體為將骨髓來源單個核細胞懸液在體外用培養基培養，在加入培養基培養前，還包括骨髓來源單個核細胞懸液的預處理步驟，具體為將所述骨髓來源單個核細胞懸液用濾孔為40 75 的濾器過濾，取過濾液進行培養。進一步，所述培養基為含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基。進一步，將所述骨髓來源單個核細胞懸液用濾孔為40 75 Pm的濾器過濾，將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心不多于10分鐘，去上清液，用含M-CSF的PRMI1640完全培養基重懸細胞制備單個核細胞懸液。進一步，含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基中含M-CSF的濃度為20ng/ml。所述的骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法的優選方案具體包括以下步驟A骨髓來源的細胞混合液的制備
用注射器吸取PBS緩沖液插入離體動物股骨兩端的軟骨處沖出股骨內的骨髓，收集骨髓來源的細胞混合液；B單個核細胞懸液的制備將步驟A所得的收集骨髓來源的細胞混合液混懸，得骨髓來源的單個核細胞懸液，用濾孔為70iim的濾器過濾,將過濾液在1500rmp/min條件下離心10分鐘,去上清液，用含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基重懸細胞，制備細胞重懸液；C第一階段細胞培養將步驟B所得細胞重懸液調節調節成濃度為1-2X106個/mL，置于培養箱中37°C、5%孵育24 30小時后，吸棄上清，另加入所述含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基，再培養48小時；D第二階段培養 在第一階段細胞培養完成后，不超過24小時對培養的細胞進行換液，另培養3-4日，得分化成熟的巨噬細胞。本發明的有益效果在于在骨髓來源的細胞混合液的制備過程中，不破壞股骨，在保持兩端完整的情況下利用壓力將單核細胞沖出股骨，然而阻止大量紅細胞和骨髓組織混入單細胞懸液。直接剪開股骨兩端將骨髓沖出，骨髓組織及凝結的紅細胞也都會隨之沖出，去除的股骨也含有大量細胞，此方法勢必會影響骨髓來源單個核細胞的分離和數量。然而，在保持兩端完整的情況下沖洗股骨，大大提高了單核細胞的純度和數量，降低紅細胞的數量，保證了單個核細胞懸液的質量。提高單核細胞的純度、降低紅細胞的數量會大大利于骨髓來源的巨噬細胞的誘導分化。在骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導分化培養過程中，紅細胞雖然會逐漸死亡，但是紅細胞的多少會大大影響巨噬細胞巨噬細胞的理化環境進而影響骨髓來源的巨噬細胞的分化成熟過程。從本實施例中發現，與剪開股骨兩端的情況相比，在保持兩端完整的情況下分離提取骨髓來源的單個核細胞后在體外誘導分化的骨髓來源的巨噬細胞的純度得到了大大提升。從本實施例中實際的培養結果發現，在保持兩端完整的情況下分離提取的骨髓來源的單個核細胞在第一階段的培養過程中，貼附在細胞培養板的巨噬細胞前體細胞數目大大增加，分化成熟所需的時間也縮短了。本實施例中培養的巨噬細胞分化成熟所需的時間與原來相比縮短了 I 2天。在細胞懸液的處理中，經過濾的細胞與未過濾的細胞相比，骨髓來源祖細胞的純度提高；未過濾的骨髓來源祖細胞的純度僅約為17%，經過濾后，骨髓來源祖細胞的純度提升到30%-40%。混入組織雜細胞污染的幾率也大大降低。未進行過濾處理的細胞懸液常常遭遇組織雜細胞的污染，組織雜細胞的長勢會蓋過巨噬細胞，從而使巨噬細胞不能分化成熟甚至死亡。進行過濾處理后的細胞懸液從未遭遇組織雜細胞的污染。
圖I為分化前的細胞照片。圖2為分化成熟的巨噬細胞照片。圖3為采用一次性細胞過濾器后得到的單個核細胞的純度檢測。圖4為未采用一次性細胞過濾器的單個核細胞的純度檢測。圖5為分化成熟的骨髓來源的巨噬細胞純度檢測圖，其中，A為空白對照，B為FITC-F4/80 單標，C 為 APC-CDllb 單標，D 為 FITC-F4/80、APC-CDllb 雙標。
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件進行或配置，未注明來源的產品均可通過市場途徑獲得。PBS緩沖液質量分數為0. 05 %吐溫-20的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(簡稱為PBS緩沖液)；配制方法為稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4),磷酸氫二鈉(Na2HPO4* 12H20)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，吐溫-20，加水。PBS緩沖液IL配方pH7. 4 :磷酸二氫鉀(KH2P04)0. 27g，磷酸氫二鈉(Na2HP04) :1.42g，氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) 0. 2g，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH至7. 