專利名稱：一種烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法
技術領域：
本發明涉及一種烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，屬于微生物學領域的微生物細胞的分離、提取與純化方法。
背景技術：
烤煙煙葉中目前已探明的化學成分己達5500余種，包括多糖、蛋白質和煙堿等，其中絕大部分是微生物活動需要的營養物質。這些物質具有親水性，易從空氣中吸收水分，為微生物活動提供必要的水分條件。煙葉經過初烤、倉儲、復烤、自然醇化、卷煙配方、卷煙制絲、煙支制卷、卷煙包裝等生產工藝流程，表面和內部和寄附了大量微生物。由于煙葉吸濕性強，而且含有微生物生長所需要的各種營養物質，一旦條件適宜，煙葉極易滋生各種微生物，分解煙葉中的有機物質。在烤煙型卷煙生產中，煙草葉面微生物的活動對煙葉初烤、倉儲、復烤、自然醇化產生極其重要的影響。因此，自19世紀50年代中葉人們就開始對微生物在煙草中的作用進行研究，至今已取得了大量的研究成果，其中涉及最多的是有害微生物的控制與有益微生物利用研究。尤其是利用研究，現今仍是一個熱門的研究課題。以往對煙草葉面微生物的主要研究采用傳統的純培養方法，而煙葉微生物生態群落是一個非常復雜的生物體系，有著巨大的基因資源以及豐富的生態資源。自然界能夠分離培養的微生物不到I %，絕大部分微生物是不可培養或未培養的微生物。現階段所開展的以基礎微生物研究方法對煙葉微生物進行分離培養的微生物區系研究，對煙葉微生物群落的認識主要基于實驗室純培養的單一微生物物種，對微生物群落作為整體的性能認識是不足或片面的，不能揭示其余大量的微生物，以至對煙葉中微生物的多樣性認識以偏概全。近年來，通過直接對樣品的DNA分析揭示其微生物種類的技術得到了較大發展，已建立起了許多不需要對微生物進行獨立培養的新方法和新技術。如變性梯度凝膠電泳DGGE法、機擴增多態性DNA技術RAPD和限制片段長度多態性RFLP等。宏基因組學技術是近來發展比較迅速的一種新方法。這種方法從環境樣品中直接提取微生物基因組DNA(宏基因組)并克隆于不同載體，再將重組載體轉移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫，同時結合不同的篩選技術，從基因文庫中篩選新基因或新的生物活性物質。這些免培養技術可不通過對微生物進行培養的方法，為人們在一定程度上了解煙葉微生物區系的復雜性，以及微生物與煙葉之間的相互作用，開辟了一條嶄新的道路。因此，從烤煙煙葉中盡可能完整地提取與純化微生物，對于采用免培養技術研究烤煙煙葉微生物的群落結構組成，揭示在煙葉加工過程中更加豐富、全面的煙葉微生物群落信息，提供有關煙葉微生物種間相互作用關系及其生物功能的新信息，系統地剖析煙葉微生物群落的多樣性和動態變化，較全面了解大煙葉微生物群落的代謝機理具有重要意義。同時，對于考察煙葉微生物基因多樣性、種群結構與群落復雜性，探索煙葉環境中微生物種群特征，了解煙葉生態系統中微生物群落結構及在煙葉環境中的生存機制亦具有重要科學價值。
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發明內容
從烤煙煙葉中富集和純化微生物，去除非微生物雜質，盡可能完整地保持微生物多樣性，是進行烤煙煙葉微生物免培養技術研究的前提。為實現上述目的，本發明的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法由以下步驟組成(I)用0 1.0%氯化鈉，0.01% 0. I %吐溫80水溶液浸泡烤煙煙葉并振蕩洗漆，控制分散劑與烤煙煙葉的質量比為I : 10 I : 40，振蕩洗滌時間為10 30分鐘，然后用20 40目分樣篩除去煙葉殘渣，制備煙葉微生物懸浮液；(2)上述煙葉微生物懸浮液用孔徑為30 120微米的濾布減壓過濾，濾餅用分散 劑洗滌，得濾液A和濾餅A ;(3)上述濾液A用硅藻土減壓預涂層過濾，控制預涂膜厚度I 10mm，每平方米過濾面積預涂500 IOOOg娃藻土,濾餅用分散劑洗漆，得濾液B和濾餅B ；(4)上述濾液B用孔徑為0. 2微米的微孔濾膜減壓過濾，濾餅用分散劑洗滌，得濾餅C ；(5)合并混勻上述濾餅A、濾餅B和濾餅C，即得富集和純化的烤煙煙葉微生物。本發明的方法對烤煙煙葉微生物進行分級過濾富集和多次洗滌純化，步驟簡單，容易操作，富集效率高，適合任何樣本容量的烤煙煙葉微生物富集和純化，特別適用于大容量樣本的烤煙煙葉微生物富集和純化。
圖I為煙葉微生物懸浮液分別經濾布、硅藻土和微孔濾膜減壓過濾和分散劑洗滌后，濾布、硅藻土和微孔濾膜上微生物的濾餅顯微鏡檢圖。圖2為富集和純化的烤煙煙葉微生物基因組DNA提取和PCR擴增結果圖。
