專利名稱：一種用多重pcr矩陣法進行高通量基因表達譜檢測的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域和分子診斷領域中的多重PCR矩陣檢測方法，特別是涉及一種集PCR引物設計、多重PCR矩陣、凝膠電泳及圖像采集、基因表達譜定量化及聚類分析為一體的多重PCR矩陣檢測方法及其在高通量基因表達譜檢測中的應用。
背景技術：
隨著基因組時代的到來，基因表達調控成為分子生物學及分子診斷學領域的研究重點。目前常用的基因表達調控檢測方法主要有=Southern blot、基因芯片、實時定量PCR、大規模基因測序及多重PCR等(Mukherjee et al. Intrachromosomal tandem duplicationand repeat expansion during attempts to inactivate the subtelomeric essentialgene GSHl in Leishmania. Nucleic Acids Res. 2011, doi:10. 1093/nar/gkr494;Osamu et al. Multiplex cDNA quantification method that facilitates the standardizationof gene expression data.2011, 39(10):e70. doi:10. 1093/nar/gkr138. Khan etal. Quantitative analysis of six gene products as candidate markers of earlyplacental villi development in the human. Indian J Physiol Pharmacol. 2010,54(4):299-308;Hua et al. Genomic profile of Toll-like receptor pathways intraumaticalIy brain-injured mice: effect of exogenous progesterone. J Neuroinflammation. 2011, doi :10. 1186/1742-2094-8-42)。其中，基于多重PCR技術規模化高通量篩選靶基因表達水平的變化對微生物分類鑒定等有重要意義。雖然傳統的基于基因芯片、實時定量PCR和大規模基因測序等技術能夠實現基因表達水平的檢測，但是由于它們存在假陽性率高、特異性差、成本高以及通常需要反轉錄PCR(RT-PCR)技術進行進一步驗證等缺點使其大規模應用受到了一定限制。同時，近年來出現的PCR陣列技術則以實時定量PCR技術為核心并結合陣列技術(張艷春，任長虹，高艷，屈武斌，張成崗.實時定量PCR陣列技術在規模化檢測基因表達中的應用.軍事醫學科學院院刊，2010，34(6) :589-591)，能夠用于檢測信號轉導過程、疾病相關通路等的基因表達圖譜，在規模化檢測基因表達方面具有一定的優勢，但是卻不具備高通量的特點。
發明內容
基于發明人長期從事PCR引物設計及評估、凝膠電泳及圖像采集分析、基因表達譜定量化及聚類分析的多學科研究，本發明的目的在于提出了一種多重PCR矩陣法進行高通量基因表達譜檢測的方法，旨在多重PCR基礎上結合矩陣技術更大規模地篩選靶基因，進而進行基因表達水平定量化及聚類分析，以獲得靶基因表達譜特征。本發明提供一種用多重PCR矩陣法進行高通量基因表達譜檢測的方法，包括多重PCR引物設計、多重PCR矩陣擴增、凝膠電泳及圖像采集和基因表達譜定量化及聚類分析。所述多重PCR矩陣法檢測包括以下步驟I)高度特異性引物設計、評估及合成；
2)模板制備 總RNA的提取及反轉錄；3)多重PCR矩陣反應體系加樣；4)多重PCR反應；5)多重PCR擴增產物凝膠電泳分離；6)凝膠電泳圖像采集及預處理；7)基因表達譜定量化分析；8)基因表達譜聚類分析，獲得具有顯著性差異的靶基因。所述步驟I)中的多重PCR引物包括多重PCR引物和基因特異反轉錄引物；多重
