專利名稱：miR-202實時熒光定量PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種miR-202實時熒光定量PCR檢測方法。
背景技術：
microRNA (miRNA)是一類由內源基因編碼的長度為18 24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，普遍存在于各種生物中。miRNA在各種生理和病理過程中起重要的作用，并參與生命過程中一系列的重要進程，包括細胞增殖、分化和凋亡，個體發育，機體代謝及免疫調節。這些miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過抑制翻譯或斷裂靶mRNA而調節基因的表達。miRNA并不是在發育的特定時段表達，而是更傾向于在特定細胞類型中表達。miRNA的這種表達模式具有分化的位相性和時序性，提示miRNA有可能作為參與調控基因表達的分子。現有技術尚無完整的miR-202的檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種準確、易操作的miR-202實時熒光定量PCR檢測方法。本發明的技術解決方案是一種miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是包括下列步驟(I)外周血中單個核細胞的分離取新鮮血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴細胞分離液，加入到15ml錐形離心管中，淋巴細胞分離液與血液的重量比為1:2 ;再將血液沿管壁鋪到淋巴細胞分離液上面，2000r/min下離心20min,取血楽；層與分層液交界處渾池的富含單個核細胞的灰白層,用生理鹽水洗滌2次，1500r/min離心lOmin，最后棄去上清，得分離的外周血中單個核細胞，_80°C冰箱保存；(2 )細胞中總RNA的提取取分離的外周血中單個核細胞5X IO6個，加入Iml Trizol，混勻，室溫靜置5min ;加入0. 2ml氯仿，振蕩15sec,室溫靜置2min ;4°C離心，12000r/min 15min,吸取上清至另一個I. 5ml離心管中；加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin ;4°C離心，12000r/minI Omin,吸棄上清；加入1111175%乙醇，洗漆沉淀,4°C離心,7500r/min 5min,吸棄上清；晾干，加入20iil0. I %焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解，采用紫外分光光度計檢測RNA溶液濃度及純度，取A260/A280在I. 8 2. I用于實驗；(3)逆轉錄合成cDNA反應體系用RNA template 2 u g, RT Primer2 u I, ddH20 補足至 11 U I,混勻離心,70°C放置lOmin，冰育 2min，再加入以下試劑RT buffer5X5u 1，dNTP mix2 u l,40U/u I 的 RNaseinhibitorO. 5u l,200U/u I 的 RT 酶 0. 1，ddH20 補足至 25 u 1，混勻，42°C 60min,70°CIOmin ;合成得到的cDNA放_80°C冰箱保存備用；(4)熒光定量PCR擴增檢測反應體系MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 ii 1，正反向5 ii M 的 Bulge-LoopTM miRNA Primer 各 5 y 1，RT-PCR 產物 2 y 1，RNase-free H2O 補足至50ii I ;95°C預變性 20sec，I 個循環；95°C 10sec,60°C 20sec,70°C 31sec，40 個循環；每管設立三個復孔；整個熒光定量PCR擴增反應過程冰上操作。步驟(4)后，還經下列步驟(5)熒光定量PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。步驟(2)中加入0. 1% DEPC H2O溶解是在65°C下促溶10 15min。本發明操作方便、檢測準確；所采用的實時熒光定量PCR檢測方法，巧妙地運用PCR技術的DNA高效擴增，高效、靈敏地檢測miR-202。 下面結合實施例對本發明作進一步說明。
具體實施例方式一種miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，包括下列步驟留取待檢全血標本3ml，用Ficoll淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞。miR-202 和 U6 小核 RNA (U6 snRNA)逆轉錄(RT)引物、Bulge-Loop miRNA 引物(廣州銳博生物科技有限公司)，淋巴細胞分離液(加拿大Cedarlane公司)，Trizol (美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑、MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ,立陶宛 Fermentas公司)，DNA分子標記(大連Takara生物工程公司)。(I)外周血中單個核細胞的分離無菌采取新鮮血液3ml，用EDTA抗凝。取淋巴細胞分離液(按與血液1:2的比例)，加入到15ml錐形離心管中，再將血液沿管壁輕輕鋪到分離液上面,2000r/min離心20min,取血漿層與分層液交界處渾濁的灰白層(富含單個核細胞)，用生理鹽水洗滌2次，1500r/min離心IOmin,最后棄去上清，_80°C冰箱保存。(2 )細胞中總RNA的提取取分離的外周血中單個核細胞5X IO6個，加入Iml Trizol，充分混勻，室溫靜置5min ;加入0. 2ml氯仿，充分振蕩15sec,室溫靜置2min ;4°C離心，12000r/min 15min,吸取上清(約500 ii I)至另一個I. 5ml離心管中；加入0. 5ml異丙醇,輕輕混勻，室溫靜置IOmin ;4°C離心，12000r/min IOmin,吸棄上清；加入lml75%乙醇，輕輕洗漆沉淀，4°C離心，7500r/min 5min，吸棄上清;晾干，加入20iil0. I %焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解(65°C促溶10 15min)。采用紫外分光光度計檢測RNA溶液濃度及純度，取A260/A280在I. 8
