專利名稱：一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法
技術領域：
本發明屬于遺傳學領域，公開了一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法。
背景技術：
種子純度是農業生產中最重要的問題之一，它關系到國家糧食安全，是種子產業化開發中最重要、最核心的內容，因而也關系種子企業生死存亡。大部分農作物種子純度要求都在95%以上，甚至為99. 9% (表1)，因而，需要大量統計抽樣才能獲得準確數據，工作量十分巨大。例如合格的雜交稻品種純度要求達到96%，則意味著100個植株最多只允許4個雜株，那么要使檢測結果可靠，至少應該檢測500粒種子，工作量是巨大的。另外，由于技術缺陷，各種種子純度檢測方法還存在受環境影響、速度慢、費用高等問題，影響到了鑒定的準確性、種子及時上市、成本等重要問題。表I農作物種子純度標準(GB4404. 1-2008)
^原種(％)大田用種# m大剛手中
大(%)_竹大_(%)(%>
常規種99 9 9θ7θ常規種99~09δΓθ~
不育系油菜親本99.098.0
水輛保持系49 H 99.9雜交種85.0
恢復系常規種99.095.0
雜交種96.0親木-毛籽99.097.0
常規種 99.9 97.0 職、薄■99.0
膜包衣)
自交種 99.9 99.0雜交種95.0
96.0 小麥常規種99.999.0
雙父種
__三交Ι41___95. O 大麥常規種__99. 9W O種子純度檢測經歷了從田間表型鑒定到實驗室分子標記鑒定的發展。田W表型鑒定的操作過程是這樣的從生產的種子中隨機抽取一定數量的種子，田間種植并觀察性狀，通過與品種的真實性狀比較，鑒定出雜株。例如，由100個植株構成的鑒定群體中，發現2株株高和3株顏色明顯不同于該品種真實性狀的植株，則該品種的純度為(2+3)/100=95%。田間鑒定的缺陷是明顯的一是需要種植一個季節，周期長、占地多、費用高，而種子從生產到銷售的時間只有2-3個月時間，田間鑒定周期嚴重影響了種子銷售上市。二是植株性狀常受環境影響，如在高肥力條件下，植株更高大，從而誤判為雜株，使鑒定結果不準確。分子標記鑒定種子純度在很大程度上克服了以上問題，其理論依據可以簡單描述為利用雜株與品種間特定分子的不同，鑒定雜株，計算種子純度。依據分子標記的類型不同，可分為蛋白質(如同工酶等)和DNA分子標記鑒定。蛋白質分子標記鑒定也有明顯的缺陷，一是蛋白表達同樣受環境影響，使鑒定結果不準確；二是可用于鑒定的蛋白分子標記不多，使這種技術難以用于區分親緣關系較近的品種。DNA分子標記是根據雜株與正常品種在DNA水平上的序列差異進行鑒定的，該技術在很大程度上克服了以上幾種鑒定方法的不足。首先，DNA序列差異不再依賴于環境，因此，鑒定結果是準確的；第二，從理論上講，任何雜株與正常品種DNA都存在差異，因此，可用于鑒定任意品種；第三，由于種子、幼苗、成株期的DNA都是一樣的，因此，鑒定不再需要田間種子，只需要室內簡單發芽提取DNA即可，縮短了檢測周期，為種子推廣贏得了時間。然而，企業可能需要檢測多個生產地點或生產者的種子是否合格，檢測工作量巨大，即使是利用DNA分子標記檢測，常常也會由于工作量大而無法及時完成檢測，同時，巨大的工作量也伴隨著檢測成本過高的問題。例如，國家法律規定，雜交水稻種子的純度不得低于96%，因此，若要求在95%的概率保證下，種子純度誤差不超過1%，則每個樣本需要抽檢3000粒種子才能達到要求，若檢測100個樣本，則需要提取DNA、PCR、電泳分別為3000*100=30萬次。在檢測人員和設備有限的情況下，幾乎是不可能在在種子包裝與銷售前完成檢測工作，嚴重影響上市。在此情況下，只能減少抽樣量，以達到減少工作量的目的。例如，一般企業抽檢100粒種子，在此情況下，若依舊要求純度誤差不過1%，那么對結果的把握度(概率保證)僅為15%左右。所以，即使得到了檢測結果，并沒有把握判斷該批次的種子是否合格，給市場銷售帶來巨大風險
發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供了一種能夠準確、快速檢測雜交種子純度的方法。為了實現上述目的本發明采取的技術方案是一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟根據種子純度要求，計算抽樣樣本量；等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合；按檢測位點的堿基序列，設計PCR引物擴增檢測位點；回收并純化PCR擴增產物；利用擴增產物建庫并進行高通量測序；根據檢測位點序列比例，計算種子純度。