專利名稱：一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗的制備方法，特別是涉及一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法。
背景技術：
近年來隨著人口流動增加，艾滋病蔓延以及新型結核菌株，多重耐藥菌株的出現，結核病一改過去逐年遞減的趨勢，發生回潮，病例數明顯增加，發病率以每年20%的速度遞增，成為死亡率最高的感染性疾病。因此預防接種對結核病的控制和消滅起著關鍵性的作用。目前預防接種防治結核病以卡介苗(BCG)作為唯一臨床使用的疫苗，預防效果并不穩定。BCG是由一株患結核性乳腺炎的奶牛身上分離到的牛型結核分支桿菌，經過230次·連續傳代減毒而失去了一些編碼具有免疫保護作用的抗原基因。同時BCG的接種會使結核菌素試驗陽性，對結核病的診斷產生干擾，延誤治療時間，因此研制新疫苗成為當前結核病防治的首要任務。口服疫苗不但能有效地誘導膜系統的特異性免疫力，而且口服給藥的途徑簡單、安全，避免了注射疫苗所需要的嚴格標準，不需高度專業訓練的衛生人員即可同時開展大量人群的免疫，因此口服DNA疫苗是一種易于普遍接受的疫苗接種形式。本發明選用目的抗原基因為Ag85A，相對分子質量為32 KD,存在于結核桿菌和BCG的細胞壁及培養濾液中，可顯著刺激細胞免疫功能增強。本發明涉及重組真核表達質粒P⑶NA3. l+/Ag85A的構建，其編碼蛋白可在腸粘膜、脾和淋巴結等處表達，可明顯刺激全身性的細胞免疫和體液免疫應答，如細胞毒活性和特異性IgG抗體產生，還可以使腸粘膜局部產生特異性分泌型IgA，可極大增強免疫應答，而經注射途徑不能誘導此種分泌型IgA的分泌。以往單純應用裸DNA疫苗存在極大缺陷，經口服攝入在胃腸道內穩定性差，而且胃腸粘膜對抗原遞呈產生的免疫應答較弱，所以口服免疫所需的抗原量大，這就限制了口服疫苗的應用。本發明選用脂質體為運載體包裹口服疫苗，防止降解，有效的誘導機體產生免疫應答，同時脂質體可用作疫苗的保護劑，可防止核酸被體內物質降解，可將其特異性傳遞到靶細胞中；無毒、無免疫性，具有生物惰性，可生物降解；易于制備，使用方便，可將大的DNA片斷轉運到細胞中；基因轉染率高，100%離體細胞可以瞬間表達外源基因。
發明內容
本發明的目的在于提供一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法，以脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗具備穩定表達目的蛋白的免疫預防效果，由于脂質體的運載達到無毒無干擾的安全口服要求，可顯著刺激細胞免疫功能增強，為口服DNA疫苗的臨床應用研究奠定基礎。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法,其所述方法包括重組真核表達質粒pCDNA3. l+/Ag85A的構建、薄膜分散法制備脂質體、脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備，具體過程為重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A的構建包括引物設計、結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基、聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因、純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T載體、藍白斑篩選、亞克隆入真核表達載體p⑶NA3. 1+鑒定正確后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌菌株DH5 a，構建重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A，從受體菌DH 5a中提取純化pUCm_Ag85A，堿變性方法提取重組真核表達質粒P⑶NA3. l+/Ag85A ;薄膜分散法制備脂質體包括磷酸鹽緩沖液的配制及得到脂質體；脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備包括將溶液I. 5毫升加A 5毫升離心管中，同時加入I. 5毫升的重組真核表達 質粒p⑶NA3. l+/Ag85A,將5毫升離心管置于漩渦混合器充分混合震搖5分鐘后放入4 1冰箱靜置2小時，使成均勻的DNA脂質體混懸液，取出5毫升離心管，充氮氣后用膠塞密閉置于4 °C冰箱保存備用，此離心管中的混懸液即為結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗。所述的一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法,其所述結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基，為37°C培養8周，小量抽提DNA為模板；聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因；為94°C預變性15分鐘，熱啟動后轉入94°C變性I分鐘，60°C退火I. 5分鐘，72°C延伸2分鐘，進行30個循環，72°C延伸10分鐘后終止反應，反應結束后取5微升產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化聚合酶鏈式反應產物。