PCR引物用于多組具有潛在相關性靶基因表達譜的擴增及鑒定，可根據靶基因的基因組或mRNA序列設計多重PCR引物；基因特異反轉錄引物用于低豐度靶基因的擴增及鑒定，可根據低豐度基因的基因組或mRNA序列設計基因特異反轉錄引物。所述引物設計及評估可用以下軟件MPprimer、MFEprimer2. O、Primer3. O、PrimerPremier 6. O、01igo7. 35 和 DNAman,優選為 MPprimer 和 MFEprimer2. O。所述步驟2)中模板的制備方法中，首先提取生物體細胞的總RNA，然后用基于通用引物的常規反轉錄法或基于基因特異性引物與通用引物的兩步反轉錄法將總RNA反轉錄成cDNA ;所述反轉錄方法優選為基于基因特異性引物和通用引物的兩步反轉錄法。所述步驟3)中的加樣系統可以為自動加樣系統和手動加樣系統,優選為自動加樣系統。所述步驟5)中的凝膠電泳可以為瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳和脈沖場電泳等常規電泳。所述步驟6)中的凝膠電泳圖像采集系統可以為目前市售的各種凝膠圖像采集系統，針對多重PCR的不同擴增產物，首先采用凝膠電泳進行分離，然后用凝膠成像儀采集圖像并結合圖像處理軟件進行圖像預處理(包括圖片的刪減和明亮度的調節等)，最后用凝膠成像儀自帶軟件對不同的基因量進行灰度值分析。所述步驟7)中的基因表達譜定量化分析可以為內標基因的相對定量法、毛細管電泳或熒光探針絕對定量法等，優選為內標基因的相對定量法和毛細管電泳絕對定量法；所述內標基因的相對定量方法為根據步驟6)中的凝膠電泳圖像采集系統獲得的目的基因及內標基因的積分光密度值取比值以界定基因表達譜的相對變化趨勢；所述毛細管電泳的絕對定量為對多重PCR擴增產物直接進行毛細管電泳分離，然后結合熒光染料進行實時檢測目的基因的表達水平，最后利用定量Marker實現目的基因表達水平的絕對定量。所述步驟8)中的基因表達譜聚類分析方法為針對步驟7)中的基因表達譜定量化分析結果，采用生物信息學技術對不同基因進行聚類分析，具體分析過程如下①將步驟7)的基因表達譜定量化分析結果形成數據矩陣，每列為一個處理組，每行為一個基因，然后對基因(每一行)和樣本(每一列)都進行進一步的標準化，即每個值都除以所在行或列的標準差；②對①標準化后的矩陣進行無監督聚類分析使用已知的R軟件中分層聚類方法，對基因和處理組同時進行聚類分析；③對①標準化后的矩陣進行顯著性差異統計分析利用R軟件中SAM算法對①標準化后的矩陣進行分析，并且利用分析結果中的q-value (質量因數)對基因的顯著性差異進行假陽性控制，將質量因數小于5%定義為顯著性差異基因。以上所述的檢測方法用于檢測秀麗隱桿線蟲中33個Globin基因的表達譜，所述步驟I)中設計的多重PCR引物序列如序列表中序列1-76所示；所述步驟2)中的模板為秀麗隱桿線蟲mRNA ;所述步驟3)中的多重PCR矩陣反應體系可為=ExTaq酶O. 125 μ I (5U/μ I), 10XExTaq Buffer2. 5 μ I, dNTP Mixture2 μ 1，模板(cDNA濃度300 μ g/mL)l μ I,多重PCR引物I. 0μ I (上游引物濃度10pmol/L，下游引物濃度10pmol/L), ddH2016. 375 μ I ;所述步驟4)中的多重PCR反應條件為先95°C 5min;然后95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin,共35個循環；最后72°C 7min，4°C停止反應。所述的檢測方法可對于任意數量的基因表達水平和DNA含量進行多重PCR矩陣檢測。所述的檢測方法能夠在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加樣體系中同時進行多重PCR擴增和數據分析。
