專利名稱：米曲霉gh11木聚糖酶基因耐熱性改造的方法及突變酶的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 4018菌株的常溫木聚糖酶(AoXynllA)基因熱穩定改造，突變木聚糖酶工程菌的構建及重組突變木聚糖酶的高效表達，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一類重要的工業用酶。它主要是作用于木聚糖主鏈，隨機地切開木聚糖內部的木糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是 木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業、食品加工及釀造等行業具有潛在的工業應用和經濟價值，尤其是在工業造紙上的應用，減少因漂白產生的環境污染，受到了越來越多的關注。然而在許多工業中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進行操作，因此對木聚糖酶耐熱性的研究也引起了國內外研究的高度重視。開發耐熱型木聚糖酶的研究主要包括篩選超耐熱的木聚糖酶生產菌和利用基因工程對酶分子進行定向改造，相對于篩菌技術的盲目性，后者具有更強的針對性，受到國內外學者的青睞。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量較小，且結構比較簡單，更適合作為理論研究的分子模型，可以用于極端條件下木聚糖酶催化模式系統及蛋白質分子折疊機理等的研究。基因工程技術、生物信息學以及計算機科學的快速發展，為分子生物學的研究開辟了新的前景。我們可以運用大規模高性能的計算機及其相關軟件，結合基因工程手段，利用模擬試驗對酶分子進行定向改造以提高熱穩定性，加速木聚糖酶在各種領域中的應用過程。
發明內容
本發明的目的是提供一種常溫的木聚糖酶熱穩定性改造、突變木聚糖酶工程菌構建以及突變木聚糖酶的高效表達的方法。本發明的技術方案根據來源于A. oryzae CICC 40186木聚糖酶AoXynllA的空間結構設計突變S55R和N155D，得到突變木聚糖酶=AoXynlIAyq，其成熟肽基因序列為SEQ IDNO :1，S55R和N15 可以形成鹽橋。A. oryzae菌株購于中國工業微生物菌種保藏中心(China Center of IndustrialCultureCollection, CICC)，編號為 40186。所述的由成熟肽基因編碼得到的AoXynllAYQ氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組木聚糖酶的活性測定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質量濃度為0. 5%的樺木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C預熱IOmin,在A管中加入0. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生
Iμ mo I還原糖所需的酶量定義為I個木聚糖酶活性單位(IU)。所述的耐熱雜合木聚糖酶基因的設計、克隆及表達(I)變基因AoXynl IAyq及其表達質粒的構建根據GenBank上AoXynllA的基因序列設計引物F1, R1, F2, R2 F1 5/ -GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3'，含 EcoR I 酶切位點R1 :5 ’ -AGGTGATTGCTCTACGGCTTCCGGGGTT-3，， F2 :5 ’ -ACGGGGAATCATTTCGATGCGTGGGCTA-3，，R2 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點以本實驗室保存的pUCm-T-AoXynllA為模板，分別以F1J1和F2, R2為1，2兩組引物同時進行第一輪PCR，分為PCRl和PCR2兩組；以本實驗室保存的pUCm-T-AoXynllA為模板，以第一輪PCRl產物和R2為引物進行第二輪PCR ；以第二輪PCR產物為模板，以PCR2產物和F1為引物進行第三輪PCR。將第三輪PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-AoXynllAYQ)。轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-AoXynl IAyq和pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒PPIC9K-AoXynllAYQ(圖I)，并對重組表達質粒進行序列測定。(4)GS115/AoXynllAYQ重組子的構建、表達及酶活的測定用Sal I對PPIC9K-AoXynllAYQ進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS 115/AoXynllAYQ ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達；發酵液經初步純化后使用SDS-PAGE檢測目的蛋白分子量。本發明的有益效果本發明提供了一種新型簡便的通過構建鹽橋提升木聚糖酶熱穩定性的方法，改造后得到的突變木聚糖酶命名為AoXynllA ，其相應的基因為AoXynl IAyq，其熱穩定性有了一定提高，有較大的工業化生產和應用潛力以及經濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎。