所述的一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法，其所述純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T載體按pUCm-T載體PCR擴增試劑盒建立反應體系IOx緩沖液I微升，pUCm-T載體I微升，聚合酶鏈式反應產物3微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，25 °C連接30分鐘；連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，取100微升轉化后的菌液鋪于10毫升含600微克氨芐青霉素、800微克IPTG、80微克X_gal的肉湯蛋白胨瓊脂平板，平放30分鐘后，37°C倒置培養12-16小時；藍白斑篩選待藍色充分顯現，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨芐青霉素的肉湯蛋白胨培養基，于37°C水浴鍋中以200轉/分鐘速度振搖培養過夜，并擴增氨芐青霉素抗性克隆，質粒提取試劑盒小量抽提質粒。所述的一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法，其所述受體菌DH 5 a中提取純化pUCm-Ag85A，經限制性內切酶Xho I及BamH I雙酶切，回收小片段作為目的基因，將其亞克隆入真核表達載體P⑶NA3. 1+同樣經Xho I及BamH I雙酶切后所回收的大片段；連接反應體系載體I微升，目的基因4微升，IOx緩沖液I微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，4°C過夜。第二天取連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒行雙酶切及測序鑒定；堿變性方法提取重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A,將所得質粒保存于pH8. 0 Tris鹽酸緩沖液，使其終濃度為250微克/毫升。所述的一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法，其所述薄膜分散法制備脂質體包括
(1)磷酸鹽緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉0.37克與磷酸二氫鈉2. 0克；加蒸餾水溶解并稀釋至1000毫升，調節該溶液PH值為5. 7 ;
(2)稱取注射用豆磷脂0.9克、膽固醇0. 3克；加入50ml容量的小燒杯中，加入無水乙醇2毫升，置于65 70°C水浴鍋中，用玻璃棒攪拌使豆磷脂及膽固醇充分溶解，旋轉該小燒杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風，將乙醇揮發除去；
(3)將步驟二中第I點所述的磷酸鹽緩沖液30毫升加入小燒杯中并將小燒杯置于65 70°C水浴鍋中預熱，20分鐘后，將預熱的磷酸鹽緩沖液30毫升加入步驟二中第2點所制備的含有磷脂和膽固醇脂質膜的小燒杯中，65 70°C水浴中攪拌水化10分鐘；隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌30分鐘，如果溶液體積減少，可補加水至30毫升，充分混勻，即可得到脂質體。對本發明技術方案進一步說明
一、重組真核表達質粒P⑶NA3. l+/Ag85A的構建
1.引物設計 根據基因文庫中Ag85A基因序列，聚合酶鏈式反應所用引物上游引物5’ - CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC -3’，含限制性內切酶BamHI酶切位點；下游引物5’-GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3’含限制性內切酶Xho I酶切位點，并在開放閱讀框架終止密碼子之后，Ag85A含信號肽序列，確保克隆基因開放讀碼框正確；
2.結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基，37°C培養8周，小量抽提DNA為模
板；
3.聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因；
94°C預變性15分鐘，熱啟動后轉入94°C變性I分鐘，60°C退火I. 5分鐘，72°C延伸2分鐘，進行30個循環，72°C延伸10分鐘后終止反應，反應結束后取5微升產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化聚合酶鏈式反應產物；
4.純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T載體
按pUCm-T載體PCR擴增試劑盒建立反應體系IOx緩沖液I微升，pUCm_T載體I微升，聚合酶鏈式反應產物3微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，25 °C連接30分鐘；連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，取100微升轉化后的菌液鋪于10毫升含600微克氨芐青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉湯蛋白胨瓊脂平板，平放30分鐘后，37°C倒置培養12-16小時；
5.藍白斑篩選
待藍色充分顯現，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨芐青霉素的肉湯蛋白胨培養基，于37°C水浴鍋中以200轉/分鐘速度振搖培養過夜，并擴增氨芐青霉素抗性克隆，質粒提取試劑盒小量抽提質粒；
6.亞克隆入真核表達載體p⑶NA3.1+鑒定正確后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌菌株DH5 a，構建重組真核表達質粒pCDNA3. l+/Ag85A ；
