專利名稱：與冠心病易感性關聯的易感區域chr4q32的單核苷酸多態性位點及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及與疾病易感性相關聯的單核苷酸多態性位點，特別涉及一種與冠心病易感性關聯的易感區域Chr4q32的單核苷酸多態性位點及其在評估冠心病易感性中的應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
動脈粥樣硬化性心腦血管病已成為世界范圍關注的主要健康問題。2004年的世界衛生組織(WHO)報告顯示，全世界每年心血管疾病以冠心病和腦卒中為主導致的死亡人數達高達1720萬，占所有死亡人數的三分之一。預計2020年這一數字將進一步增加50%， 高達2500萬，心血管疾病是全球人類的“頭號殺手”。在中國進行的一項大規模前瞻性研究也顯示，心臟疾病已經成為中國人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第I位。我國每年新發心肌梗死50萬人，隨著生活方式的改變以及動脈粥樣硬化相關的危險因素持續增加，冠心病與心肌梗死發病也還將呈持續上升趨勢。大量的研究資料表明，冠心病是一種復雜疾病，是由多個微效基因與環境因素長期相互作用所致。因此鑒定出與冠心病相關的易感基因或致病基因，在人群中進一步篩選增加疾病風險的易感基因確定易感個體，將有助于冠心病的發病風險預測、新藥開發、診斷和個體化治療。從基礎到臨床，人們對此進行了大量的研究，并在冠心病的危險因素和冠心病發生的病理生理學方面積累了大量的知識，但是關于冠心病與心肌梗死發生的確切遺傳分子機制卻知之甚少，對于怎樣鑒定遺傳易感基因以及鑒定受試者的冠心病遺傳易感性，一直缺乏全面系統有效的識別方法。
發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一系列與冠心病易感性顯著相關的單核苷酸多態性位點(SNP, single nucleotide polymorphism)),并找出其中與冠心病易感性關聯最顯著的代表性位點，繼而提供將所述單核苷酸多態性位點用于評估冠心病易感性的用途。為了實現上述目的本發明采取的技術方案是第一方面，提供一系列與冠心病易感性顯著相關的易感區域chr4q32的單核苷酸多態性位點(SNP)。在中國漢族人群中選取1515例冠心病患者和5019例正常人為研究對象，使用全基因組芯片(Affymetrix Axiom Genome-Wide CHB I Array Plate)芯片對全基因組范圍內SNP進行基因分型。利用芯片得到的數據，評價基因型和表型的關聯關系，從而得到可能與冠心病之間存在潛在關聯的區域是在染色體4q32上的⑶CY1A3-GUCY1B3基因區域的下游，與冠心病易感性顯著關聯的單核苷酸多態性位點是位于該區域的一系列單核苷酸多態性位點，為rs2625269，等位基因為A/G ;rsl976041，等位基因為A/G ；rsl905261,等位基因為A/C ；rsl905262,等位基因為A/T ；rs2705455,等位基因為G/A ;rsl483041，等位基因為A/G ;rs2200168，等位基因為C/T ;rs716428，等位基因為C/T ;rs990619，等位基因為G/C ；rsl842896,等位基因為G/T ；rs2625245,等位基因為A/G ；rsll23037,等位基因為 A/T。第二方面,使用logistic回歸分析評估每個SNP位點與冠心病的關系,計算危險等位基因的相對危險度(Odds ratio, OR)和95%的可信區間，得到這一系列SNP位點的危險等位基因分別是rs2625269多態性位點為A，rsl976041多態性位點為G，rsl905261多態性位點為A，rsl905262多態性位點為A，rs2705455多態性位點為G，rsl483041多態性位點為A，rs2200168多態性位點為C，rs716428多態性位點為C，rs990619多態性位點為G，rsl842896多態性位點為T，rs2625245多態性位點為G，rsl 123037多態性位點為T。第三方面，選擇chr4q32區域代表位點rsl842896,在數據分析中使用Haploview軟件計算染色體區域位點間的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium, LD)情況。