專利名稱：一種灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和現代酶工程技術領域，具體涉及ー種來自灰產色鏈霉菌的海藻糖合成酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
海藻糖(Trehalose)是由兩分子葡萄糖以α，α _1，I糖苷鍵相連而成的非還原性ニ糖，是ー種安全、可靠的天然糖類，1832年由Wiggers將其從黑麥的麥角菌中首次提取出來，隨后的研究發現海藻糖在自然界中許多可食用動植物及微生物體內都廣泛存在，如人們日常生活中食用的蘑菇類、海藻類、豆類、蝦、面包、啤酒及酵母發酵食品中都有含量較高的海藻糖。海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干 燥失水等惡劣環境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。許多對外界惡劣環境表現出非凡抗逆耐受力的物種，都與它們體內存在大量的海藻糖有直接的關系。外源性的海藻糖同樣對生物體及生物大分子、生物膜具有良好的非特異性保護作用，它可以保護細胞免受由于環境變化(如脫水、高滲)造成的損害，具體表現為對生物膜、蛋白質和DNA等的有效保護，海藻糖因此在科學界素有“生命之糖”的美譽。國際權威的《自然》雜志曾在2000年7月發表了對海藻糖進行評價的專文，文中指出“對許多生命體而言，海藻糖的有與無，意味著生命或者死亡”。這ー獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優良活性保護劑以外，還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料，大大拓展了海藻糖作為天然食用甜味糖的功能。在醫學上已經成功地應用海藻糖替代血漿蛋白作為血液制品、疫苗、淋巴細胞、細胞組織等生物活性物質的穩定劑。不僅可以常溫條件下干燥存放，更重要的是可以防止因血源污染而引起こ肝、艾滋病等致命疾病的傳播，世界衛生組織對此十分重視。可見海藻糖的廣泛應用可以提高人類的生活和健康水平。在上世紀80年代的末期，海藻糖只能從含量甚微的天然微生物中提取，因而價格高達1000美元/kg ;后來，利用酵母提取海藻糖獲得成功，使海藻糖價格降低到300美元/kg以下。酵母提取法雖然大大價低了海藻糖的價格，但是無法進行大規模エ業化的生產，同時微生物培養的副產物較多増加了海藻糖精制的困難，回收率也較低，都導致海藻糖的生產成本很難再進ー步降低。1991年，意大利研究人員最早發現ー些耐熱古細菌的細胞提取物能將淀粉轉化成海藻糖，隨后日本研究人員對該酶做了分離純化的研究，并克隆到相關的海藻糖合成酶基因，實現了利用酶法來生產海藻糖，也使海藻糖價格降低到10美元/kg以下。海藻糖早期昂貴的價格限制了應用與開發的研究，海藻糖價格的降低就意味著海藻糖將更廣泛應用于醫藥食品等行業，這會大大促進相關產業的發展，也會加快海藻糖的應用開發研究。因此，研究開發更有效和生產成本更低的海藻糖生產技術，仍然是海藻糖廣泛應用于食品行業要解決的關鍵性問題。
微生物合成海藻糖的途徑可以分為三種第一種途徑是海藻糖磷酸化酶合成(0TSA-0TSB)途徑海藻糖磷酸化酶合成途徑先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脫磷酸后得到海藻糖。第二種途徑是麥芽寡糖基海藻糖合成酶(TreY-TreZ)途徑麥芽寡糖基海藻糖合成酶是先由麥芽寡糖基海藻糖合成酶以麥芽糊精(Maltodextrin)為底物,通過分子內轉糖基作用把麥芽糊精末端的兩個葡萄糖分子間的α, α-1,4糖苷鍵轉變成α，α -1，I糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖。然后麥芽寡糖基海藻糖在麥芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下從麥芽寡糖基海藻糖分子上水解下ー個海藻糖分子，而原來的麥芽糊精則轉變為減少了兩個葡萄糖基的新寡糖，并可作為新的底物進行下一輪反應，如此反復就可以將麥芽糊精轉化成海藻糖。