7.從上述受體菌DH5a中提取純化pUCm-Ag85A，經限制性內切酶Xho I及BamH I雙酶切，回收小片段作為目的基因，將其亞克隆入真核表達載體P⑶NA3. 1+同樣經Xho I及BamH I雙酶切后所回收的大片段；連接反應體系載體I微升，目的基因4微升，IOx緩沖液I微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，4°C過夜。第二天取連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒行雙酶切及測序鑒定；
8.堿變性方法提取重組真核表達質粒p⑶NA3.l+/Ag85A,將所得質粒保存于pH8. 0Tris鹽酸緩沖液，使其終濃度為250微克/毫升；采用此方法獲得的重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A經PCR及雙酶切證實成功構建了攜帶Ag85A基因的重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A，后者成功轉化感受態大腸桿菌DH5a ;分別以17啟動子引物和BGH通用序列對重組質粒進行正反雙向測序，表明Ag85A DNA已被克隆到真核表達載體p⑶NA3. 1+中CMV啟動子的下游，且插入后閱讀框正確；經測序分析所克隆Ag85A與基因文庫中結核分枝桿菌Ag85A核苷酸編碼的氨基酸同源性為100% ；
二.薄膜分散法制備脂質體
1.磷酸鹽緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉0.37克與磷酸二氫鈉2. 0克；加蒸餾水溶解并稀釋至1000毫升，調節該溶液PH值為5. 7 ;
2.稱取注射用豆磷脂0.9克、膽固醇0. 3克；加入50ml容量的小燒杯中，加入無水乙醇2毫升，置于65 70°C水浴鍋中，用玻璃棒攪拌使豆磷脂及膽固醇充分溶解，旋轉該小燒·杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風，將乙醇揮發除去；
3.將步驟二中第I點所述的磷酸鹽緩沖液30毫升加入小燒杯中并將小燒杯置于65 70°C水浴鍋中預熱，20分鐘后，將預熱的磷酸鹽緩沖液30毫升加入步驟二中第2點所制備的含有磷脂和膽固醇脂質膜的小燒杯中，65 70°C水浴中攪拌水化10分鐘；隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌30分鐘，如果溶液體積減少，可補加水至30毫升，充分混勻，即可得到脂質體；
三.脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備
將步驟二中第3點所述的溶液I. 5毫升加入5毫升離心管中，同時加入I. 5毫升的步驟一中第8點所述的重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A,將5毫升離心管置于漩渦混合器充分混合震搖5分鐘后放入4 1冰箱靜置2小時，使成均勻的DNA脂質體混懸液，取出5毫升離心管，充氮氣后用膠塞密閉置于4 °C冰箱保存備用，此離心管中的混懸液即為結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗。本發明根據結核分枝桿菌Ag85A的基因序列自行設計了一對PCR引物，以人型結核桿菌H37Rv標準毒力株的DNA為模板，經過PCR擴增出其Ag85A目的基因，將回收的PCR產物用限制性核酸內切酶Xhol和BamHI雙酶酶切后，經T4 DNA連接酶作用，與真核表達載體p⑶NA3. 1+連接，篩選得到的陽性克隆經DNA測序鑒定證實為Ag85A基因，且被克隆到載體p⑶NA3. 1+中的CMV啟動子的下游，構建重組質粒p⑶NA3. l+/Ag85A.將其轉化大腸桿菌并使之大量擴增，并采用堿變性方法提取重組真核表達質粒P⑶NA3. l+/Ag85A，應用薄膜分散法制備脂質體進行包裹，制得結核桿菌Ag85A 口服DNA疫苗，具備穩定表達目的蛋白的免疫預防效果，并且由于脂質體的運載達到無毒無干擾的安全口服要求，可顯著刺激細胞免疫功能增強，達到預防結核病的最終目的，為口服DNA疫苗的臨床應用研究奠定基礎。本發明的優點與效果是
本發明提供一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法，該方法制備的以脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗具備穩定表達目的蛋白的免疫預防效果，并且由于脂質體的運載達到無毒無干擾的安全口服要求，可顯著刺激細胞免疫功能增強，達到預防結核病的最終目的，為口服DNA疫苗的臨床應用研究奠定基礎。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進行詳細說明。實施例
一種結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備方法，包含三個連續的步驟，具體方法如
下
一、重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A的構建 I.引物設計
根據基因文庫中Ag85A基因序列，聚合酶鏈式反應所用引物上游引物5’ - CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC -3’，含 BamHI 酶切位點；下游引物 5’ -GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3’含Xho I酶切位點，并在開放 閱讀框架終止密碼子之后。Ag85A含信號肽序列。確保克隆基因開放讀碼框正確。2.結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基，37°C培養8周，小量抽提DNA為模板。3.聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因
