S-苯基-l-半胱氨酸酶法轉化制備方法

專利名稱：S-苯基-l-半胱氨酸酶法轉化制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法。背景技術：
S-苯基-L-半胱氨酸是一種非蛋白質組成的氨基酸，其所帶的巰基具有重要的生理功能，S-苯基-L-半胱氨酸是治療艾滋病藥物萘非那韋(抗HIV蛋白酶抑制劑Nelfinavir)的合成原料(US5484926 ;EP0889036)。S-苯基-L-半胱氨酸可用于化妝品添加劑、醫藥領域、食品領域和飼料添加劑領域等，具有非常廣泛的應用。根據目前文獻報導S-苯基-L-半胱氨酸的制備方法主要有化學合成法和酶轉化 法。I、化學合成法
S-苯基-L-半胱氨酸的化學合成法主要利用銅催化L-半胱氨酸和苯胺重氮鹽的反應，最后得到S-苯基-L-半胱氨酸，S-苯基-L-半胱氨酸化學合成的反應步驟多，操作難度大，不適合大規模工業化生產。王建武等(中國藥物化學雜志，2000，(10)4 =283-284)采用銅催化L-半胱氨酸和苯胺重氮鹽反應合成S-苯基-L-半胱氨酸，苯胺溶于濃鹽酸中，滴加亞硝酸鈉得到重氮鹽，加入半胱氨酸鹽酸鹽和氯化亞銅，反應后在通風櫥中加入硫化鈉抽濾，用氨水調pH6，白色晶體析出，過濾，烘干，產率為60%，純度為95%。高玉冠等(CN 200410089193. 9，2005)用亞硝酸鈉與苯胺反應成苯胺重氮鹽，苯胺重氮鹽再與L-半胱氨酸溶液進行反應，加入氯化亞銅，然后用硫化鈉進行脫銅反應，抽濾，調PH6，過濾烘干得到粗品S-苯基-L-半胱氨酸，產率50%。張關永等(CN 03128884. 7，2003)將L-半胱氨酸鹽酸鹽與可溶性一價銅鹽反應生成銅的絡合物，然后與苯胺重氮鹽反應生成S-苯基-L-半胱氨酸，加入可溶性硫化物溶液進行脫銅反應，冷卻，過濾，濾液中加入氨水進行中和，采用乙醇和水混合液對粗品S-苯基-L-半胱氨酸重結晶。2、酶轉化法
酶法轉化因具有專一性強、反應條件溫和、環境友好等優點而日益受到重視，酶促轉化法具有終產物積累量高、反應周期短、分離提純容易等優點，它是廉價生產S-苯基-L-半胱氨酸有效的方法，國內外研究者利用色氨酸合成酶酶法制備S-苯基-L-半胱氨酸，酶法生產S-苯基-L-半胱氨酸已成為近年來人們關注和研究的方向。Thomas HP Maier (Nature Biotechnology, 21(4) :422-427,2003)以苯硫酌■和O-乙酰-L-絲氨酸為底物，pH調至6. 7，CysM酶酶法制備S-苯基-L-半胱氨酸，產率為72%。歐洲專利(EP1247869-A，2002)報道了采用含有O-乙酰-L-絲氨酸、苯硫酚和產CysM菌株DH5 a /pFL145細胞懸液制備S-苯基-L-半胱氨酸，pH調至6. 7，收率為65%。焦慶才等(BioresourceTechnology, 102 :3554-3557, 2011)以混合氛基酸含有的L-絲氨酸和吲哚為底物，以色氨酸合成酶酶法合成了 L-色氨酸。但據文獻報道色氨酸合成酶不僅能夠催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸，還能催化純品L-絲氨酸和苯硫酚反應生成S-苯基-L-半胱氨酸。日本專利(JP10001468A，1996 JP9313195-A，1997 JP9084592-A，1997)和美國專利(US5756319-A，1998)報道了以DL-絲氨酸或L-絲氨酸為底物，以苯硫酚為巰基供體，色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸，以上色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸的報道均以DL-絲氨酸純品或L-絲氨酸純品為底物。目前,我國S-苯基-L-半胱氨酸生產主要來源于化學合成法,該方法工藝成熟,但化學合成法反應步驟多，操作難度大，生產成本高，不適合大規模工業化生產。而另一方面我國在氨基酸工業生產中，會產生大量不能直接用于食品和醫藥方面的富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液，該混合氨基酸料液直接分離制備L-絲氨酸成本高、效率低。
發明內容
本發明需要解決的問題是提供一種高效、低成本的制備S-苯基-L-半胱氨酸的方法。 本發明以氨基酸工業中富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為底物，色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸。本發明可以通過以下技術方案實現
S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法，其步驟為
(I)具有色氨酸合成酶活性的大腸桿菌ATCC15489或銅綠假單胞菌CGMCC NO :1. 1129或施氏假單胞菌CGMCC NO: I. 202或枯草芽孢桿菌CGMCC NO: I. 1628，在培養基中培養，產生含色氨酸合成酶的濕菌體。(2)將含有色氨酸合成酶的濕菌體或粗酶液與含L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入磷酸吡哆醛和表面活性劑和苯硫酚或苯硫酚鈉，在25 55°C，pH 6 11條件下進行酶促反應；反應生成S-苯基-L-半胱氨酸。上述步驟(I)中的培養基碳源采用葡萄糖和麥芽糖和蔗糖和/或果糖，培養基中總碳源質量濃度為5 50 g/L ;氮源采用牛肉膏和酵母膏和玉米漿和蛋白胨和/或豆餅水解液，培養基中總氮源質量濃度為I 30 g/L。上述步驟(2)中含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為角蛋白水解液或蠶絲水解液或酶法合成L-絲氨酸的反應液，混合氨基酸料液中總氨基酸含量為1% 50%重量百分比，其中L-絲氨酸在總氨基酸中含量為5% 95%重量百分比。上述步驟(2)的轉化液中加入適量的表面活性劑吐溫-80或十六烷三甲基溴化銨(CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，其濃度為O. 005 g/L 5. O g/L。本發明與現有技術相比具有如下優點
(O本發明采用含色氨酸合成酶的大腸桿菌ATCC15489或銅綠假單胞菌CGMCC NO
I.1129或施氏假單胞菌CGMCC NO: I. 202或枯草芽孢桿菌CGMCC NO: I. 1628，在優選的培養基中培養可以高效表達色氨酸合成酶，使酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸有較高的催化速率和轉化率，其中L-絲氨酸摩爾轉化率達到84%以上。(2)本發明采用廉價的含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為反應原料，充分利用了工業副產物，解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸高效分離的難題，同時也為大規模低成本生產S-苯基-L-半胱氨酸提供了更為豐富的原料，具有良好的經濟效益和社會效益。(3)酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸具有反應條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，成本低，工藝流程簡單等優點，適合工業化生產。具體實施例方式 以下實施例僅用于對本發明進行具體說明，但本發明的保護范圍并不僅限于以下實施例中。實施例一
I.將1000 mL大腸桿菌(ATCC15489)發酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含17. 5 g L-絲氨酸的毛發酸水解液(氨基酸總含量15%)、19 g苯硫酚、
0.2 g/L磷酸吡哆醛和O. 005 g/L OP, pH 8. 5，37°C酶促反應15 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為29. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為89%。
pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得27. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得26. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例二
I.將1000 mL銅綠假單胞菌(CGMCC NO :1. 1129)發酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含36 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量30%)、42 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. O，25 °C酶促反應20 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為58. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為86 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得55. 3g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得51. 9 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例三
I.將1000 mL施氏假單胞菌(CGMCC NO: I. 202)發酵液離心得到濕菌體18 g，加入到500 mL轉化液中,轉化液中含12 g L-絲氨酸的酶法制備L-絲氨酸料液、14 g苯硫酹、0.2g/L磷酸吡哆醛和O. 005 g/L吐溫-80，pH 6.0, 55°C酶促反應15 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為19. 4 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為86 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得17. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得16. I g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l, I. 5 mol/L硫酸)。實施例四
I.將1000 mL枯草芽孢桿菌(CGMCC NO: I. 1628)發酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中,轉化液中含48 g L-絲氨酸的酶法制備L-絲氨酸料液、56 g苯硫酹、
0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.5 g/L吐溫-80，pH 9. 0，35°C酶促反應20 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為79. 4 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為88 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得75. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得71. 6 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例五
I.將1000 mL施氏假單胞菌(CGMCC NO: I. 202)發酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含60 g L-絲氨酸的毛發酸水解液(氨基酸總含量50%)、70 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L CTAB, pH 9，35°C酶促反應20 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為94. 6 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為84 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得89. 8 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得85. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。 實施例六
I.將1000 mL施氏假單胞菌(CGMCC NO: I. 202)發酵液離心得到18 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含24 g L-絲氨酸的毛發酸水解液(氨基酸總含量20%)、28 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L OP, pH 11，35°C酶促反應16 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為40. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為89 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得38. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得36. 3 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例七
I.將1000 mL大腸桿菌(ATCC15489)發酵液離心得到18 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含18 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量15%)、21 g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.5 g/L OP, pH 9. O，35°C酶促反應15 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為29 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為86 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得27. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得26. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例八
I.將1000 mL銅綠假單胞菌(CGMCC NO :1. 1129)發酵液離心得到的18 g濕菌體，力口入到500 mL轉化液中，轉化液中含12 g L-絲氨酸的毛發酸水解液(氨基酸總含量10%)、16. 8 g苯硫酚鈉、0. 2 g/L磷酸吡哆醛和0. 5 g/L CTAB, pH 9. O, 35°C酶促反應15 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為19. 3 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為86 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得17. 3 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得16. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l, I. 5 mol/L硫酸)。實施例九