具體實施例方式實施例I :IOOOg霉變煙葉，置于15L分散劑中振蕩浸泡10分鐘，然后用20目分樣篩除去煙葉殘渣，重復三次，總計制得煙葉微生物懸浮液45L。取40L煙葉微生物懸浮液分別經濾布、硅藻土和微孔濾膜減壓過濾和分散劑洗滌，分別收集濾布、硅藻土和微孔濾膜上的濾餅及濾液，顯微鏡檢查每個樣本中的微生物。圖I表明，煙葉微生物懸浮液經濾布過濾后，濾布上的濾餅中濃縮了大量真菌菌絲體和孢子及細菌；硅藻土和微孔濾膜上的濾餅中主要是細菌。經過微孔濾膜后的濾液中基本上檢測不出細菌和真菌。實施例2 本實施例對本發明方法各個步驟中富集和純化的微生物進行基因組DNA提取、細菌16SrDNA片段和真菌rDNA ITS區間擴增，進一步從分子生物學角度驗證了本發明的方法。從實施例I中其余的5L中取IOOmL煙葉微生物懸浮液，IOOOOrpm離心IOmin收集菌體(樣品I)。分別對實施例I中濾布(樣品2)、硅藻土(樣品3)和微孔濾膜(樣品4)上的濾餅稱重，按IOOmL煙葉微生物懸浮液應得濾餅比例取樣，合并所有濾餅，再按比例取樣(樣品5)。上述5個樣品在液氮中研磨至粉末狀，迅速放入1.5ml EP管中，按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-10柱式植物基因組抽提試劑盒SK1024操作說明提取DNA。采用北京全式金生物技術有限公司Easy Taq DNA Polymerase分別對 5 個樣品的細菌 16S rDNA 片段(E. coli，8-27 :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，E. coli，1541-1522 :5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)和真菌 rDNA ITS 區間(ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3 '，ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')進行 PCR 擴增。圖2表明，從上述5個樣品均提取到完整的基因組DNA，并擴增出細菌16S rDNA片段和真菌rDNA ITS區間。圖2顯示，微孔濾膜濾餅中真菌DNA含量低，因此rDNA ITS區間擴增帶較弱，與顯微鏡檢查結果一致。權利要求
1.一種烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征在于由以下步驟組成 (1)用分散劑浸泡烤煙煙葉并振蕩洗滌，然后用分樣篩除去煙葉殘渣，制備煙葉微生物懸浮液； (2)上述煙葉微生物懸浮液用濾布減壓過濾，濾餅用分散劑洗滌，收集濾液A和濾餅A ； (3)上述濾液A用硅藻土減壓過濾，濾餅用分散劑洗滌，收集濾液B和濾餅B； (4)上述濾液B用微孔濾膜減壓過濾，濾餅用分散劑洗滌，收集濾餅C； (5)上述濾餅A、濾餅B和濾餅C合并混勻，即得富集和純化的烤煙煙葉微生物。
2.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟⑴中分散劑組成為0 1.0%氯化鈉，O. 01% O. 1%吐溫80，其余成分為去離子水。
3.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟(I)中分散劑與烤煙煙葉的質量比為I : 10 I : 40。
4.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟(I)中振蕩洗滌時間為10 30分鐘。
5.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟(I)中分樣篩目數為20 40目。
6.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟⑵中的濾布孔徑為30 120微米。
7.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟(3)中硅藻土減壓過濾為預涂層過濾，預涂膜厚度I 10_，每平方米過濾面積預涂500 IOOOg 娃藻土。
8.根據權利要求I所述的烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法，其特征是所述的步驟(4)中微孔濾膜的孔徑為O. 2微米。
全文摘要
本發明涉及一種烤煙煙葉中微生物的富集與純化方法。烤煙煙葉用分散劑浸泡和振蕩洗滌后，過分樣篩除去煙葉殘渣，制備煙葉微生物懸浮液。煙葉微生物懸浮液分別經濾布、硅藻土和微孔濾膜減壓過濾和分散劑洗滌，分別收集濾布、硅藻土和微孔濾膜上的濾餅，即得富集和純化的烤煙煙葉微生物。本發明的方法對烤煙煙葉微生物進行分級過濾富集和多次洗滌純化，步驟簡單，容易操作，富集效率高，適合任何樣本容量的烤煙煙葉微生物富集和純化，特別適用于大容量樣本的烤煙煙葉微生物富集和純化。
文檔編號C12N1/14GK102676436SQ201210168688
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月28日 優先權日2012年5月28日
發明者李慶華, 李文鵬, 胡偉, 蘇羅毅, 袁逢春, 飛旭云 申請人:云南大學, 紅云紅河煙草(集團)有限責任公司