本發明的發明人基于在該領域的長期研究，將多重PCR技術和PCR矩陣檢測技術相結合，提出了以上多重PCR矩陣檢測技術，旨在進行多重PCR基礎上結合矩陣技術更大規模地篩選基因表達水平，并根據基因表達水平的高低將其進行聚類，以獲得靶基因表達譜特征。該技術不僅克服了傳統基于基因芯片、實時定量PCR和大規模基因測序等技術檢測基因表達水平方法在可靠性方面的不足，而且還可規模化、高通量、高可信度地獲得靶基因的表達譜。本發明提供了一種多重PCR矩陣檢測方法以及利用該檢測方法進行高通量核酸檢測的方法，與現有多重PCR檢測方法的區別在于集成了多重PCR引物設計、多重PCR矩陣檢測、凝膠電泳及圖像采集、基因表達譜定量化及聚類分析等技術，實現了多重PCR引物設計、規模化基因檢測、基因表達譜定量化及聚類分析，具有可規模化、高通量、高可信度等優點，并且具有十分廣泛的應用前景，有望成為高通量核酸檢測的重要技術手段之一。目前分別有報道多重PCR技術和PCR矩陣技術，但是卻并沒有發展出多重PCR矩陣技術。相對于目前的多重PCR技術和PCR矩陣技術而言，本發明集成了從多重PCR引物設計及特異性評估、多重PCR矩陣方式檢測、基因表達譜定量化和聚類分體為一體、能夠在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加樣體系中同時進行多重PCR擴增和數據分析的新型多重PCR系統，具有規模化程度高、假陽性率低等優點。通過該多重PCR矩陣檢測方法，不僅可實現基因表達譜的定量化分析，而且可實現基因表達譜的聚類分析，進而為功能基因間相互調控關系的研究提供重要技術參考。本發明檢測方法由PCR引物設計、多重PCR矩陣、凝膠電泳及圖像采集、基因表達譜定量化及聚類分析等部分組成，具有假陽性率低、規模化程度高等特點，具有十分廣泛的應用前景。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖I為本發明多重PCR矩陣檢測方法的整體框架2為用本發明的多重PCR矩陣檢測方法對秀麗隱桿線蟲33個Globin基因的表達變化進行檢測的流程圖
圖3為用多重PCR矩陣檢測方法及基因特異性引物對秀麗隱桿線蟲33個Globin基因的表達變化進行檢測的虛擬電泳4為本發明多重PCR矩陣檢測方法中秀麗隱桿線蟲體內33個Globin基因多重PCR擴增產物的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜圖5為用圖像分析技術對上述瓊脂糖凝膠電泳圖譜中的核酸條帶進行識別和參數計算的結果圖6為用無監督分層聚類方法對秀麗隱桿線蟲體內33個Globin基因的鑒定結果進行聚類分析結果圖7為用SAM算法對秀麗隱桿線蟲體內33個Globin基因鑒定結果進行差異分析 結果
具體實施例方式本發明提供了一種用于高通量基因表達譜檢測的多重PCR矩陣檢測方法，該檢測方法包括多重PCR引物設計、多重PCR矩陣擴增、凝膠電泳及圖像采集和基因表達譜定量化及聚類分析。具體來講，所述多重PCR矩陣檢測方法，可包括以下步驟I)高度特異性引物設計、評估及合成；2 )模板制備總RNA的提取及反轉錄；3)多重PCR矩陣反應體系加樣；4)多重PCR反應；5)多重PCR擴增產物凝膠電泳分離；6 )凝膠電泳圖像采集及預處理；7)基因表達譜定量化分析；8)基因表達譜聚類分析。在上述多重PCR矩陣檢測方法中，所述步驟I)中的多重PCR引物包括常規多重PCR引物和基因特異反轉錄引物；常規多重PCR引物用于多組具有潛在相關性靶基因表達譜的擴增及鑒定，可根據靶基因的基因組或mRNA序列設計多重PCR引物；基因特異反轉錄引物用于低豐度靶基因的擴增及鑒定，可根據低豐度基因的基因組或mRNA序列設計基因特異反轉錄引物。所述引物設計及評估可用以下軟件MPprimer、MFEprimer2. O、Primer3. O、PrimerPremier 6. O、01igo7. 35 和 DNAman,優選為 MPprimer 和 MFEprimer2. O。所述步驟2)中模板的制備方法中，首先提取生物體細胞的總RNA，然后用基于通用引物的常規反轉錄法或基于基因特異性引物與通用引物的兩步反轉錄法將總RNA反轉錄成cDNA ;所述反轉錄方法優選為基于基因特異性引物和通用引物的兩步反轉錄法。所述步驟3)中的加樣系統可以為自動加樣系統和手動加樣系統,優選為自動加樣系統。