專利名稱：一種阿魏酸酯酶基因(Fae-A)的克隆及重組酶的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株的ー種新型A型阿魏酸酯酶(Fae-A)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
阿魏酸(ferulic acid)的化學名稱為4_羥基_3_甲基_2_苯丙烯酸，是植物界普遍存在的ー種酚酸，其在植物細胞壁結構中起著重要的作用，可以在植物細胞壁的木質素與木質素之間、木質素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構成一個骨架結構，使得整個細胞壁變得堅硬。在谷物的細胞壁中，阿魏酸的單體和多種ニ聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上。阿魏酸酯酶(EC. 3. I. I. 73)又稱肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的ー個亞類，也是一種胞外水解酶，是能水解阿魏酸甲酷、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的酶。因此，可以利用阿魏酸酯酶作用于植物細胞壁，釋放出游離阿魏酸或者是ニ聚體阿魏酸，其主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國、日本已允許用作食品添加剤，目前在醫藥、食品和化妝品エ業中廣泛應用。阿魏酸酯酶的微生物來源廣泛，如黑曲霉、米曲霉、構巢曲霉，青霉類、嗜酸乳酸桿菌等各種絲狀真菌以及細菌。宇佐美曲霉是黑曲霉的ー個變種，它具有生長速度快、產孢子少等優點，就前期研究的結果來看，兩個菌種在基因水平上的差異極小。目前對于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于對原始菌株培養條件的優化以増加產酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高阿魏酸酯酶的酶活。近年來，隨著對自然界半纖維素資源的開發利用，尤其是反式阿魏酸優越的生理功能，人們對不同來源和不同特性的阿魏酸酯酶進行了深入地研究，阿魏酸酯酶的應用領域得到了不斷地拓展，除了在食品方面的利用，其在造紙、飼料、紡織、釀酒、醫藥、環境和能源等エ業領域逐步開始了廣泛的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種源于Aspergillus usamii EOOl的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，為該阿魏酸酯酶的產業化生產奠定理論基礎。根據氨基酸序列以及底物特異性等，將阿魏酸酯酶分為A、B、C、D四類，Shin等研究表明這四類阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根據同源比對，A. usamii EOOl分泌的為A型阿魏酸酯酶，命名為Aus Fae-A，其相應的基因命名為Aus Fae_A。A. usamii EOOl菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發酵エ業》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發明人承諾該菌株在20年內向公眾發放。本發明的技術方案一種源自A. usamii EOOl的新型的A類阿魏酸酯酶(AusFae-A)，其基因(Aus Fae-A)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ ID NO 10
所述的由成熟肽cDNA序列所推導的Aus Fae-A氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組阿魏酸酯酶的活性測定方法于25mL具塞試管中，取5mL粗酶液于加入O. 2g去淀粉麥麩(DSWB)，試管中，在40°C下恒溫水浴回旋反應15min,沸水浴中滅酶3min,離心,取ImL上清液(根據釋放出的阿魏酸量稀釋適當倍數)加入9mL無水こ醇，振搖，離心，取上清液用紫外分光光度計在320nm下測定吸光值，同時設置空白對照(5mL粗酶液于沸水浴中滅酶3min，加入O. 2g DSffB于試管中，其他操作步驟同上)，計算酶活時減去酶液中原有的阿魏酸(即空白)。所述的Aus Fae-A成熟肽cDNA序列的克隆和表達的方法如下(I)從已報道的Aspergillus niger CBS 513. 88基因組信息中找出編碼黑曲霉 A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下FAE-F :5’ GAATTCGCTTCCACGCAAGGCATCTC 3’FAE-R 5 GCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCG 3’提取A. usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接(pUCm-T-Fae-A)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑒定正確后送上海生エ測序，得到Aus Fae-A成熟肽cDNA序列。(2)將測序結果正確的pUCm-T-Fae-A與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-Fae-A(圖I)，并對重組質粒進行序列測定。(3)GS115/Fae-A的構建、表達、產物純化及活性測定用Sac I對pPIC9K-Fae_A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Fae-Α;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。本發明的有益效果本發明提供了ー種來源于A. usamii EOOl的新型的阿魏酸酯酶成熟肽基因cDNA序列的克隆及表達的方法，生物信息學分析表明該阿魏酸酯酶屬于此類酶的A類，所以命名為Aus Fae A，其相應的基因命名為Aus Fae-Α。本發明為該酶的產業化生產奠定了理論基礎，有較大的エ業化生產和應用潛カ及經濟價值，也為其他菌株新型阿魏酸酯酶的研究奠定了理論基礎。
圖I :重組質粒pPIC9K-Fae_A的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進ー步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。實施例1A. usamii EOOlFae-Α成熟肽cDNA序列的克隆以A. usamii EOOl 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和FAE-F為引物進行第一輪PCR，其反應條件為940C 5min，30 個循環(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ;以 FAE-F 和 FAE-R 為引物進行第二輪 PCR，其反應條件為94°C 5min，30 個循環(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72 °C IOmin0將兩輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-Aus Fae-A)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑒定正確后送上海生エ測序。實施例2Aus Fae-A成熟肽基因在畢赤酵母GSl 15中的表達將測序結果正確的pUCm-T-Fae-Α與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-Fae-A，并對重組質粒進行序列測定。用Sac I對pPIC9K-Fae_A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Fae-A。該基因工程菌用I. 0%甲醇誘導表達96h，采 用紫外吸收法測得發酵液中重組阿魏酸酯酶活性達85IU/mL。
權利要求
1.ー種來源于Aspergillus usamii EOOl的新型A類阿魏酸酯酶,其核苷酸和氨基酸序列分別為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.A. usamii EOOl新型A類阿魏酸酯酶基因序列克隆及表達的方法 (1)從已報道的Aspergillusniger CBS 513. 88基因組信息中找出編碼黑曲霉A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計ー對特異性引物，引物序列如下FAE-F :5’ GAATTCGCTTCCACGCAAGGCATCTC3，FAE-R :5’ GCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCG3，提取A. usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說明書進行RT-PCR擴增；將兩輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-Fae-A)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑒定正確后送上海生エ測序，得到AusFae-A成熟肽cDNA序列； (2)將測序結果正確的pUCm-T-Fae-A與pPIC9K質粒均用EcoRI和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-Fae-A(圖I)，并對重組質粒進行序列測定； (3)GS115/Fae_A的構建、表達、產物純化及活性測定用SacI對pPIC9K_Fae-A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Fae-A;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。
全文摘要
本發明提出了一種源于Aspergillus usamii E001的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，相應的氨基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為Aus Fae-A。本發明還公開了產阿魏酸酯酶工程菌的構建以及重組阿魏酸酯酶的高效表達的方法，具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/81GK102703403SQ20121018137
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者唐存多, 李劍芳, 鄔敏辰, 陳忠法, 龔燕燕 申請人:江南大學