專利名稱：與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的snp標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及一種與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用。
背景技術：
奶業的發展對于改善人們的膳食結構，增強國民體質，促進經濟發展等方面，都具有重要作用。奶牛產業是奶業發展的龍頭產業，而我國奶牛產業的發展水平明顯落后于世界發達國家，總產奶量占世界總量的不足6%，人均占有量僅為世界平均水平的四分之一，奶牛單產不到世界發達國家的一半。以擴充奶牛數量提高產奶總量的傳統發展模式易受到空間和發展規模的限制，影響了奶農養殖的積極性。因此，培育高產奶牛群體已成為我國奶牛產業發展的關鍵。只有不斷改良奶牛群體的遺傳水平，才能從根本上提高其經濟性狀的生產性能，從而促進我國奶牛產業持續健康發展。 隨著分子數量遺傳學、分子生物學技術的飛速發展，有關分子遺傳標記和標記輔助選擇的研究被廣泛開展，并在畜禽育種中應用，產生了巨大的影響。PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)是在PCR技術基礎上發展起來的，其基本原理是用PCR擴增目的DNA片段，擴增產物用特異性限制性內切酶消化切割成不同大小片段，直接利用凝膠電泳圖進行分析。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶，從而達到鑒定不同基因型的目的。分子育種，即分子標記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標記對育種材料進行選擇，綜合改良畜禽重要經濟性狀，是傳統遺傳育種與現代分子生物學有機結合的育種方法。分子育種為家畜育種開辟了一條新的途徑，隨著現代生物技術的發展，分子標記在家畜育種中的作用將日益突出。在奶牛育種中，人們希望選擇與產奶性狀密切相關，且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記，以實現早期選種和提高育種準確性的目標，從而加快遺傳育種進程。
發明內容
本發明的目的是提供一種與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用。本發明的另一目的是提供用于檢測所述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記的引物及含有該引物的試劑盒。為了實現本發明目的，本發明的一種與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記，其位于中國荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列的227bp處，此處堿基為T的中國荷斯坦奶牛的產奶量、乳蛋白含量顯著高于此處堿基為G的中國荷斯坦奶牛，而乳脂率前者顯著低于后者。本發明還提供用于檢測上述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記的引物，包括正向引物 F5’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3’和反向引物 R5' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3'。本發明還提供上述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記在鑒定產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種中的應用，其包括步驟1)提取待測中國荷斯坦奶牛的基因組DNA ；2)以待測中國荷斯坦奶牛的基因組DNA為模版，利用所述引物F和R，通過PCR反應擴增出中國荷斯坦奶牛PTK2基因496bp片段；3)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中227bp處的堿基為T，則待測中國荷斯坦奶牛屬于產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種。前述應用中，步驟2)中PCR反應使用的擴增體系以25 ill計為50ng/ill模板DNAl u 1，10pmol/u I 弓I物 F 和 R 各 I y 1，IOmmoI/L dNTPmix2. 0 u l,5U/u L Taq DNA 聚合酶0. 125 iil，IOXPCR反應緩沖液2.5 iil，余量為水。前述應用中，步驟2)中PCR反應的條件為94°C5分鐘；94°C 30秒，47. 5°C 35秒，72 0C 35秒，34個循環；72°C 10分鐘。前述應用中，步驟3)中檢測PCR擴增產物采用RFLP法，具體為用內切酶NlaIII對PCR擴增產物進行酶切，并對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 如果檢測結果僅為一條帶，則待測中國荷斯坦奶牛屬于產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種，檢測結果出現兩條帶，則待測中國荷斯坦奶牛屬于普通品種。本發明還提供含有所述引物F和R的用于檢測中國荷斯坦奶牛產奶性狀的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。優選所述試劑盒還包括標準陽性模板。本發明進一步提供所述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記在中國荷斯坦奶牛分子標記輔助育種中的應用。本發明利用中國荷斯坦奶牛的PTK2基因的SNP位點進行基因分型，并對該基因的T227G與奶牛的產奶性狀進行關聯分析，通過SAS9. 0軟件Mixed過程進行線性模擬分析發現，TT基因型個體的產奶量、乳蛋白量顯著高于TG、GG基因型個體(P < 0. 