專利名稱：一種高效表達Hst 5的重組工程菌及構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥及食品領域，尤其是一種高效表達Hst 5的重組工程菌及構建方法和應用。
背景技術：
細菌對抗生素的耐藥性已成為當今臨床醫學上的一個難題，新型抗生素的研究速度遠遠趕不上細菌耐藥性的步伐。自90年代以來，對抗菌肽等新型抗菌物質的研究日益增力口，其中防御素、富組蛋白(Histatin)等抗菌活性肽家族是人體免疫系統的天然成分，具有抗菌活性強、毒副作用小，耐藥菌株少等優點，備受關注。由細菌、酵母和霉菌等微生物造成的食物、飼料等的腐敗變質，使相關產品降低或失去原有價值，甚至產生毒素，造成人畜中毒、患病甚至致死。在食品、飼料中添加抗生素或化學防腐劑(苯甲酸鹽、尼泊金、亞硝酸鹽、硝酸鹽等)，不僅對人畜具有一定的副作用，而且易造成細菌耐藥性的泛濫，因此，開發安全 性好的新型生物防腐劑日益受到人們的關注。富組蛋白是一族富含組氨酸的小分子、陽離子肽，由人體的腮腺和下頜下舌下腺分泌至唾液，其中以富組蛋白5 (Hst 5)的活性最強，抑菌譜廣，對細菌、酵母、霉菌、病毒等多種微生物具有顯著的抑制作用，是一種十分有前景的新型抗菌藥物及防腐劑，目前已在美國進入II期臨床試驗，用于囊性纖維化感染的治療。乳酸菌是一類以糖為原料產生乳酸的細菌，具有提高食品營養價值、改善食品風味、延長保存時間、對人畜安全無害且具有多方面保健功能的益生菌，因此被視為理想的蛋白多肽類物質的口服載體與表達載體。目前，國內外生產Hst5多采用化學合成方法，成本較高。雖亦有Hst 5基因工程表達的文獻報道，但所用多為大腸桿菌、畢赤酵母等表達體系，純化困難，且無法直接作為食品、飼料防腐添加劑使用，因此均難以產業化應用于實際中。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種高效表達Hst 5的重組工程菌及構建方法和應用，本發明獲得的工程菌將Hst 5直接分泌表達到培養液中，因此降低了分離純化難度、縮短了生產工藝，降低了生產成本，便于更好的大規模工業化生產Hst5，可作為一種優良、安全的生物防腐劑及發酵劑應用于食品、藥品、飼料等產品生產中。本發明實現目的的技術方案如下一種高效表達Hst 5的重組工程菌，其特征在于所述重組工程菌包括Hst 5基因，其序列見序列6，所述重組工程菌的表達質粒為pMG36e，所述重組工程菌的宿主菌為乳酸菌。而且，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌。一種高效表達Hst 5的重組工程菌的構建方法，其特征在于構建方法如下⑴構建N端引入乳酸菌信號肽的Hst 5基因，Hst 5基因序列見序列6;
⑵將Hst 5基因插入到乳酸菌表達載體的多克隆位點，構建得到Hst 5重組質粒，所述重組質粒為pMG36e-Hst 5 ；⑶將Hst 5重組質粒轉化至宿主菌，所述宿主菌為乳酸菌，得到Hst 5重組乳酸菌。而且，所述步驟⑴中N端引入乳酸菌信號肽的Hst 5基因通過DNA合成或重疊PCR方法獲得，在采用重疊PCR方法時，所用引物序列包括
權利要求
1.一種高效表達Hst5的重組工程菌，其特征在于所述重組工程菌包括Hst5基因，其序列見序列6，所述重組工程菌的表達質粒為pMG36e，所述重組工程菌的宿主菌為乳酸菌。
2.根據權利要求I所述的高效表達Hst5的重組工程菌，其特征在于所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌。
3.—種如權利要求I所述的高效表達Hst5的重組工程菌的構建方法，其特征在于構建方法如下 ⑴構建N端引入乳酸菌信號肽的Hst5基因，Hst5基因序列見序列6 ； ⑵將Hst5基因插入到乳酸菌表達載體的多克隆位點，構建得到Hst5重組質粒，所述重組質粒為pMG36e-Hst5 ； ⑶將Hst5重組質粒轉化至宿主菌，所述宿主菌為乳酸菌，得到Hst5重組乳酸菌。
4.根據權利要求3所述的高效表達Hst5的重組工程菌的構建方法，其特征在于所述步驟⑴中N端引入乳酸菌信號肽的Hst5基因通過DNA合成或重疊PCR方法獲得，在采用重疊PCR方法時，所用引物序列包括 序列從5’端到3,端 GCTGCTGCTTTATTAGCTGTTGCTCCAGTTGCTGCTTCAGCTGT TTCAACTGTTTCAGCAATTTA(X)TT TATA ACCATCrATG ACGTTTAGCATGTCrA^.^P2 TGAAACAGTTGAAAC CGCGTCGAC/VrGAAAAAAA^rTmCGTWrTGTTTCAGCTGCTG CTGCTGCTTTATTAGC _ .CGCAAGC'TTTTAATAACCACGATGTGAATGATGTTTTTCATGAAP4- ATTTACGTTTATAAC 在引物P3、P4中分別引入Sal I和HindII I酶切位點，下劃線部分，重疊PCR分為兩步第一步，以Pl和P2引物互為模板進行PCR擴增；第二步，以第一步獲得的PCR產物為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增得到目的基因。
5.一種如權利要求I所述的高效表達Hst5的重組工程菌作為防腐添加劑的應用。
6.一種如權利要求I所述的高效表達Hst5的重組工程菌作為發酵劑的應用。
全文摘要
本發明涉及一種高效表達Hst 5的重組工程菌及構建方法和應用，依照乳酸菌密碼子偏愛性優化Hst 5基因，通過PCR擴增得到優化后的Hst 5基因并引入乳酸菌信號肽基因，將該基因片段克隆到乳酸菌表達載體pMG36e中，構建得到pMG36e-Hst 5重組質粒。將重組質粒轉化到干酪乳桿菌、乳酸乳球菌等乳酸菌。本發明方法不僅為Hst 5的生產提供了一種新發方法，而且所獲得的Hst 5重組乳酸菌可作為優良的防腐添加劑及發酵劑用于食品、藥品、飼料等行業中。
文檔編號C12R1/245GK102719390SQ20121022751
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者何影影, 張同存, 李方, 王楠, 羅學剛 申請人:天津科技大學