第三種途徑是海藻糖合成酶(TreS )途徑海藻糖合成酶途徑是以麥芽糖(Maltose)為底物，直接由海藻糖合成酶催化轉化麥芽糖生成海藻糖。三種途徑相比，第一種途徑需要用到價格昂貴的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖為底物來生產海藻糖，在生產成本很難產生競爭優勢；第二種和第三種途徑是以淀粉的水解產物麥芽糊精或者麥芽糖為底物生產海藻糖，在原料上具有很強的競爭優勢。第二種途徑需要兩種酶，在實際生產中要考慮兩種酶的生產設備和生產エ藝，還要考慮兩種酶的最適反應條件是否一致；而第三種途徑只需要ー種酶，在生產設備的占用率會更低，生產エ藝上會更簡単，因而具有更強的競爭優勢。目前已有不少文獻和專利報道了海藻糖合成相關基因的克隆和分離，以及這些海藻糖合成酶基因在制備海藻糖中的應用，但這些海藻糖合成相關酶的合成途徑不同，或者菌種來源不同，導致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚遠，酶的分子量、酶學特性以及酶對底物的轉化率也不同，而且目前得到的可エ業化應用的基因和專利不多。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種海藻糖合成酶。本發明的另一目的在于提供ー種海藻糖合成酶的編碼基因。本發明的另一目的在于提供ー種含有上述的海藻糖合成酶編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或轉基因重組菌。本發明的又一目的在于提供上述海藻糖合成酶編碼基因在表達海藻糖合成酶中的應用。本發明的又一目的在于提供ー種海藻糖合成酶及其編碼基因在制備海藻糖中的應用。本發明的又一目的在于提供一種制備海藻糖的方法。本發明的目的通過以下技術方案實現ー種海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本發明提供的海藻糖合成酶其編碼基因克隆自灰產色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes編號11007),命名為Sg-TreS,具有下述核苷酸序列之一
(I)序列表中的SEQ ID NO. I的核苷酸序列；(2)編碼序列表中SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多核苷酸。本發明是通過研究海藻糖合成酶基因的保守序列，然后設計相關的兼并PCR引物從灰產色鏈霉菌中克隆得到海藻糖合成酶的編碼基因。所采用的實驗方法，包括聚合酶鏈式反應(PCR)技術；DNA的提取、酶切、連接等DNA分子操作技術，以灰產色鏈霉菌總DNA為模板，擴增出一段可能為海藻糖合成酶編碼基因的DNA序列(Sg-TreS)，把這一段DNA序列連接到表達載體上如pET-30a等表達質粒上，然后導入大腸桿菌進行高效表達，獲得該基因表達的目的蛋白進行研究，確定基因的功能和酶學特性，證實了這一段DNA序列編碼的是ー種特性特征與前人發現不同的海藻糖合成酶。這些不同的特性特征包括基因來源不同、DNA序列和氨基酸序列的不同、酶的分子大小不同、酶的最適反應溫度和最適pH不同。目前尚無檢索到公開的文獻和專利等關于從灰產色鏈霉菌中克隆得到海藻糖合成酶基因 的報道，或者是關于利用灰產色鏈霉菌制備海藻糖的報道，因此可以判斷本發明屬于ー種新發明。從灰產色鏈霉菌得到的海藻糖合成酶具有以下特征I.該海藻糖合成酶的編碼基因長度為1716個堿基對，編碼572個氨基酸，分子量約為65. 9 kD2.該海藻糖合成酶的適合反應溫度為15 35°C，優選2(T25°C3.該海藻糖合成酶的適合應的pH在6. (Γ8. 0，優選pH為7. 0 7. 54. ニ價金屬離子的濃度在5m mol/L時，Cu2 +對該海藻糖合成酶活有明顯的抑制作用，而其它Fe3 +、Zn2 +、K1 +、Ca2 +、Mn2 +、Fe2 +和Ba2 +對該海藻糖合成酶活沒有抑制作用。5.在pH7. 5和25°C的反應條件下，以15%的麥芽糖為底物，反應140分鐘麥芽糖的轉化率達到最大值，隨著反應時間的増加海藻糖和麥芽糖的含量都會減少，而葡萄糖的含量會増加，但變化不大。上述的海藻糖合成酶編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或轉基因重組菌。所述的重組表達載體，為將上述的海藻糖合成酶編碼基因插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達海藻糖合成酶的重組表達載體；所述的大腸桿菌表達載體優選為pET-30a載體。所述的轉基因重組菌，是將上述的重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選得到表達海藻糖合成酶的轉基因重組菌；所述的大腸桿菌優選為大腸桿菌BL21 (DE3)。上述的海藻糖合成酶編碼基因在表達海藻糖合成酶中的應用。上述的海藻糖合成酶及其編碼基因在制備海藻糖中的應用。一種表達海藻糖合成酶的方法，是培養上述的轉基因重組菌得到海藻糖合成酶。—種制備海藻糖的方法，是以麥芽糖為底物，用上述的海藻糖合成酶進行催化反應，得到海藻糖；所述的反應溫度優選為15 35°C，最優選為2(T25°C，反應液的pH優選為6. 