94°C預變性15分鐘，熱啟動后轉入94°C變性I分鐘，60°C退火I. 5分鐘，72°C延伸2分鐘，進行30個循環，72°C延伸10分鐘后終止反應。反應結束后取5微升產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化聚合酶鏈式反應產物。4.純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T載體
按pUCm-T載體PCR擴增試劑盒建立反應體系IOx緩沖液I微升，pUCm_T載體I微升，PCR產物3微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，25 °C連接30分鐘。連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，取100微升轉化后的菌液鋪于10毫升含600微克氨芐青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉湯蛋白胨瓊脂平板，平放30分鐘后，37°C倒置培養14小時。5.藍白斑篩選
待藍色充分顯現，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨芐青霉素的肉湯蛋白胨培養基，于37°C水浴鍋中以200轉/分鐘速度振搖培養過夜，并擴增氨芐青霉素抗性克隆，質粒提取試劑盒小量抽提質粒。6.亞克隆入真核表達載體p⑶NA3. 1+鑒定正確后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌DH5 a，構建重組真核表達質粒pCDNA3. l+/Ag85A。7.從上述受體菌DH 5a中提取純化pUCm_Ag85A，經Xho I及BamH I雙酶切，回收小片段作為目的基因，將其亞克隆入真核表達載體P⑶NA3.1+同樣經Xho I及BamH I雙酶切后所回收的大片段。連接反應體系載體I微升，目的基因4微升，IOx緩沖液I微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，4°C過夜。第二天取連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒行雙酶切及測序鑒定。經PCR及雙酶切證實成功構建了攜帶Ag85A基因的重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A，后者成功轉化感受態大腸桿菌DH5 a。分別以17啟動子引物和BGH通用序列對重組質粒進行正反雙向測序，表明Ag85A DNA已被克隆到真核表達載體p⑶NA3. 1+中CMV啟動子的下游，且插入后閱讀框正確。經測序分析所克隆1141bp Ag85A與基因文庫中結核分枝桿菌Ag85A核苷酸編碼的氨基酸同源性為100%。二.薄膜分散法制備脂質體I.磷酸鹽緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉0. 37克與磷酸二氫鈉2. 0克，加蒸餾水溶解并稀釋至1000毫升，調節該溶液PH值為5. 7。2.稱取注射用豆磷脂0. 9克、膽固醇0. 3克，加入50ml容量的小燒杯中，加入無水乙醇2毫升，置于70°C水浴鍋中，用玻璃棒攪拌使豆磷脂及膽固醇充分溶解，旋轉該小燒杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風，將乙醇揮發除去。3.將步驟二中第I點所述的磷酸鹽緩沖液30毫升加入小燒杯中并將小燒杯置于70°C水浴鍋中預熱，20分鐘后，將預熱的磷酸鹽緩沖液30毫升加入步驟二中第2點所制備的含有磷脂和膽固醇脂質膜的小燒杯中，70°C水浴中攪拌水化10分鐘。隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌30分鐘，如果溶液體積減少，可補加水至30毫升，充分混勻，即可得到脂質體。三.脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗的制備·
將步驟二中第3點所述的溶液I. 5毫升加入5毫升離心管中，同時加入I. 5毫升的步驟一中第8點所述的重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A,將5毫升離心管置于漩渦混合器充分混合震搖5分鐘后放入4 1冰箱靜置2小時，使成均勻的DNA脂質體混懸液，取出5毫升離心管，充氮氣后用膠塞密閉置于4 °C冰箱保存備用，此離心管中的混懸液即為結核分支桿菌Ag85A 口服DNA疫苗。
權利要求
1.一種結核分支桿菌Ag85A ロ服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法包括重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A的構建、薄膜分散法制備脂質體、脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A ロ服DNA疫苗的制備，具體過程為重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A的構建包括引物設計、結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基、聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因、純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T載體、藍白斑篩選、亞克隆入真核表達載體P⑶NA3. 