高脂血癥易感性無創檢測試劑盒（apob等基因）的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測高脂血癥易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C(rs4149032)的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與高脂血癥發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型從基因層面來評估高脂血癥發病的風險級別，指導人群提早預防疾病的發生。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】高脂血癥易感性無創檢測試劑盒(APOB等基因)
【技術領域】
[0001]本項目屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種高脂血癥易感基因無創檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估高脂血癥遺傳易感性的風險級別，并作為高脂血癥的建議指導。
【背景技術】
[0002]隨著人們生活水平的提高，心腦血管疾病患者有逐年增加趨勢，心腦血管疾病已成為繼癌癥之后導致人類死亡的又一大殺手！大量研究表明:高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)等脂質代謝紊亂病癥是引起心腦血管疾病不可忽視的重要原因。高脂血癥是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)、腦梗死、心臟猝死等疾病重要的危險因素，同時也是引起高血壓、糖耐量異常、糖尿病等其他重要臟器病變的一個重要危險因素。高脂血癥發病受遺傳、環境和生活方式等多因素影響。在遺傳因素的影響方面，現有研究發現多個基因與血脂水平相關，Apo B基因EcoR I位點多態性和MTHFR基因上C677T位點多態性均與HLP密切相關，可以作為受檢者是否屬于易患高脂血癥人群的預測依據。而數據顯示SLC01B1基因多態性影響部分藥物的治療效果，因此該位點的基因型檢測結果可以幫助醫生給出用藥建議。
[0003]人載脂蛋白B (apoprotein B, Apo B)作為低密度脂蛋白(LDL)受體的配體介導細胞內膽固醇的清除，在脂類轉運和代謝過程中起著極其重要的作用。Apo B基因位于2號染色體短臂上，全長43kb，mRNA長度為14kb，可編碼4536個氨基酸。研究表明該基因存在明顯的多態性，其中EcoR I位點與血脂異常相關，EcoR I多態性是由于外顯子29中第4154位密碼子突變(GAA-AAA)，氨基酸序列上由賴氨酸取代谷氨酸。胡鵬等通過分析EcoR I位點多態性與血清總蛋白(TP)、白蛋白(AIB)、球蛋白a( GL0)、血脂、脂蛋白(Lpa)等的關系，表明點突變所造成的EcoR I酶切位點的部分或完全缺失，可以明顯升高兒童血脂水平，同時降低血清蛋白水平，因而該位點可作為檢測高脂血癥指標之一。
[0004]亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)是血衆同型半胱氨酸(Hcy)再甲基化代謝的關鍵酶之一，由于基因突變導致酶活性降低往往會影響血漿Hcy水平。其中C677T突變常常引起輕至中度高同型半胱氨酸血癥。MTHFR在C677T位點目的基因長度為198bp，677位基因座原有的堿基C突變為堿基T后可產生一個Hinf I限制性酶切位點，而野生型基因序列中無這一位點。研究表明MTHFR基因C677T位點多態性可能與聞膽固醇血癥相關，T等位基因突變可能是聞膽固醇血癥的危險因素。
[0005]有機陰離子轉運多肽0ATP1B1 (又稱0ATP-C，0ATP2, LST1，編碼基因SLC01B1)是一種特異性分布于肝細胞基底膜上的一種轉運蛋白，和體內諸多內源性或外源性物質的肝臟攝取作用關系密切。例如膽汁酸、硫化和葡萄糖醛酸化結合物、甲狀腺激素、多肽、甲氨喋呤和他汀類藥物等都是0ATP1B1轉運的底物。目前為止，OATPIBI基因上已陸續發現超過20種單核苷酸多態性(SNP)的突變，而這將會導致細胞對0ATP1B1底物的攝取能力大大降低，并與轉運功能異常有關。醫學工作者通過對來自全國的24名健康男性基因分型及其對高脂血癥常用藥物匹伐他汀的吸收結果發現，521 T > C突變組對匹伐他汀的吸收顯著低于野生型521TT純合子，這表明該基因的突變將降低對藥物的正常吸收，進而影響高脂血癥的治療效果。
[0006]綜上所述，鑒于ApoB基因、MTHFR基因和SLC01B1基因在高脂血癥發生過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在高脂血癥發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患高脂血癥高危人群，從而根據檢測結果盡早采取預防措施并提出治療建議，這對于降低高脂血癥發病率有非常重要的意義。
【發明內容】
[0007]基于APOB 基因上 EcoR 1、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC01B1 基因上T521C (rs4149032)的3個單核苷酸多態性位點基因型可用來評估高脂血癥發病風險級另O，本發明提供一種高脂血癥基因無創檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測 APOB 基因上 EcoR 1、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC01B1 基因上 T521C(rs4149032)的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)； PCR產物純化組件(包括S AP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本發明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應體系:10 XPCR 反應緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0010]PCR 產物純化體系:iu/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0011]測序反應體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0012]本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0014]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0015]