4，最后定容到1L。高溫高壓滅菌后室溫保存。本實施例中采用的PBS緩沖液來自Hyclone SH30031. 02AVJ79106。M-CSF(巨曬細胞集落刺激因子)(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)來自 RD M-CSF Recombinant mouse M-CSF416-ML-010/CF ME1811071。PRMI1640 培養基來自 GIBCOC11875500BT。實施例I骨髓來源的細胞混合液的制備取6 8周大小鼠，脫頸致死，浸入體積為70%酒精中。運用鑷子夾起腹部上皮，用剪刀在小鼠腹部下方橫著剪開一個小口，分別夾住開口兩端向不同方向分開，暴露出小鼠腿部，用手拔出小鼠股骨和脛骨，使小鼠股骨與小鼠身體及脛骨從關節處分離，保持兩端完整。采用酒精浸潤的紗布去除股骨兩端關節連接處殘留的組織及軟骨。將取出的股骨在體積濃度為70%酒精中漂洗2 3次，再在PBS緩沖液中漂洗；提前準備5 IOml的PBS在離心管內，用ImL的注射器吸取離心管內的PBS緩沖液插入股骨的兩端的軟骨處，迅速沖出骨髓，重復2 3次，直到股骨變白，得骨髓來源的細胞混合液。此方法的優勢在于不破壞股骨，在保持兩端完整的情況下利用壓力將單核細胞沖出股骨，然而阻止大量紅細胞和骨髓組織混入單細胞懸液。與以往的方法相比，在保持兩端完整的情況下沖洗股骨，大大提高了單核細胞的純度和數量，降低紅細胞的數量，保證了單個核細胞懸液的質量。提高單核細胞的純度、降低紅細胞的數量會大大利于骨髓來源的巨噬細胞的誘導分化。在骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導分化培養過程中，紅細胞雖然會逐漸死亡，但是紅細胞的多少會大大影響巨噬細胞巨噬細胞的理化環境進而影響骨髓來源的巨噬細胞的分化成熟過程。從本實施例中發現，與剪開股骨兩端的情況相比，在保持兩端完整的情況下分離提取骨髓來源的細胞后在體外誘導分化的骨髓來源的巨噬細胞的純度得到了大大提升。采用的方法分離提取的骨髓來源的細胞在體外誘導分化的骨髓來源巨噬細胞純度達到了 90-95%以上,分化前的細胞如圖I所示,分化成熟的細胞如圖2所示；從圖2中可知，F4/80陽性率為90. 8%，⑶Ilb陽性率為98. 2% ;分化成熟的骨髓來源巨噬細胞F4/80、CDllb雙陽性率達到了 90. 6%。本實施例子中采用的方法分離提取的骨髓來源的細胞在體外誘導分化的骨髓來源巨噬細胞純度達到了 90. 6%以上。與其他方法相比，純度得到了大大提升。其中，圖3,圖4和圖5中涉及純度檢測的試驗方法參見www. BioleRend.com Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol。Joachim Weischenfeldt and Bo Porse在實驗方法中釆用剪刀剔除股骨及兩端殘留的組織及軟骨，且用剪刀直接打開股骨的兩端釋放骨髓。這個方法的缺點在于股骨上及兩端殘留的組織不易清除干凈而且在清除時極易損傷股骨導致骨髓污染；用剪刀直接打開股骨兩端不僅大大增加股骨的污染幾率，而且股骨中大塊的骨髓組織也會被沖洗出來，這樣不利于后續的單個核細胞懸液的制備。實施例2細胞懸液的處理將所述骨髓來源的細胞混合液輕輕用移液器吹打幾次制備單個核細胞懸液。吸取細胞懸液經過75 y m濾器(經多次試驗證明，40 m濾器也可實現)，轉入IOml的離心管中，1000 1500rmp/min離心不多于lOmin。去上清，用含有M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培養基輕輕吹打重懸細胞懸液制備單個核細胞懸液。“Ishii M，Wen HT,Corsa CAS,Liu TJ,Coelho AL, Allen RM, et al. Epigenetic regulation of the alternatively activatedmacrophage phenotype. Blood. 2009 ；114 (15) :3244_54” 一文中米用的骨髓來源的巨卩遼細胞的體外誘導培養方法沒有這一步；增加了這一步會大大提高骨髓來源祖細胞的純度，更、重要的也減少其他雜細胞污染的機會；如前面所述的操作步驟中股骨及兩端殘留的組織細胞的污染。本發明中采用了一次性的70 的過濾器過濾制備好的單核細胞懸液，過濾器會過濾掉骨髓組織和混入的大塊組織以及凝集的紅細胞。經過濾的細胞與未過濾的細胞相t匕，骨髓來源祖細胞的純度提高，混入組織雜細胞污染的幾率也大大降低。實施例3骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養對經實施例2過濾處理后的骨髓來源細胞進行細胞計數，確定細胞濃度，稀釋細胞懸液并調節細胞濃度至I 2X IO6個/ml。鋪板，將IX IO6個/ml的細胞懸液接種到6空培養板中，3ml/每孔。放在細胞培養箱中37°C、5%孵育30小時后，吸棄上清，并加入新的含M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培養基。吸棄上清的步驟非常關鍵，此步驟的意義在于純化巨噬細胞祖細胞，提高誘導分化的巨噬細胞的純度。