2.I用于實驗。(3 )逆轉錄合成cDNA反應體系RNA template2 U g, RT Primer2 U I, ddH20 補足至 11 U I,混勻離心，70 °C 放置IOmin,冰育 2min,再加入以下試劑RT buffer5X 5 u I, dNTP mix2 u I, RNase inhibitor(40U/u I) 0. 5 u 1，RT 酶(200U/ii I) 0. 5u 1，ddH20 補足至 25 y 1，混勻，42°C 60min,70°CIOmin。合成的cDNA放_80°C冰箱保存備用。(4)熒光定量PCR擴增反應反應體系MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 ii 1，正反向Bulge-LoopTM miRNA Primer (511]\0各5111，RT-PCR 產物 2 y 1，RNase-free H2O 補足至50 u I0 95°C預變性 20sec，I 個循環；95°C 10sec,60°C 20sec,70°C 31sec，40 個循環。每
管設立三個復孔。注整個過程冰上操作。
(5 )熒光定量PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳因miR-202和U6分子量小，所以PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，且隨時注意觀察，防止分子跑出膠外。(6)對上述建立熒光定量PCR檢測miR-202的方法進行特異性、重復性等方法學評價。結果計算反應設立3個復孔，記錄每個反應管中的熒光信號到達閾值時所經歷的PCR循環次數(Ct值)。取一樣本，連續3天內分別對miR-202和U6 snRNA進行批內和批間的重復性測定，每次重復5復管。根據側得的Ct值計算s、CV值。批內Ct值平均為26. 3928，CV 值為 I. 245% ;批間 Ct 值平均值 26. 4573，CV 值為 3. 218%。(7)統計學方法利用SPSS 15. 0統計軟件分析數據資料，計算均數(^ )、標準差 (S)和變異系數(CV)，檢驗水準a設為0.05，兩組樣本間結果作獨立樣本t檢驗分析，以P〈0. 05表示有統計學意義。
權利要求
1.一種miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是包括下列步驟 (1)外周血中單個核細胞的分離 取新鮮血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴細胞分離液，加入到15ml錐形離心管中，淋巴細胞分離液與血液的重量比為1:2 ;再將血液沿管壁鋪到淋巴細胞分離液上面，2000r/min下離心20min，取血漿層與分層液交界處渾濁的富含單個核細胞的灰白層，用生理鹽水洗滌2次，1500r/min離心lOmin，最后棄去上清，得分離的外周血中單個核細胞，_80°C冰箱保存； (2)細胞中總RNA的提取 取分離的外周血中單個核細胞5X IO6個,加入Iml Trizol,混勻，室溫靜置5min ;力口AO. 2ml氯仿,振蕩15sec,室溫靜置2min ;4°C離心，12000r/min 15min,吸取上清至另一個I. 5ml離心管中；加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin ;4°C離心，12000r/min IOmin, 吸棄上清；加入Iml 75%乙醇,洗漆沉淀，4°C離心，7500r/min 5min,吸棄上清；晾干,力口A 20 u 10. I %焦碳酸二乙酯H2O溶解，采用紫外分光光度計檢測RNA溶液濃度及純度，取A260/A280在I. 8 2. I用于實驗； (3)逆轉錄合成cDNA反應體系 用 RNA template 2 u g, RT Primer 2 u I, ddH20 補足至 11 u I,混勻離心，70°C放置lOmin，冰育 2min，再加入以下試劑RT buffer5X5u 1，dNTP mix 2u l,40U/u I 的 RNaseinhibitorO. 5u l,200U/u I 的 RT 酶 0. 1，ddH20 補足至 25 u 1，混勻，42°C 60min,70°CIOmin ;合成得到的cDNA放_80°C冰箱保存備用； (4)熒光定量PCR擴增檢測反應體系MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 U 1，正反向 5 ii M的 Bulge-LoopTM miRNA Primer 各 5 y 1，RT_PCR 產物 2 y l，RNase_free H2O 補足至 50 y I ；95°C預變性 20sec，I 個循環；95°C 10sec,60°C 20sec,70°C 31sec，40 個循環；每管設立三個復孔；整個熒光定量PCR擴增反應過程冰上操作。
2.根據權利要求I所述的miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是步驟(4)后，還經下列步驟 (5)熒光定量PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。
3.根據權利要求I所述的miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，其特征是步驟(2)中加入0. 1% DEPC H2O溶解是在65°C下促溶10 15min。
全文摘要
本發明公開了一種miR-202實時熒光定量PCR檢測方法，包括)外周血中單個核細胞的分離、細胞中總RNA的提取、逆轉錄合成cDNA反應體系、熒光定量PCR擴增檢測。本發明操作方便、檢測準確；所采用的實時熒光定量PCR檢測方法，巧妙地運用PCR技術的DNA高效擴增，高效、靈敏地檢測miR-202。
文檔編號C12Q1/68GK102732632SQ201210231259
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者吳信華, 張霞, 戚菁, 施維, 李曉紅, 王旭東, 申嫻娟, 郭益冰, 陸晶晶, 鞠少卿 申請人:南通大學附屬醫院