圖I :重組質粒pPIC9K_AoXynllAYQ的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。實施例I突變基因AoXynl IAyq及其表達質粒的構建采用大引物PCR技術構造融合基因，主要分為三步分別以？1，札和匕1 2為1，2兩組引物同時進行第一輪PCR，(940C 5min ;2個循環，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 30s ；28個循環94°C30s，55°C30s，72°C30s ；72°C IOmin ;10°C保存)分為PCRl和PCR2兩組；以本實驗室保存的pUCm-T-AoXynllA為模板，以第一輪PCRl產物和R2為引物進行第二輪PCR(94°C 5min ；2個循環，94。0 3()8，451308，721608 ;28 個循環 94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s ；72°C IOmin ；10°C保存)；以第二輪PCR產物為模板，以PCR2產物和F1為引物進行第三輪PCR(94°C5min ；2個循環，94。0 3()8，451308，721608 ;28 個循環 94°C 30s，55°C 30s，72 60s ；72°C IOmin ；10°C保存)。將第三輪PCR 產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-AoXynllAYQ)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T-AoXynllAYQ與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AoXynllAYQ，并對重組表達質粒進行序列測定，送去上海生工測序。實施例2GS115/AoXynllAYQ重組子的構建、表達及酶活的測定用Sal I對pPIC9K-AoXynllAYQ進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AoXynllAYQ。該工程菌用I. O %甲醇誘導72h。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經SDS-PAGE檢測為單一條帶，改造后木聚糖酶最適反應溫度為55°C，熱穩定性較原酶也有了一定提高。
權利要求
1.一種改造后的源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶基因AoXynl IAyq，其對應的基因和蛋白質序列分別為SEQ ID NO :1和SEQID NO :2。
2.突變木聚糖酶工程菌的構建方法和表達方法 (I)突變基因AoXynl IAyq及其表達質粒的構建根據GenBank上AoXynllA的基因序列設計引物F1, R1, F2, R2 F1 5/ -GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3'，含 EcoR I 酶切位點 R1 :5’ -AGGTGATTGCTCTACGGCTTCCGGGGTT-3’，F2 :5’ -ACGGGGAATCATTTCGATGCGTGGGCTA-3’， R2 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點以本實驗室保存的pUCm-T-AoXynllA為模板，分別以FnR1和F2, R2為1，2兩組引物同時進行第一輪PCR，分為PCRl和PCR2兩組；以本實驗室保存的pUCm-T-AoXynllA為模板，以第一輪PCRl產物和R2為引物進行第二輪PCR ；以第二輪PCR產物為模板，以PCR2產物和F1為引物進行第三輪PCR ;將第三輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-AoXynllAYQ);轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序；將測序結果正確的pUCm-T-AoXynllAYQ和pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒PPIC9K-AoXynllAYQ,并對重組表達質粒進行序列測定； ⑵GS115/AoXynllAYQ重組子的構建、表達及酶活的測定用Sal I對PPIC9K-AoXynllAYQ進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/AoXynlIAyq ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用I. 0%甲醇誘導72h ;離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經SDS-PAGE檢測均為單一條帶，重組木聚糖酶最適反應溫度為55°C。
全文摘要
本發明的目的是提供一種常溫的木聚糖酶熱穩定性改造、突變木聚糖酶工程菌構建以及突變木聚糖酶的高效表達的方法。根據來源于A.oryzae CICC 40186木聚糖酶AoXyn11A的空間結構設計突變S55R和N155D，得到突變木聚糖酶AoXyn11AYQ，其成熟肽基因序列為SEQ ID NO1，S55R和N155D可以形成一個跨二級結構的鹽橋。實驗結果表明突變后該酶熱穩定性有了明顯的提高，作為一種耐熱型的酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N1/19GK102703481SQ20121018137
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者劉曉彤, 李劍芳, 鄔敏辰 申請人:江南大學