I.將1000 mL枯草芽孢桿菌(CGMCC NO: I. 1628)發酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含24 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量20 %)、33. 6g苯硫酚鈉、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. 0，35°C酶促反應18 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為38. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為85 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得36. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得34. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例十
I.將1000 mL大腸桿菌(ATCC15489)發酵液離心得到18 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中，轉化液中含36 g L-絲氨酸的毛發酸水解液(氨基酸總含量30%)、50. 4 g苯硫酚鈉、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. O, 35°C酶促反應20 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為57. I g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為85 %。 2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得54. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得51. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例^^一
I.將100 mL枯草芽孢桿菌(CGMCC NO: I. 1628)發酵液離心得到2 g濕菌體，加入到50 mL轉化液中，轉化液中含I. 2 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量l%)、1.4g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.005 g/L CTAB，pH 9. O，35°C酶促反應5 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為I. 94 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為86 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min,去除菌體細胞,上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得I. 82 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得I. 63 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實施例十二
I.將1000 mL銅綠假單胞菌(CGMCC NO :1. 1129)發酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉化液中,轉化液中含24 g L-絲氨酸的酶法制備L-絲氨酸料液、28 g苯硫酹、0.2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. 0，35°C酶促反應18 h，反應結束后轉化液中S-苯基-L-半胱氨酸為38. 7 g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為86 %。2.將轉化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細胞，上清液用6 mol/L鹽酸調pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得36. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得34. 9 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。
權利要求
1.一種S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法，其特征是由以下步驟構成 (1)具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養基中培養，產生含色氨酸合成酶的濕菌體； (2)將含有色氨酸合成酶的濕菌體或粗酶液與含L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入磷酸吡哆醛和表面活性劑和苯硫酚或苯硫酚鈉，在25 55°C，pH 6 11條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離得到S-苯基-L-半胱氨酸。
2.根據權利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(I)所述的菌株是大腸桿菌ATCC15489或銅綠假單胞菌CGMCC NO :1. 1129或施氏假單胞菌 CGMCC NO: I. 202 或枯草芽孢桿菌 CGMCC NO: I. 1628。
3.根據權利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(1)所述的培養基是葡萄糖和麥芽糖和蔗糖和/或果糖，培養基中總碳源質量濃度為5 50g/L ;氮源采用牛肉膏和酵母膏和玉米漿和蛋白胨和/或豆餅水解液，培養基中總氮源質量濃度為I 30 g/L。
4.根據權利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的含L-絲氨酸的混合氨基酸料液來源于角蛋白水解液或蠶絲水解液或酶法合成L-絲氨酸的反應液，混合氨基酸料液中總氨基酸含量為1% 50%重量百分比，其中L-絲氨酸在總氨基酸中含量為5% 95%重量百分比。
5.根據權利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度為 0. 005 g/L 5. 0 g/L。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法。該制備方法采用含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液為原料，將具有L-色氨酸合成酶活性的濕菌體或粗酶液與含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，添加適量苯硫酚或苯硫酚鈉，25～55℃，pH6～11條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離得到轉化產物S-苯基-L-半胱氨酸。該方法解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸的分離及綜合利用難題，得到了附加值較高的S-苯基-L-半胱氨酸產品，具有原料來源廣、價格低廉，操作簡便，酶促轉化時間短、生產成本低等優點。
文檔編號C12R1/385GK102808007SQ20121025162
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者焦慶才, 徐禮生, 劉均忠, 王治元, 張宏娟, 劉茜 申請人:南京大學