所述步驟4)中的凝膠電泳可以為瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳和脈沖場電泳等常規電泳。所述步驟5)中的凝膠電泳圖像采集系統可以為目前市售的各種凝膠圖像采集系統。針對多重PCR的不同擴增產物，首先采用凝膠電泳進行分離，然后用凝膠成像儀采集圖像并結合圖像處理軟件進行圖像預處理(包括圖片的刪減和明亮度的調節等)，最后用凝膠成像儀自帶軟件對不同的基因量進行灰度值分析。所述步驟6)中的凝膠電泳圖像采集系統可以為目前市售的各種凝膠圖像采集系統，針對多重PCR的不同擴增產物，首先采用凝膠電泳進行分離，然后用凝膠成像儀采集圖像并結合圖像處理軟件進行圖像預處理(包括圖片的刪減和明亮度的調節等)，最后用凝膠成像儀自帶軟件對不同的基因量進行灰度值分析。所述步驟7)中的基因表達譜定量化分析可以為內標基因的相對定量法、毛細管電泳或熒光探針絕對定量法等，優選為內標基因的相對定量法和毛細管電泳絕對定量法；所述內標基因的相對定量方法為根據步驟6)中的凝膠電泳圖像采集系統獲得的目的基因及內標基因的積分光密度值取比值以界定基因表達譜的相對變化趨勢；所述毛細管電泳的絕對定量為對多重PCR擴增產物直接進行毛細管電泳分離，然后結合熒光染料進行實時檢測目的基因的表達水平，最后利用定量Marker實現目的基因表達水平的絕對定量。
所述步驟8)中的基因表達譜聚類分析方法為針對步驟7)中的基因表達譜定量化分析結果，采用生物信息學技術對不同基因進行聚類分析，具體分析過程如下①將步驟7)的基因表達譜定量化分析結果形成數據矩陣，每列為一個處理組，每行為一個基因，然后對基因(每一行)和樣本(每一列)都進行進一步的標準化，即每個值都除以所在行或列的標準差；②對①標準化后的矩陣進行無監督聚類分析使用已知的R軟件中分層聚類方法，對基因和處理組同時進行聚類分析；③對①標準化后的矩陣進行顯著性差異統計分析利用R軟件中SAM算法對①標準化后的矩陣進行分析，并且利用分析結果中的q-value (質量因數)對基因的顯著性差異進行假陽性控制，將質量因數小于5%定義為顯著性差異基因。以上步驟中，步驟7)結合內參基因的積分光密度值對其它各條帶進行標準化，增加了不同實驗組中核酸電泳條帶信號值的可比性，提高了整個方法體系的定量效果；步驟①特別針對多重PCR矩陣檢測時噪聲較大的特點，對數據進行進一步的標準化，特異地提高了基因表達檢測的信噪比；步驟②和③將國際上用于基因芯片數據分析的方法加以繼承，發揮了多重PCR矩陣中高通量方法的可視化等，能夠直觀、清楚地將基因的表達變化展示出來，并且采用嚴格的統計方法進行差異檢驗。這些步驟都明顯地區別于經典的PCR實驗方法，是多重PCR矩陣方法所特有的數據分析方法。在下述實施例中，用本發明的多重PCR矩陣檢測方法檢測秀麗隱桿線蟲中33個Globin基因的表達變化，所述步驟I)中設計的多重PCR引物序列如序列表中序列1_76所示；所述步驟2)中的模板為秀麗隱桿線蟲mRNA ;所述步驟3)中的多重PCR矩陣反應體系可為ExTaq 酶 O. 125 μ I (5U/μ I)，IOXExTaq Buffer2. 5 μ I, dNTP Mixture2 μ 1，模板(cDNA濃度300 μ g/mL) I μ 1，多重PCR引物I. O μ I (上游引物濃度10pmol/L，下游引物濃度10pmol/L)，ddH2016. 375 μ I ;所述步驟4)中的多重PCR反應條件為:先95°C 5min ;然后95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin，共35個循環；最后72°C 7min，4°C停止反應。該實施例的矩陣數量為8組，即分為8管進行多重PCR擴增，其中每組中分別使用了 4-6重PCR進行說明，構成了一個含有8組擴增體系的、含有4-6重的多重PCR矩陣擴增體系。類似地，本發明也能夠在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加樣體系中同時進行多重PCR擴增和數據分析。