專利名稱：一種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法
技術領域：
本發明涉及ー種縊蟶種質鑒定，具體說，涉及ー種利用線粒體分子標記鑒定縊蟶群體的方法。
背景技術：
縊蟶是我國四大海產養殖貝類之一，具有生長快、養殖周期短、易管理、產量高、效益好等養殖特點。據統計，我國貝類的養殖產量占海水養殖總產量的82%。灘涂貝類的年產量近200萬噸，其中縊蟶的產量就已經達到了 70萬噸，約占我國灘涂貝類養殖總產量的30%，在我國海水養殖中占有重要的地位。例如，我國浙江和福建一帯沿海是縊蟶的重要苗種產區，被運輸到其他沿海城市 進行養殖和銷售。近幾年，隨著縊蟶養殖規模的不斷擴大，江蘇和上海沿海灘涂也逐步開始引種養殖。異地苗種引進和養殖容易導致異地苗種與土著苗種的混雜，因此如何區分不同地區苗種以期進行后期苗種選擇，種質資源保護和良種選育工作成為重要的課題。由于不同群體縊蟶表型相近，且容易受到環境因素的影響，因此依靠表型進行群體鑒別具有相當困難。線粒體屬于母系遺傳，變異速度較快，采用線粒體分子標記進行縊蟶群體的鑒別是非常可靠的分子生物學方法。
發明內容
本發明的目的是提供ー種利用線粒體分子標記鑒定縊蟶群體的方法，該方法可靠性高。為實現本發明的目的，本發明的技術方案是ー種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，該方法包括以下步驟( I)采集縊蟶個體，提取DNA ；(2)合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物；(3)對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I (COI)基因進行PCR擴增；(4)對PCR產物進行純化；(5)對純化的PCR產物進行測序和序列比對。在本發明的一優選實施例中，步驟(I)中，所述標記引物為Sc-COI-F :5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’ ；Sc-COI-R :5，TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AATCA 3。在本發明的一優選實施例中，步驟(2)中，所述PCR擴增程序為(a) 94°C預變性3min,進行35個循環(b)94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 50s ；(c)最后 72°C延伸 lOmin。在本發明的一優選實施例中，步驟(2)中，所述PCR擴增所用反應體系為25 ii L，含IOXBuffer 2. 5 u L, Mg2+2. OmmoI/dm3, dNTPO. 2mmol/dm3, TaqDNA 聚合酶 IU，上、下游引物各 0. 2 Ii mol/dm3,模板 DNA50_100ng。本發明的方法，鑒別方法簡單，可靠性強。
圖I是縊蟶江滬群體和浙閩群體的線粒體分子標記細胞色素氧化酶I(COI)序列。其中“*”表示江滬群體和浙閩群體的保守位點，“ ”表示鑒別江滬群體和浙閩群體的堿基位點，JSSc, SHSc, ZJSc和FJSc分別表示江蘇，上海，浙江和福建縊蟶個體。
具體實施例方式下面結合實施例進ー步說明本發明。 實施例I :利用本發明的方法，對縊蟶江滬群體和浙閩群體進行鑒別。(I)采集江蘇、上海、浙江和福建沿海灘涂的縊蟶個體，提取DNA ；在我國江蘇、上海、浙江和福建沿海灘涂隨機采集縊蟶個體。利用解剖刀和鑷子分別收集四個地區的縊蟶個體的外套膜組織，置于無水こ醇中保存備用。采用酚氯仿抽提法進行DNA抽提，具體方法如下。每個樣本取0. 5g外套膜組織剪碎后，加入 500 u L 組織勻衆緩沖液(10mmol/dm3 Tris-Hcl, PH=8. 0; 50mmoI /dm3 EDTA,PH=8. 0)，混勻后加入終濃度為1%的SDS和200 u g/cm3的蛋白酶K，55°C消化澄清。利用飽和酚抽提I次，然后利用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)提取2次，再次利用氯仿異戊醇(24 1)抽提I次，最后加入2倍體積預冷的無水こ醇沉淀，70%こ醇洗滌兩遍后干燥，無菌水溶解DNA。紫外分光光度計測定樣品DNA的0D260、0D280值，確定其濃度和純度，母液置于_20°C保存。(2)合成線粒體細胞色素氧化酶I (COI)引物；線粒體細胞色素氧化酶I (COI)引物的合成，采用固相亞磷酰胺三酯法，由DNA合成儀合成引物堿基序列，通過PAGE法純化弓I物。序列為Sc-COI-F:5，GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG 3，；Sc-C0I-R :5，TAAACTTCAGGGTGACCA AAA AATCA 3’(3)線粒體細胞色素氧化酶I (COI)的PCR擴增利用合成的引物進行細胞色素氧化酶I (COI)的PCR擴增，擴增反應在德國艾本德PCR儀上進行，具體實施如下PCR擴增程序94°C預變性3min，進行35個循環94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸50s，最后72°C延伸IOmin0PCR 擴增所用反應體系為 25 ii L，含 IOXBuffer 2. 5 u L, Mg2+2. Ommo I/dm3,dNTPO. 2mmol/dm3, TaqDNA 聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2 y mol/dm3，模板 DNA50_100ng。(4 )對PCR產物進行純化；PCR擴增產物經I. 5%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成像系統下將PCR產物進行切膠回收，利用PCR產物純化試劑盒進行純化，具體操作步驟參考純化試劑盒說明書(購自上海生エ生物工程有限公司)。( 5 )對純化的PCR產物進行測序和序列比對采用ABI3730測序儀進行PCR產物雙向測序,測序引物為PCR擴增引物。測序結果經過拼接校對后，利用 Clustal W2 軟件(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)進行序列比對，獲得不同序列間的保守堿基和變異堿基，通過變異堿基鑒定不同地區的縊蟶群體。本實施例中鑒別縊蟶兩個群體的線粒體分子標記細胞色素氧化鎂I (COI)序列為圖I所示。由縊蟶江滬群體和浙閩群體共計4個體線粒體COI基因400bp序列的排序結果可以看出，兩個群體存在21個堿基變異，包括17個轉化和4個顛換，分別為第8，35，59，125，131，134，137，155，170，188，275，281，290，331，332 堿基為 A-G 轉換，156，347 堿基為 C-T 轉換，第140，249，269堿基為C-G顛換，第251堿基為A-T顛換。該結果穩定，可重復性強，鑒別方法簡單，可以作為鑒別縊蟶江滬群體和浙閩的分子標記。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術·人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入本發明要求保護的范圍內。本發明要求保護的范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.ー種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)采集縊蟶個體，提取DNA； (2)合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物； (3)對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因進行PCR擴增； (4)對PCR產物進行純化； (5)對純化的PCR產物進行測序和序列比對。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述標記引物為Sc-COI-F :5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’ ；Sc-COI-R :5’ TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AATCA 3。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增程序為 (a)94°C預變性3min,進行35個循環 (b)94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 50s ； (c)最后72°C延伸 IOmin0
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增所用反應體系為 25 ii L，含 10 XBuffer 2. 5u L,Mg2+2. Ommol/dm3, dNTPO. 2mmol/dm3，TaqDNA聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2 ii mol/dm3,模板 DNA50_100ng。
全文摘要
本發明涉及一種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，該方法包括步驟(1)采集縊蟶個體，提取DNA；(2)合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物；(3)對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因進行PCR擴增；(4)對PCR產物進行純化；(5)對純化的PCR產物進行測序和序列比對。該方法該結果穩定，可重復性強，鑒別方法簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102776278SQ20121016824
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者李家樂, 沈和定, 牛東紅, 王劦, 金凱 申請人:上海海洋大學