實施例1.檢測試劑盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。[0016]2、PCR擴增反應
使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對:
(I)APOB (EcoR I )正向引物:5’TGGCTTGCTAACCTCTCTG3’
APOB (EcoR I )反向引物:5’ CTTGAGAGACTGAATGGC3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)SLC01B1 (T521C)正向引物:5’ TCTATCCTTACACTTCACC3’
SLC01B1 (T521C)反向引物:5’ACGCACAACTTGGATTAGC3’
PCR擴增的反應體系為:10XPCR反應緩沖液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul ；
反應條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0017]3、PCR擴增產物純化 使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul ;
在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min, 72°C、20min。
[0018]4、DNA測序反應
使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)APOB(EcoR I )測序引物:5’TGGCTTGCTAACCTCTCTG3’
(2)MTHFR (C677T)測序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)SLC01B1 (T521C)測序引物:5’ TCTATCCTTACACTTCACC3’
反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul。
[0019]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 2min，進行25個循環的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0020]反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0021]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0022]實施例2.為人群進行預防高脂血癥基因無創檢測的服務
1.采樣及抽提DNA
由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
[0023]2.基因型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的APOB基因上EcoR 1、MTHFR基因上C677T (rsl801133)、SLC01Bl基因上T521C (rs4149032)的3個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0024]3.高脂血癥高危人群風險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具高脂血癥風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者 APOB基因上EcoR 1、MTHFR基因上 C677T (rsl801133)、SLC01B1 基因上 T521C(rs4149032)的3個SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受 檢者詳細說明和解讀高脂血癥基因無創檢測報告單。
【權利要求】
1.一種篩查高脂血癥高危人群的基因無創檢測試劑盒，其特征在于:檢測APOB基因上 EcoR 1、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC01B1 基因上 T521C (rs4149032)的 3 個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20坐寸ο
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對APOB基因上 EcoR 1、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC01B1 基因上 T521C (rs4149032)的 3個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對APOB基因上 EcoR 1、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC01B1 基因上 T521C (rs4149032)的 3 個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下: (I)APOB (EcoR I )正向引物:5’TGGCTTGCTAACCTCTCTG3’ APOB (EcoR I)反向引物:5’ CTTGAGAGACTGAATGGC3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’ (3) SLC01B1 (T521C)正向引物:5’TCTATCCTTACACTTCACC3’
SLC01B1 (T521C)反向引物:5’ACGCACAACTTGGATTAGC3’。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)APOB(EcoR I )測序引物:5’TGGCTTGCTAACCTCTCTG3’ (2)MTHFR (C677T)測序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)SLC01B1 (T521C)測序引物:5’ TCTATCCTTACACTTCACC3’。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應體系:10父？0?反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應體系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540648SQ201210235657
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月10日 優先權日:2012年7月10日
【發明者】鄭俊斌 申請人:解碼（上海）生物醫藥科技有限公司