0 8. 0，最優選為7. 0 7. 5;反應底物的濃度為10% 50% (10 50 g/100 mL)，優選為10% 30% (10 30 g/100 mL)。本發明所述的海藻糖合成酶是以麥芽糖為底物，用海藻糖合成酶轉化麥芽糖能生成海藻糖，并能以濃度為109Γ50%的麥芽糖為反應底物，從而可以減少設備的占用率和生產后期濃縮的耗能，有利于降低生產成本。本發明所述的海藻糖合成酶在天然的灰產色鏈霉菌中含量也非常低，很難檢測到酶的活力，應用基因工程菌來表達本發明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高數千倍，可以用于海藻糖的生產。本發明與現有技術相比，具有實質性特點和顯著的優勢 I.目前報道的海藻糖合成酶的麥芽糖轉化率6(Γ80 %，降低反應溫度可以提高麥芽糖的轉化率，提高反應溫度會降低麥芽糖的轉化率，同時會增加副產物葡萄糖的生成，大多會產生10-30%的葡萄糖。本發明的海藻糖合成酶在25°C反應條件下，麥芽糖在轉化率達80%左右,及廣生較少的匍萄糖(5%以下)，這就有利于提聞底物的轉化效率，有利提聞原料的利用率降低生產成本，更具有市場競爭力。2.本發明中海藻糖合成酶的適合反應溫度范圍廣，在15_35°C都能保持較高的酶活力，這有利于在反應通過降低反應溫度來提高麥芽糖的轉化率，這也有利于降低生產成本。
3.除了 Cu2+對酶活力有明顯的抑制作用外，其它金屬離子Zn2 +、Fe3 +、K1 +、Ca2 +、Mn2 +、Fe2 +和Ba2 +對酶活都沒有明顯的抑制作用，這可以降低酶在生產中對水和淀粉麥芽糖糖漿純度的要求，避免生產過程中水和原料中金屬離子對酶活力的抑制，有利于提高生產ェ藝的穩定性。
圖I是兼并PCR擴增結果電泳圖。圖2是重組菌誘導表達海藻糖合成酶的SDS-PAGE圖。圖3是麥芽糖反應的HPLC分析圖。圖4是pH對酶活力的影響曲線圖。圖5是溫度對酶活力的影響曲線圖。圖6是反應時間對產物中各種糖含量影響曲線圖。圖7是金屬離子對酶活力的影響曲線圖。圖8是不同麥芽糖濃度對轉化率的影響曲線圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進ー步說明，下述實驗和實例所述內容屬于本發明的主要內容，有些對本領域專業人員來說屬于常規的實驗方法并未在本專利說明書中出現。I.灰色產色鏈霉菌的培養灰產色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)菌株編號11007,從中國エ業微生物菌種保藏管理中心購買，接種于以下培養基(克/升)葡萄糖4.0，酵母提取物10，麥芽提取物10，用KOH調pH至7. 0，然后在25-30°C恒溫搖床上振蕩培養至混濁，離心收集菌體用于總DNA的提取。2.灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶基因(Sg-TreS)的克隆通過比對海藻糖合成酶基因的保守序列進行比對分析，設計以下兼并PCR引物引物1:5' -ATGABCGTSAACGASCCCG -3'引物2:5' -TCAAVCGCGGCGGCCGATG-3'用設計好的引物以灰產色鏈霉菌總DNA為模板進行PCR擴增，PCR條件為94°C預變性2分鐘；94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 2分鐘；35個循環后72°C延伸10分鐘。將PCR擴增產物進行電泳檢測，結果表明獲得片段約為I. 7kb，結果見圖I中第2泳道，與預期結果相符，然后將PCR擴增產物純化后連接到TAKARA的pMD20_T載體上送到測序公司進行測序分析。經測序后得到的核苷酸序列為本發明序列表中SEQ ID NO. I。3. Sg-TreS表達及粗酶的制備根據測序得到灰產色鏈霉菌可能為海藻糖合成酶基因(Sg-TreS)核苷酸序列，設計相應引物擴增該Sg-TreS基因并連接到表達載體pET-30a上，然后導入大腸桿菌進行表達。設計引物如下上游引物5' - CAGCATATGATGATCGTCAACGAGCC -3'