05)，乳脂率顯著低于GG基因型個體(P<0.05)。該多態位點的檢出，既為分子育種提供了新的素材，又為中國荷斯坦奶牛產奶性狀的標記輔助選擇提供了科學依據。本發明提供了一種與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用，既采用聚合酶鏈式反應(PCR)和測序技術篩選到與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記，并通過限制片段多態性(RFLP)方法來檢測待測中國荷斯坦奶牛的基因型，根據基因型進行產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種的選育，從而加快中國荷斯坦奶牛的育種進程。本發明優點在于(一)本發明提供的分子遺傳標記不受中國荷斯坦奶牛的年齡、性別等限制，可用于中國荷斯坦奶牛的早期選育，甚至在中國荷斯坦奶牛剛出生時就可準確地進行篩選，可大大加快中國荷斯坦奶牛的育種進程；(二)檢測方法準確。
圖I為PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；其中，M DL2000DNAMarkero圖2為本發明中國荷斯坦奶牛三種基因型的測序峰圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例I與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記的獲得I. I中國荷斯坦奶牛血液DNA提取
本實施例中使用的牛血樣為_20°C保存的凝結牛全血，全血分為血凝塊和血清，血凝塊為黯紅色,血清呈清亮黃色,血液中只有白細胞內含有DNA，白細胞主要存在于血凝塊部分。采用天根血液DNA提取試劑盒從血塊中提取基因組DNA，按照試劑盒說明稍作調整，具體步驟如下I)預備2mL已滅菌的圓底離心管，每個管內放置一顆潔凈鋼珠(直徑約 5mm-6mm)；2)取出血液樣品，融化后，用手術剪刀剪取約200 ii 1-300 U I凝血塊于離心管中。加入600 u I細胞裂解液CL，放入Qiangen組織研磨器中，以30次/秒的頻率研磨5分鐘，放置在55°C烘箱中處理2-3分鐘，其間顛倒混勻數次，取出鋼珠丟棄；3) 10, OOOrpm離心lmin，棄去暗紅色上清；4)再次加入600 U I細胞裂解液CL，振蕩器振蕩使沉淀物散開懸浮，10，OOOrpm離心lmin,棄去上清；5)加入200 U I緩沖液GS，用渦旋儀充分懸浮血塊顆粒；6)加入20 ill蛋白酶K，220 ill緩沖液GB，充分晃動混勻；7) 55°C轉爐中過夜消化，消化初始階段，要顛倒混勻數次以促進消化過程，直至溶液變澄清透明，一般為淺棕色；8)加入200 U I冰鎮無水乙醇，輕輕上下顛倒混勻，5000轉/分離心2分鐘，將雜質如牛毛等沉淀至管底。將離心管中液體轉移到吸附柱中，12，OOOrpm離心30s，棄去收集管中的廢液，未離心完全的再次離心；9)向吸附柱中加入500 ill去蛋白液⑶，靜置2分鐘，12，OOOrpm離心30s，棄去收
集管中廢液；10)向吸附柱中加入700 U I漂洗液PW，靜置2分鐘，12，OOOrpm離心30s，棄去廢液；11)重復上一步；12) 12, OOOrpm 離心 2min ；13)將吸附柱轉移到新的I. 5mL離心管中，開口在55°C烘箱中晾置2分鐘，至乙醇揮發完全；14)加入100 U I預熱的洗脫緩沖液TB，蓋蓋在55°C烘箱中靜置2min ；15) 12, OOOrpm 離心 2min,棄吸附柱。基因組DNA存在于離心管溶液中，4°C保存備用或_20°C長期保存。 I. 2目的片段和SNP位點的獲得以及PCR-RFLP分型(I)擴增含SNP位點的核苷酸片段根據Ensembl數據庫收錄的PTK2基因(ENSBTAG00000009578)序列設計引物，包括正向引物 F5 ’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3，和反向引物 R5 ' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3 '，擴增出待測SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO. I所示。該SNP位點位于該PCR擴增片段的227bp處，該處堿基可以為T或G，當該處堿基為G時，可被NlaIII內切酶(識別序列為CATG)識別。其中，PCR反應體系以25 ill計為50ng/ill模板DNA I yl，IOpmol/引物F和R各 I ii 1，lOmmol/L dNTP mix2. O u l,5U/u L Taq DNA聚合酶0. 125 y I，IOXPCR反應緩沖液2.5 yl，余量為水。PCR 反應條件為94°C 5 分鐘；94°C 30 秒，47. 5°C 35 秒，72°C 35 秒，34 個循環；72 0C 10 分鐘。(2)針對第227位堿基的不同選擇適當的內切酶進行PCR-RFLP該PCR產物用NlaIII內切酶酶切，反應體系以20ul計為IOU/ii LNlaIII內切酶0. 5ul，10 X NEB 緩沖液 2ul，10ug/ul 100 X BSAO. 2ul，上述 PCR 產物 12ul，余量為水。反應條件為37°C溫育4小時。然后，將得到的酶切產物在瓊脂糖凝 膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統中觀察(圖I)。3、基因型判定及關聯分析根據PCR-RFLP的結果判定該位點在檢測群體中的基因型。當擴增片段的227bp處堿基均為G時，NlaIII內切酶可識別該位點，即可將PCR擴增片段切成兩個片段，一個為227bp，另一個片段為269bp，該基因型記為GG型；當227bp處的堿基都為T時，NlaIII內切酶不可識別，即PCR擴增片段不能被切開，凝膠中只有一條帶，長度為496bp，該基因型記為TT型；當227bp處既含有G堿基又含有T堿基時，即凝膠電泳中含有三條帶，長度分別為496bp、227bp和269bp，該基因型記為雜合型TG型。