未經吸棄上清這個關鍵步驟而直接將獲得的單個細胞懸液在體外誘導培養，部分死細胞或則非巨噬細胞祖細胞沒有得到及時清除會影響最后的骨髓來源的巨噬細胞的純度，在第一階段培養結束時，大部分細胞貼壁，細胞形態呈梭形、棒狀，培養過程中細胞不斷增殖和分化，細胞數目不斷增加，細胞慢慢由梭形向橢圓形轉變。這時更換新的M-CSF(20ng/ml)的PRMI 1640完全培養基，從第4天開始，每隔一天替換一次新的M-CSF(20ng/ml)的1640PRMI完全培養基。一定要及時更換培養基，因為此時細胞大量增殖、分化，對M-CSF的需求量大。在第七天的時候，細胞逐漸變大，形態從梭形變為橢圓形，此時，骨髓來源的細胞已經分化成成熟的巨噬細胞。本實施例中培養的巨噬細胞分化成熟所需的時間與原來相比縮短了 I 2天。在細胞懸液的處理中，經過濾的細胞與未過濾的細胞相比，骨髓來源祖細胞的純度提高；未過濾的骨髓來源祖細胞的純度最低僅約為17% ;如圖4所示，未過濾的骨髓來源祖細胞的純度最低僅約為19. 8%。經過濾后，骨髓來源祖細胞的純度提升到30% -40% ;如圖3所示骨髓來源祖細胞的純度提升到33.3%。混入組織雜細胞污染的幾率也大大降低。未進行過濾處理的細胞懸液常常遭遇組織雜細胞的污染，組織雜細胞的長勢會蓋過巨噬細胞，從而使巨噬細胞不能分化成熟甚至死亡。進行過濾處理后的細胞懸液從未遭遇組織雜細胞的污染。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技 術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法，其為將骨髓來源單個核細胞懸液在體外用培養基培養，其特征在于在加入培養基培養前，還包括骨髓來源單個核細胞懸液的預處理步驟，具體為將所述骨髓來源單個核細胞懸液用濾孔為40 75 μ m的濾器過濾，取過濾液進行培養。
2.根據權利要求I所述的骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法，其特征在于所述培養基為含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基。
3.根據權利要求2所述的骨髓來源的巨噬 細胞的體外誘導培養方法，其特征在于將所述骨髓來源單個核細胞懸液用濾孔為40 75 μ m的濾器過濾,將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心不多于10分鐘，去上清液，用含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基重懸細胞制備單個核細胞懸液。
4.根據權利要求2所述的骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法，其特征在于，含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基中含巨噬細胞集落刺激因子的濃度為20ng/ml。
5.根據權利要求4所述的骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法，具體包括以下步驟 A骨髓來源的細胞混合液的制備 用注射器吸取PBS緩沖液插入離體動物股骨兩端的軟骨處沖出股骨內的骨髓，收集骨髓來源的細胞混合液； B單個核細胞懸液的制備 將步驟A所得的收集骨髓來源的細胞混合液混懸，得骨髓來源的單個核細胞懸液，用濾孔為40 70 μ m的濾器過濾，將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心5 10分鐘，去上清液，用含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基重懸細胞，制備細胞重懸液； C第一階段細胞培養 將步驟B所得細胞重懸液調節調節成濃度為1-2X IO6個/mL，置于培養箱中37°C、5%孵育24 30小時后，吸棄上清，另加入所述含巨噬細胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養基，再培養48小時； D第二階段培養 在第一階段細胞培養完成后，不超過24小時對培養的細胞進行換液，另培養3 4日，得分化成熟的巨噬細胞。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，特別涉及細胞的培養方法，骨髓來源的巨噬細胞的體外誘導培養方法，具體為將骨髓來源單細胞懸液在體外用含M-CSF的PRMI1640完全培養基培養，在加入培養基培養前，還包括骨髓來源單細胞懸液的預處理步驟，具體為將所述骨髓來源單細胞懸液用濾孔為40～75μm的濾器過濾，取過濾液進行培養；本實施例中培養的巨噬細胞分化成熟所需的時間與原來相比縮短了1～2天；在細胞懸液的處理中，經過濾的細胞與未過濾的細胞相比，骨髓來源祖細胞的純度提高；未過濾的骨髓來源祖細胞的純度僅約為17％～20％，經過濾后，骨髓來源祖細胞的純度提升到30％-40％。
文檔編號C12N5/0786GK102732482SQ20121014811
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者吳玉章, 姜曼, 張志仁, 楊曉風, 楊琴 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學