該區域 rsl842896 多態性位點與 rs2625269，rsl976041, rsl905261, rsl905262, rs2705455,rsl483041,rs2200168, rs716428, rs990619, rs2625245, rsll23037,具有強的連鎖不平衡。同時使用 FludigmOEPl 基因分析系統(FludigmOEPl tmGENETIC ANALYSIS system), Taqman、MGB探針法進行基因分型，進一步在15460例冠心病患者和11472例對照樣本中驗證，合并所有16975例病例和16491對照樣本分析顯示rsl842896與冠心病的關聯更加顯著，這一結果進一步證實了 chr4q32區域多態位點與冠心病密切相關。第四方面，根據上述與冠心病易感性顯著相關的單核苷酸多態性位點，構建單體型(haplotype)比較其在患者和正常對照之間的頻率差異，用以評估冠心病易感性。本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是根據本發明染色體4q32由一段鄰近⑶CY1A3-GUCY1B3基因區域下游的SNP位點以及由一系列SNP位點組成的單體型的變異特性判斷冠心病易感人群的方法，可以對未出現冠心病早期臨床癥狀的人群，尤其具有傳統危險因素的冠心病高危人群，進行無創快速簡便的篩查，早期發現冠心病易感對象，并采取相應的保健措施，降低冠心病與心肌梗死的發病率。根據本發明也可以為研發針對性的冠心病基因治療提供了科學依據。本發明為進一步檢測基因表達調控、蛋白功能，深入研究冠心病的致病機制，開發新型治療藥物和基因治療，實現基于遺傳學背景的個體化診療奠定了重要基礎，并帶來重要的醫學健康效益和經濟效益。
圖I為實施例I中所確定的chr4q32區域SNP位點與冠心病的關聯圖。圖2為在實施例2的重復驗證階段的檢測中，其中96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)的代表位點rsl842896基因分型結果聚類圖；圖3 為應用 SNP Genotyping Analysis softgware version 3.0 軟件對圖 2 所述的96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)的代表位點rsl842896進行基因分型的截圖；圖4為圖2所述的96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)代表位點rsl842896基因分型結果導出數據的截圖。
圖I中橫坐標“Position on chr”為染色體上的位置(單位Mb);縱坐標為單核苷酸多態性位點與冠心病的關聯顯著性P值(-IoglO (p-value)),右側Recombination rate為重組率，單位(CM/Mb);代表位點rsl842896以 表示。圖2中X軸代表VIC熒光強度，Y軸代表FAM熒光；基因型結果紅色I為G/G純合子，綠色2為T/T純合子，藍色3為G/T雜合子，黑色4為陰性對照(NTC)。其中橫坐標X :Allele為等位基因，VIC-MGB代表VIC熒光標記MGB探針；縱坐標
Y=Allele為等位基因，FAM-MGB為FAM熒光標記MGB探針；上方表示SNP位點、call rate為這張芯片上該位點檢出率、Auto Confidence為軟件給出的自動判別基因型的可信度；下方Chip Run Name為實驗中采用的EPl芯片名稱。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例I確定與冠心病易感性顯著關聯的單核苷酸多態性位點、等位基因及其危險等位基因一、方法首先在中國漢族人群中選取1515例冠心病患者和5019例正常人為研究對象。使用 Affymetrix 公司的全基因組芯片(Affymetrix Axiom Genome-ffide CHB I ArrayPlate)由上海交通大學BIO-X中心檢測。獲得1515例冠心病患者和5019例正常人全基因組芯片SNP的基因型數據。通過全基因組關聯(GWAS)分析計算獲得SNP芯片中每個位點與冠心病關聯顯著性水平(P值)，按照顯著性水平(P值小于0. 001)找出與冠心病之間存在潛在關聯的染色體區域，并得到冠心病易感性顯著關聯的單核苷酸多態性位點及其等位基因。