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I、利用本發明的多重PCR矩陣檢測方法對秀麗隱桿線蟲33個Globin基因的表達譜進行檢測如圖I所示，本發明的多重PCR矩陣檢測方法對目的基因的表達譜進行檢測，是首先針對目的基因獲得基因序列并進行多重PCR引物設計前的預處理(包括保守性分析和引物設計區域分析等)，進而采用引物設計及特異性評估軟件針對目的基因序列進行多重PCR引物設計；緊接著針對設計的引物進行稀釋、制備模板和多重PCR擴增以獲得目的基因；然后針對多重PCR擴增產物采用凝膠電泳進行分離、采集圖像及預處理；最后針對基因表達鑒定結果進行定量化和聚類分析。具體來講，用本發明的多重PCR矩陣檢測方法對秀麗隱桿線蟲33個Globin基因的表達譜進行檢測，如圖2所示，具體方法包括以下步驟 I)高度特異性引物設計、評估及合成針對秀麗隱桿線蟲33個Globin基因信息，以act_l為內參基因，分別從NCBI數據庫下載相關基因序列，進而采用多重PCR引物設計軟件MPprimer (http://biocompute,bmi. ac. cn/MPprimer/)進行多重PCR引物設計，多重PCR引物序列如表I所示(表I總共引物有76條,38對),并采用引物特異性評估軟件MFEprimer2. O (http://biocompute· bmi.ac. cn/MFEprimer/)進行特異性評估及虛擬化分析(虛擬電泳圖如圖3所示(圖中，橫向1-34依次表示不同電泳泳道，泳道1-33 (從左向右)為單重虛擬結果，泳道34 (最右一道)為33重虛擬結果，其中白色條帶表示不同核酸片段)，最后將設計的引物送英俊公司直接合成備用。通過上述引物設計及特異性評估方法，可以根據實驗目的獲得任意目的基因的多重PCR擴增引物。表I用于對秀_隱桿線蟲33個Globin基因的表達譜進行多重PCR矩陣檢測的多重PCR引物序列
權利要求
1.一種用多重PCR矩陣法進行高通量基因表達譜檢測的方法，包括多重PCR引物設計、多重PCR矩陣擴增、凝膠電泳及圖像采集和基因表達譜定量化及聚類分析。
2.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，多重PCR矩陣法檢測包括以下步驟 O高度特異性引物設計、評估及合成； 2)模板制備總RNA的提取及反轉錄； 3)多重PCR矩陣反應體系加樣； 4)多重PCR反應； 5)多重PCR擴增產物凝膠電泳分離； 6)凝膠電泳圖像采集及預處理； 7)基因表達譜定量化分析； 8)基因表達譜聚類分析，獲得具有顯著性差異的靶基因。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述步驟I)中的多重PCR引物包括多重PCR引物和基因特異反轉錄引物；多重PCR引物用于多組具有潛在相關性靶基因表達譜的擴增及鑒定，可根據靶基因的基因組或mRNA序列設計多重PCR引物；基因特異反轉錄引物用于低豐度靶基因的擴增及鑒定，可根據低豐度基因的基因組或mRNA序列設計基因特異反轉錄引物。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述引物設計及評估可用以下軟件MPprimer、MFEprimer2. O、Primer3. O、Primer Premier 6. 0、Oligo7. 35 和 DNAman,優選為MPprimer 和 MFEprimer2. 0。
5.根據以上任一權利要求所述的檢測方法，其特征在于所述步驟2)中模板的制備方法中，首先提取生物體細胞的總RNA，然后用基于通用引物的常規反轉錄法或基于基因特異性引物與通用引物的兩步反轉錄法將總RNA反轉錄成cDNA ;所述反轉錄方法優選為基于基因特異性引物和通用引物的兩步反轉錄法。
6.根據以上任一權利要求所述的檢測方法，其特征在于所述步驟3)中的加樣系統可以為自動加樣系統和手動加樣系統，優選為自動加樣系統。
7.根據以上任一權利要求所述的檢測方法，其特征在于所述步驟5)中的凝膠電泳可以為瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳和脈沖場電泳等常規電泳。