1+鑒定正確后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌菌株DH5 a，構建重組真核表達質粒P⑶NA3. l+/Ag85A，從受體菌DH 5a中提取純化pUCm_Ag85A，堿變性方法提取重組真核表達質粒PCDNA3. l+/Ag85A ;薄膜分散法制備脂質體包括磷酸鹽緩沖液的配制及得到脂質體；脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A ロ服DNA疫苗的制備包括將溶液I.5毫升加入5毫升離心管中，同時加入I. 5毫升的重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A,將5毫升離心管置于漩渦混合器充分混合震搖5分鐘后放入4で冰箱靜置2小時，使成均勻的DNA脂質體混懸液，取出5毫升離心管，充氮氣后用膠塞密閉置于4で冰箱保存備用，此離心管中的混懸液即為結核分支桿菌Ag85A ロ服DNA疫苗。
2.根據權利要求I所述的ー種結核分支桿菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基，為37°C培養8周，小量抽提DNA為模板；聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因；為94°C預變性15分鐘，熱啟動后轉入94°C變性I分鐘，60°C退火I. 5分鐘，72°C延伸2分鐘，進行30個循環，72°C延伸10分鐘后終止反應，反應結束后取5微升產物干1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化聚合酶鏈式反應產物。
3.根據權利要求I所述的ー種結核分支桿菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T載體按pUCm-T載體PCR擴增試劑盒建立反應體系10x緩沖液I微升，pUCm-T載體I微升，聚合酶鏈式反應產物3微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，25で連接30分鐘；連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，取100微升轉化后的菌液鋪于10毫升含600微克氨芐青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉湯蛋白胨瓊脂平板，平放30分鐘后，37°C倒置培養12-16小時；藍白斑篩選待藍色充分顯現，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨芐青霉素的肉湯蛋白胨培養基，于37°C水浴鍋中以200轉/分鐘速度振搖培養過夜，并擴增氨芐青霉素抗性克隆，質粒提取試劑盒小量抽提質粒。
4.根據權利要求I所述的ー種結核分支桿菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述受體菌DH 5 a中提取純化pUCm-Ag85A，經限制性內切酶Xho I及BamH I雙酶切，回收小片段作為目的基因，將其亞克隆入真核表達載體P⑶NA3. 1+同樣經Xho I及BamH I雙酶切后所回收的大片段；連接反應體系載體I微升，目的基因4微升，IOx緩沖液I微升，T4 DNA連接酶I微升，加雙蒸水至10微升，4°C過夜；第二天取連接產物轉化到受體菌DH 5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒行雙酶切及測序鑒定；堿變性方法提取重組真核表達質粒p⑶NA3. l+/Ag85A,將所得質粒保存于pH8. 0 Tris鹽酸緩沖液，使其終濃度為250微克/毫升。
5.根據權利要求I所述的ー種結核分支桿菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述薄膜分散法制備脂質體包括 (I)磷酸鹽緩沖液的配制稱取磷酸氫ニ鈉0. 37克與磷酸ニ氫鈉2. 0克；加蒸餾水溶解并稀釋至1000毫升，調節該溶液PH值為5. 7 ; (2)稱取注射用豆磷脂0.9克、膽固醇0. 3克；加入50ml容量的小燒杯中，加入無水こ醇2毫升，置于65 70°C水浴鍋中，用玻璃棒攪拌使豆磷脂及膽固醇充分溶解，旋轉該小燒杯使磷脂的こ醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風，將こ醇揮發除去； (3) 將步驟ニ中第I點所述的磷酸鹽緩沖液30毫升加入小燒杯中并將小燒杯置于65 70°C水浴鍋中預熱，20分鐘后，將預熱的磷酸鹽緩沖液30毫升加入步驟ニ中第2點所制備的含有磷脂和膽固醇脂質膜的小燒杯中，65 70°C水浴中攪拌水化10分鐘；隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌30分鐘，如果溶液體積減少，可補加水至30毫升，充分混勻，即可得到脂質體。
全文摘要
一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，涉及一種疫苗的制備方法。據結核分枝桿菌Ag85A的基因序列設計一對PCR引物，以人型結核桿菌H37Rv標準毒力株的DNA為模板，經過PCR擴增出Ag85A基因，將回收的PCR產物用限制性核酸內切酶Xhol和BamHI雙酶酶切后，經T4DNA連接酶作用，與真核載體pCDNA3.1+連接，得到的陽性克隆經DNA測序鑒定證實為Ag85A基因，被克隆到載體pCDNA3.1+中的CMV啟動子的下游，構建重組質粒pCDNA3.1+/Ag85A.將轉化大腸桿菌并使之擴增，制得結核桿菌Ag85A口服DNA疫苗，為口服DNA疫苗的臨床應用研究奠定基礎。
文檔編號C12N15/31GK102784389SQ201210246838
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者姜燕 申請人:沈陽大學