即，該位點可分為3種基因型TT :496，TG :496/227/269, GG :227/269。3種基因型測序峰圖見圖2。實施例2中國荷斯坦奶牛不同基因型與產奶性狀的關聯分析及檢測應用按照實施例I的方法，對采自北京地區不同奶牛養殖場的14個公牛家系共608頭中國荷斯坦奶牛進行PCR-RFLP檢測，PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列227bp位點的分析結果如表I所示。運用SAS9. 0軟件Mixed程序進行線性模擬分析SNP多態位點的基因型與產奶性狀的關聯關系，分析時以個體育種值(EBV)代表表型值，采用的模型如下Yijk = U +G^ajIeijk其中，Yijk為個體育種值，U為育種值群體均值，Gi為基因型效應，Bj為微效多基因效應，eijk為隨機誤差效應。表ISNP位點在中國荷斯坦奶牛群體中的基因型頻率及等位基因頻率
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Gtl44(j0.:. 由表I可知，TT純合型個數體顯著高于TG型、GG型，T等位基因為優勢基因。進行卡方適合性檢驗，( 1 )期望值與觀測值差異不顯著，可知該位點在群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態。表2中國荷斯坦奶牛PTK2基因SNP位點與產奶性狀進行關聯分析
權利要求
1.ー種與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記，其特征在于，其位于中國荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列的227bp處，此處堿基為T的中國荷斯坦奶牛的產奶量、乳蛋白含量顯著高于此處堿基為G的中國荷斯坦奶牛，而乳脂率前者顯著低于后者。
2.用于檢測權利要求I所述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記的引物，其特征在于，包括正向引物F5’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3’和反向引物R5' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3'。
3.權利要求I所述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記在鑒定產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種中的應用，其包括步驟 1)提取待測中國荷斯坦奶牛的基因組DNA; 2)以待測中國荷斯坦奶牛的基因組DNA為模版，利用權利要求2所述引物F和R，通過PCR反應擴增出中國荷斯坦奶牛PTK2基因496bp片段； 3)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中227bp處的堿基為T，則待測中國荷斯坦奶牛屬于產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中PCR反應使用的擴增體系以 25 μ I 計為50ng/ μ I 模板 DNAl μ 1，IOpmoI/d 弓I 物 F 和 R 各 I μ 1，IOmmoI/L dNTPmix2. Ομ l,5U/y L Taq DNA 聚合酶 O. 125 μ I，IOXPCR 反應緩沖液 2. 5 μ I，余量為水。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟2)中PCR反應使用的條件為94°C5分鐘；94°C 30 秒，47. 50C 35 秒，72°C 35 秒，34 個循環；72°C 10 分鐘。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟3)中檢測PCR擴增產物采用RFLP法，具體為用內切酶NlaIII對PCR擴增產物進行酶切，并對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結果僅為一條帯，則待測中國荷斯坦奶牛屬于產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種，檢測結果出現兩條帶，則待測中國荷斯坦奶牛屬于普通品種。
7.含有權利要求2所述引物的用于檢測中國荷斯坦奶牛產奶性狀的試劑盒。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的ー種或多種。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
10.權利要求I所述與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記在中國荷斯坦奶牛分子標記輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用，其位于中國荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO.1所示序列的227bp處，此處堿基為T的中國荷斯坦奶牛的產奶量、乳蛋白含量顯著高于此處堿基為G的中國荷斯坦奶牛，而乳脂率前者顯著低于后者。本發明采用聚合酶鏈式反應(PCR)和測序技術篩選到與中國荷斯坦奶牛產奶性狀相關的SNP標記，并通過限制片段多態性(RFLP)方法來檢測待測中國荷斯坦奶牛的基因型，根據基因型進行產奶量高的中國荷斯坦奶牛優勢品種的選育，從而加快中國荷斯坦奶牛的育種進程。
文檔編號C12N15/11GK102676514SQ20121017547
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者劉劍鋒, 張勤, 張勝利, 王海飛, 趙紅梅 申請人:中國農業大學