統計分析時采用plink軟件進行logistic回歸分析評估每個SNP位點與冠心病關聯的顯著性，計算危險等位基因的相對危險度(Odds ratio, OR)和95%的可信區間，分析中直接獲得OR值、可信區間和P值，從而得到所述位點的危險等位基因。二、病例和對照樣本入選標準冠心病病例包括心肌梗死患者和心絞痛患者，心肌梗死病例的入選診斷標準為急性心肌梗塞診斷標準(根據WHO 1979年的診斷標準):即典型胸痛癥狀持續30分鐘以上；心電圖連續2個導聯ST段抬高(肢體導聯0. Imv,胸導聯0. 2mv)并有系列動態變化；心肌壞死的血清標記物濃度升高，如肌鈣蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。心絞痛病例的入選診斷標準為經冠脈造影發現冠狀動脈至少一個主要分支狹窄超過70%。經各項檢查除外心臟瓣膜疾病、先天性心臟病、心力衰竭、嚴重的腎臟及肝臟疾病、繼發性高血壓、心肌病、家族性高膽固醇血癥及可疑冠心病患者。對照組入選標準既往無冠心病或其他動脈粥樣硬化病史，無胸痛、胸悶等心臟病癥狀，心電圖無明顯缺血性改變。病例組和對照組均為中國漢族人，且無血緣關系。三、測試人群的基本特征測試人群為芯片檢測樣本其基本特征如表I所示表I :
權利要求
1.與冠心病易感性關聯的易感區域chr4q32的單核苷酸多態性位點,所述單核苷酸多態性位點是位于染色體4q32上的GUCY1A3-GUCY1B3基因區域下游的一系列單核苷酸多態性位點，為rs2625269，等位基因為A/G ;rsl976041，等位基因為A/G ;rsl905261，等位基因為A/C ；rsl905262,等位基因為A/T ；rs2705455,等位基因為G/A ;rsl483041，等位基因為A/G ；rs2200168,等位基因為C/T ；rs716428,等位基因為C/T ；rs990619,等位基因為G/C ；rsl842896，等位基因為G/T ;rs2625245，等位基因為A/G ;rsll23037，等位基因為A/T。
2.根據權利要求I所述的單核苷酸多態性位點，其中所述的一系列SNP位點的危險等位基因分別是rs2625269多態性位點為A，rsl976041多態性位點為G，rsl905261多態性位點為A，rsl905262多態性位點為A，rs2705455多態性位點為G，rsl483041多態性位點為A，rs2200168多態性位點為C，rs716428多態性位點為C，rs990619多態性位點為G，rsl842896多態性位點為T，rs2625245多態性位點為G，rsl 123037多態性位點為T。
3.根據權利要求I或2所述的單核苷酸多態性位點，其中與冠心病易感性關聯最顯著 的代表性單核苷酸多態性位點是rsl842896。
4.根據權利要求I或2所述的單核苷酸多態性位點用于評估冠心病易感性的用途，其特征在于，所述冠心病包括心肌梗死和心絞痛。
全文摘要
本發明公開了與疾病易感性相關聯的單核苷酸多態性位點，特別涉及一種與冠心病易感性關聯的易感區域chr4q32的單核苷酸多態性位點及其在評估冠心病易感性中的應用，屬于生物技術領域。所述單核苷酸多態性位點是位于染色體4q32上的GUCY1A3-GUCY1B3基因區域下游的一系列單核苷酸多態性位點，為rs2625269，rs1976041，rs1905261，rs1905262，rs2705455，rs1483041，rs2200168，rs716428，rs990619，rs1842896，rs2625245，rs1123037。根據本發明染色體4q32由一段鄰近GUCY1A3-GUCY1B3基因區域下游的SNP位點以及由一系列SNP位點組成的單體型的變異特性判斷冠心病易感人群的方法，可以對未出現冠心病早期臨床癥狀的人群，尤其具有傳統危險因素的冠心病高危人群，進行無創快速簡便的篩查，早期發現冠心病易感對象，并采取相應的保健措施，降低冠心病與心肌梗死的發病率。
文檔編號C12Q1/68GK102747076SQ20121020146
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月7日
發明者李宏帆, 李建新, 王來元, 顧東風, 魯向鋒, 黃建鳳 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院