下游引物5' - TAGCGGCCGCTCAAACGCGGCGGCCGA -3'上下游引物的5'端分別設計了 Nde I和Not I酶切位點用于連接到表達載體pET-30a，用設計好的引物擴增可能為海藻糖合成酶基因的DNA序列Sg-TreS，擴增產物用試劑盒純化回收目的擴增片段，然后利用Nde I和Not I進行雙酶切，與同樣利用Nde I和Not I進行雙酶切的表達載體pET-30a進行連接，連接產物經轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，篩選驗證得到表達重組質粒pET-Sg-TreS。把表達重組質粒pET-Sg-TreS轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的感受態細胞中，挑取轉化子于含50 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，在37°C搖床中培養，當0D600達到O. 8左右時，加入IPTG使其終濃度達到O. 5 mmol/L,繼續培養20小時進行誘導表達。誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發酵液體積的磷酸鹽緩沖液緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進行破胞，破胞至菌液澄清，12000 rpm/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清液即為海藻糖合成酶的粗酶液(SDS-PAGE分析結果如圖2所示)，可用于轉化麥芽糖的試驗。4.灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶的功能鑒定和轉化麥芽糖產物的分析利用高效液相色譜儀(HPLC)來進行海藻糖合成酶轉化麥芽糖后的產物分析，色譜柱為 Alltima Amino 100A 5u 柱(4. 6mmX 250mm);流動相為 75% こ臆/25% H2O0(I)灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶基因(Sg-TreS)的功能鑒定取制備得到的粗酶液20 μ L加到O. 5 mL的ρΗ7· O 10% (10 g/100 mL)麥芽糖溶液中，在25°C保溫反應I個小時，然后用HPLC分析反應的產物組分，結果見圖3，麥芽糖的反應樣和標準樣品比較，表明麥芽糖在酶的作用下生成海藻糖，這證明了所克隆的DNA片段是海藻糖合成酶基因，其在大腸桿菌表達的海藻糖合成酶具有催化麥芽糖生成海藻糖的功能。(2)最適反應pH值分析分別用pH為5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5和8. O的磷酸鹽緩沖液配制10% (10 g/100mL)的麥芽糖溶液，然后分別取O. 5 mL加入5 μ L的步驟3制備的粗酶液，分別在25V反應lh，然后用HPLC分析反應的產物組分，以生成海藻糖的含量來表示酶活力的大小，結果見圖4。結果表明海藻糖合成酶在pH6. 5-8. O都能維持較高的活力，最適反應pH為7. 0-7. 5。(3)最適反應溫度測定取0.5mL ρΗ7· 5的10% (10 g/100 mL)麥芽糖底物加入5 μ L酶液，然后分別在15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C和45°C不同的反應溫下保溫反應I小時，然后用HPLC分析反應的產物組分，以生成海藻糖的含量來表示酶活力的大小，結果見圖5。結果表明反應溫度在15-35°C酶都能表現出比較高的酶活力，最適反應溫度為20-25°C，但是在40°C條件時酶活迅速失活。(4)不同反應時間，產物中各種糖含量變化取O. 5mL pH7. 5的15% (15 g/100 mL)麥芽糖底物加入5 μ L酶液，在ρΗ7· 5和250C的條件下反應，每隔20分鐘取樣一次后測定反應體系中各種糖的含量，結果見圖6。結果表明反應140分鐘后海藻糖含量達到最大值，隨著反應時間的増加，反應體系中海藻糖生成量和麥芽糖含量都會減少，而葡萄糖的含量會増加，但在5個小時變化不大。
(5)金屬離子對酶活的影響取O. 5mL pH7. O的10%麥芽糖底物加酶液5 μ L后再加10 μ L金屬離子,使金屬離子在反應液的終濃度為5mmol/L，在25°C下反應I小吋，然后測定反應體系中麥芽糖的含量來反應酶活力的變化；取O. 5mL pH7. O的10% (10 g/100 mL)麥芽糖底物加酶液5 μ L后再加入10 μ L ρΗ7. O的磷酸鹽緩沖液作為空白對照，以空白対照的酶活力為100%，結果見圖7。表明在5 mmol/L的濃度的條件下Ni2+，Fe3+，Fe2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等ニ價金屬離子對該酶的活力基本沒有抑制作用，但Cu2+在5m mol/L的濃度時對該酶活力有很強抑制作用，導致麥芽糖轉化成海藻糖的效率很低。