本發明提供更優選的技術方案是一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟(I)計算最小抽樣樣本量根據商品種子純度要求、設定的概率保障和允許的誤差，確定最小的樣本抽樣量；(2) DNA提取對每一植株，選取相同部位的等量材料混合后提取DNA ;或者，提取每一植株的DNA，再對DNA進行定量抽取后再等量混合；(3)擴增并回收檢測位點按檢測位點的堿基序列，設計引物，對檢測位點進行PCR擴增，擴增產物應包含等位位點的差異序列，對PCR產物進行回收純化；(4)建庫與高通量測測序按高通量測序流程分別構建親本基因DNA文庫，ePCR并高通量測序；(5)種子純度的確定根據測序的結果，獲得父本與母本序列的片段數，由此推算種子純度。本發明實施例的有益效果是(I)減少了工作量，加快了檢測速度。采用分子標記檢測，若I個樣本抽樣3000個植株，則DNA提取、PCR擴增與電泳檢測都需要做3000次，因此工作量大，速度慢，常常無法在種子收獲到包裝上市短短兩三個月內完成。采用本方案，不論每一樣本抽樣多少植株，均將這些植株等量混合成I個樣品，DNA提取、建庫和測序時都只做I次，工作量大為減少，同時速度大為加快，很好地滿足了種子及時上市銷售的要求。(2)提高了準確率。如上所述，分子標記檢測由于工作量大，常常只能減少每一樣本中抽樣的植株數，達到加快進度的目的，這就導致了檢測結果不準確的情況。采用本方案，現有高通量測序通量都在100G以上，即使檢測的基因序列長達1K，也可檢測到超過I億條序列，每2條序列可代表I個植株，則可檢測超過5000萬個植株。如此大的樣本容量，我們幾乎可以在每一樣本中抽取任意多的植株進行檢測，很好地保證了檢測結果的準確性。(3)保持了 DNA檢測的優勢。本技術方案應歸于DNA分子標記檢測范疇。因此，與田間檢測和蛋白質分子標記檢測比較，他們具有不受環境影響，不受季節限制，不占用土地等優勢。本發明的突出特點是很好地滿足了商品雜交種子純度檢測中對檢測速度與準確性的要求。
圖I是本發明實施例提供的雜交水稻品種“科優73”種子純度檢測示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，但不作為對本發明的限定。實施例I雜交水稻品種“科優73”種子純度檢測方法(參見圖I)(I) “科優73”雜交種子抽樣
“科優73”是一種選育的雜交水稻新品種，并申請了新品種保護，其父本為R7723，母本為金科1A。對127份批次的“科優73”種子純度抽樣分析。利用DPS(Data ProcessingSystem:數據處理系統。)2000軟件中的“二項分布總體均數置信區間”功能，計算出抽樣樣本需要達到3000個樣本才能滿足檢測的誤差不超過1%的要求。因此利用種子抽樣器，按隨機取樣的原則，從每一批次的種子中，大約抽取4500粒種子。(2)種子發芽、樣品混合與DNA提取將5層報紙鋪于40cmX 80cm的瓷盤中，加少量水分至報紙完全濕潤但不露明水為止。將4500粒種子均勻撒播于瓷盤中，用另一瓷盤將其蓋住以保持水分。于室內(溫度約30°C左右)自然發芽，期間檢查并適當補充水份。種子發芽生長至第7-10天時，已有I片葉片長出，此時選取3000個小苗，每棵小苗取I片葉片，將葉片疊放整齊，統一切取大致相等的量混合。按植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天更，北京)操作手冊分離純化基因組DNA,利用ND2000超微量分光光度計測定樣品濃度與純度。共獲得127份混合DNA樣品，分別代表了 127個抽樣樣本。(3) PCR擴增與回收父本R7723與母本金科IA在株高基因HD不同，父本為高桿，含有該基因的顯性基因，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 1，而母本為矮桿，含有該基因的隱性基因，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 2。其中，顯性與隱性位點為單堿基突變，即在第203個堿基位點，R7723中為T，而金科IA中為G。利用Primer5軟件設計引物擴增HD基因在R7723與金科IA之間的差異位點，引物設計時采用軟件的默認參數進行。其中，Sense Primer (正向引物)為序列表中的SEQ ID NO. 3ο Antisense Primer(反向引物)為序列表中的SEQ ID NO. 4，獲得的PCR產物為272bp，為序列表中的SEQ ID NO. 5 (與R7723完全匹配)和SEQ ID NO. 6 (與金科 IA 完全匹配)。