8.根據以上任一權利要求所述的檢測方法，其特征在于所述步驟6)中的凝膠電泳圖像采集系統可以為目前市售的各種凝膠圖像采集系統，針對多重PCR的不同擴增產物，首先采用凝膠電泳進行分離，然后用凝膠成像儀采集圖像并結合圖像處理軟件進行圖像預處理(包括圖片的刪減和明亮度的調節等)，最后用凝膠成像儀自帶軟件對不同的基因量進行灰度值分析。
9.根據以上任一權利要求所述的檢測方法，其特征在于所述步驟7)中的基因表達譜定量化分析可以為內標基因的相對定量法、毛細管電泳或熒光探針絕對定量法等，優選為內標基因的相對定量法和毛細管電泳絕對定量法； 所述內標基因的相對定量方法為根據步驟6)中的凝膠電泳圖像采集系統獲得的目的基因及內標基因的積分光密度值取比值以界定基因表達譜的相對變化趨勢； 所述毛細管電泳的絕對定量為對多重PCR擴增產物直接進行毛細管電泳分離，然后結合熒光染料進行實時檢測目的基因的表達水平，最后利用定量Marker實現目的基因表達水平的絕對定量。
10.根據以上任一權利要求所述的檢測方法，其特征在于所述步驟8)中的基因表達譜聚類分析方法為針對步驟7)中的基因表達譜定量化分析結果，采用生物信息學技術對不同基因進行聚類分析，具體分析過程如下 ①將步驟7)的基因表達譜定量化分析結果形成數據矩陣，每列為一個處理組，每行為一個基因，然后對基因(每一行)和樣本(每一列)都進行進一步的標準化，即每個值都除以所在行或列的標準差； ②對①標準化后的矩陣進行無監督聚類分析使用已知的R軟件中分層聚類方法，對基因和處理組同時進行聚類分析； ③對①標準化后的矩陣進行顯著性差異統計分析利用R軟件中SAM算法對①標準化后的矩陣進行分析，并且利用分析結果中的q-value (質量因數)對基因的顯著性差異進行假陽性控制，將質量因數小于5%定義為顯著性差異基因。
11.根據權利要求1-10任一項所述的檢測方法，其特征在于檢測秀麗隱桿線蟲中33個Globin基因的表達譜，所述步驟I)中設計的多重PCR引物序列如序列表中序列1_76所示；所述步驟2)中的模板為秀麗隱桿線蟲mRNA ;所述步驟3)中的多重PCR矩陣反應體系可為ExTaq 酶 O. 125 μ I (5U/μ I )，IOXExTaq Buffer 2. 5 μ I, dNTPMixture 2μ1，模板(cDNA濃度300yg/mL) I μ 1，多重PCR引物Ι.Ομ I (上游引物濃度10pmol/L，下游引物濃度10pmol/L)，ddH20 16. 375 μ I ;所述步驟4)中的多重PCR反應條件為先95°C 5min ;然后 95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin，共 35 個循環；最后 72°C 7min，4°C停止反應。
12.根據權利要求1-11任一項所述的檢測方法，其特征在于可對于任意數量的基因表達水平和DNA含量進行多重PCR矩陣檢測。
13.根據權利要求1-12任一項所述的檢測方法，其特征在于能夠在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加樣體系中同時進行多重PCR擴增和數據分析。
全文摘要
本發明公開了一種用多重PCR矩陣法進行高通量基因表達譜檢測的方法，包括多重PCR引物設計、多重PCR矩陣擴增、凝膠電泳及圖像采集和基因表達譜定量化及聚類分析。本發明能夠在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加樣體系中同時進行多重PCR擴增和數據分析，具有可規模化、高通量、高可信度等優點，并且具有十分廣泛的應用前景，有望成為基因表達水平和核酸高通量檢測的重要技術手段之一。
文檔編號C12Q1/68GK102864219SQ201210233318
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月5日 優先權日2011年7月5日
發明者張成崗, 吳永紅, 盧一鳴, 屈武斌, 李軍懷, 高艷, 李志慧 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所, 蘇州科景生物醫藥科技有限公司