(6)不同濃度麥芽糖對酶轉化率的影響用pH7. O的磷酸鹽緩沖液分別配制10%、30%、50%的麥芽糖溶液，各取O. 5mL分別加5 μ L、10 μ L和20 μ L的酶液(取O. 5mL pH7. O的10%麥芽糖溶液，添加空宿主大腸桿菌BL21 (DE3)培養物的細胞破碎液上清液20 μ L為對照)；在25°C的條件下反應，每隔一個小時取樣一次測定反應體系的海藻糖的百分含量，結果見圖8，表明在底物濃度較低的條件下，反應體系中麥芽糖的轉化速度快，轉化率高，隨著反應底物濃度的升高，需要延長反應時間才能提高麥芽糖的轉化率。5.從市售麥芽糖漿制備海藻糖取市售以淀粉制備麥芽糖含量為85% (85g/100 mL)的超高麥芽糖漿O. 353 kg,用5 mol/L,pH為7. O磷酸鹽緩沖液配制成I升含30%(30 g/100 mL)麥芽糖的反應底物，置于燒杯中加入前面制備的海藻糖粗酶液200mL，然后在25°C條件下保溫反應，每隔5小時取樣用HPLC測定反應體系中的海藻糖含量，直至海藻糖含量達到最大值。結果表明反應20小時后反應體系中海藻糖含量達到最大值，海藻糖的百分濃度為19.8%(19.8 g/100 mL),反應體系中葡萄糖的含量低于5%。經計算海藻糖的質量為I. 2升X 19. 8% (O. 198 kg/L)^ O. 2376 kg。也就是說O. 353kg的麥芽糖漿經過海藻糖合成酶的轉化可以得到O. 2376kg的海藻糖，以商品的糖漿計算海藻糖得率為67. 31%，以糖漿的中純麥芽糖計算，麥芽糖的轉化率為79. 2%。
權利要求
1.ー種海藻糖合成酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
2.權利要求I所述的海藻糖合成酶的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的海藻糖合成酶的編碼基因，其特征在于所述的海藻糖合成酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一 (1)序列表中的SEQID NO. I的核苷酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO. 2氨基酸序列的多核苷酸。
4.含有權利要求2或3所述的海藻糖合成酶編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或轉基因重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組表達載體為將權利要求2或3所述的海藻糖合成酶編碼基因插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達海藻糖合成酶的重組表達載體；所述的大腸桿菌表達載體優選為pET-30a載體。
6.根據權利要求4所述的轉基因重組菌，其特征在于所述的轉基因重組菌是將權利要求4或5所述重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選得到表達海藻糖合成酶的轉基因重組菌；所述的大腸桿菌優選為大腸桿菌BL21 (DE3)。
7.權利要求2或3所述的海藻糖合成酶編碼基因在表達海藻糖合成酶中的應用。
8.權利要求I所述的海藻糖合成酶及其編碼基因在制備海藻糖中的應用。
9.一種表達海藻糖合成酶的方法，是培養權利要求4或6所述的轉基因重組菌得到海藻糖合成酶。
10.一種制備海藻糖的方法，其特征在于是以麥芽糖漿為底物，用權利要求I所述的海藻糖合成酶進行催化反應，得到海藻糖；所述的反應溫度優選為15 35°C，最優選為20 25°C，反應液的pH優選為6. (Γ8. 0，最優選為7. 0 7. 5 ;反應底物的濃度優選為10% 50%，優選為10% 30%。
全文摘要
本發明公開一種灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶及其編碼基因與應用，該海藻糖合成酶基因從灰產色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)克隆到，該海藻糖合成酶能轉化麥芽糖生成海藻糖，酶的適合反應溫度為15～35℃，優選20～25℃，酶的適合應的pH在6.0～8.0，優選pH為7.0～7.5。該酶轉化效率高，以麥芽糖為底物，在25℃反應條件下，麥芽糖在轉化率達80％左右，及產生較少的葡萄糖，在5％以下，這有利提高底物的轉化率，該酶能夠用于轉化商品化的超高麥芽糖漿制備海藻糖，可為工業化利用酶法生產海藻糖提供一種新的方法。
文檔編號C12N1/21GK102690795SQ20121016040
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者李霜, 江凌, 賀滄, 黃和 申請人:南京工業大學