PCR 擴增體系按試劑盒 DreamTaq Green PCR Master Mix(2X) (K1081,Fermentas)推薦比例配比，即PCR混合物501、模板15ng、引物21(濃度0. 5M/1)，加去離子水 至總體積為1001。擴增程序如下94°C預變性4分鐘；94°C，I分鐘，54°C，I分鐘，72°C，2分鐘，循環20次；72°C延伸8分鐘。擴增產物用3%的瓊脂糖凝膠檢測并用PCR產物按瓊脂糖凝膠回收試劑盒(K0691，Fermentas)操作手冊回收并純化目的DNA片段。(4)建庫與高通量測序由于PCR產物不足400bp長度，因此，對獲得的127份DNA擴增產物按SOLiD 5500高通量測序操作手冊中的擴增子串聯法進行建庫。建庫過程中，采用BarCoding(條形碼)對樣品進行區分，共采用64個條形碼。測序時共占用2個測序通道，獲得數據22. 7G，平均每個樣本獲得數據O. 18G，127個樣本的變異幅度為O. 15G-0. 21G。加上接頭等序列，每500bp可代表I個檢測片斷，則平均每個樣本被檢測到了 37. 48萬次，127個樣本的變異幅度為31. 45萬次-44. 04萬次。如此大的檢測頻率保證了檢測結果的準確性。(5)種子純度的計算按完全匹配的原則，將R7723中與金科IA中的差異序列與測序結果進行比較，在每一個樣本中分別獲得與R7723和金科IA完全匹配的片段數量。按種子純度=2x/(x+y) X 100% (x與y分別代表R7723與金科IA檢測到的片段數量)計算每一樣本的種子純度。按上述公式計算，這127個品種的平均純度為98. 67%，變異幅度為94. 72%_99. 98%。共有4個樣本的純度低于96%，為不合格種子，應轉為商品糧食銷售，其余123個樣本純度均大于96%，可以進入正常的種子銷售環節。實施例2本實施例的檢測方法與實施例I基本相同，所不同的是步驟(2)中DNA提取的步驟是種子發芽生長至第7-10天時，已有I片葉片長出，此時選取3000個小苗，每棵小苗取I片葉片，按植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天更，北京)操作手冊分離純化基因組DNA，提取每一葉片的DNA，再對DNA進行定量抽取后再等量混合；利用ND2000超微量分光光度計測定樣品濃度與純度。共獲得127份混合DNA樣品，分別代表了 127個抽樣樣本。以上所述的實施例，只是本發明較優選的具體實施方式
的一種，本領域的技術人員在本發明技術方案范圍內進行的通常變化和替換都應包含在本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，其特征在于，包括以下步驟根據種子純度要求，計算抽樣樣本量；等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合；按檢測位點的堿基序列，設計PCR引物擴增檢測位點；回收并純化PCR擴增產物；利用擴增產物建庫并進行高通量測序；根據檢測位點序列比例,計算種子純度。
2.根據權利要求I所述的快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，其特征在于，包括以下步驟 (O計算最小抽樣樣本量根據商品種子純度要求、設定的概率保障和允許的誤差，確定最小的樣本抽樣量； (2)DNA提取對每一植株，選取相同部位的等量材料混合后提取DNA ;或者，提取每一植株的DNA，再對DNA進行定量抽取后再等量混合； (3 )擴增并回收檢測位點按檢測位點的堿基序列，設計引物，對檢測位點進行PCR擴增，擴增產物應包含等位位點的差異序列，對PCR產物進行回收純化； (4)建庫與高通量測測序按高通量測序流程分別構建親本基因DNA文庫，ePCR并高通量測序； (5)種子純度的確定根據測序的結果，獲得父本與母本序列的片段數，由此推算種子純度。
全文摘要
本發明公開了一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟根據種子純度要求，計算抽樣樣本量。等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合。按檢測位點的堿基序列，設計PCR引物擴增檢測位點。回收并純化PCR擴增產物。利用擴增產物建庫并進行高通量測序。根據檢測位點序列比例，計算種子純度。本發明的突出特點是很好地滿足了商品雜交種子純度檢測中對檢測速度與準確性的要求。
文檔編號C12Q1/68GK102912010SQ20121021081
公開日2013年2月6日 申請日期2012年6月25日 優先權日2012年6月25日
發明者彭海, 張靜, 周俊飛 申請人:海南廣陵高科實業有限公司, 江漢大學