專利名稱：利用苜蓿作為生物反應器生產天蠶素抗菌肽的方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，確切地說，涉及利用苜蓿作為生物反應器生產抗菌肽天蠶素 B (Cecropin B，CB)的方法。
背景技術：
抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)是廣泛存在于生物體內具有抵抗外界微生物侵害，消除體內突變細胞的ー類小分子多肽，由20 60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點，是生物天然免疫防御系統的重要組成部分。天蠶素抗菌肽(cecropins)是第一個被發現目前研究比較清楚的抗菌肽,在動物中廣泛存在，是最具潛カ的抗生素替代品之一。天蠶素(cecropins)對革蘭氏陽性菌、部分·革蘭氏陰性菌具有很強的殺傷力，構成宿主防御細菌、真菌等入侵的重要分子屏障，而對真菌和真核細胞沒有毒性。研究發現，cecropins能夠通過抑制大腸桿菌細胞外膜蛋白相關基因的轉錄，導致細胞的通透性增加，從而抑制細菌生長。cecropins也能通過抑制細胞的呼吸作用殺滅細菌。有些cecropins通過干擾信號傳導通路而間接發生，影響病毒基因轉錄。cecropins可以對煙草花葉病毒(TMV)、皰疹病毒(HSV-I)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)的復制全過程進行干擾。目前，抗菌肽要廣泛使用，目前還需要解決ー些問題。首先是來源問題。由于昆蟲抗菌肽的天然資源有限，化學合成和基因工程便成為獲取抗菌肽的主要手段。化學合成肽類，成本較高。而在微生物中直接表達抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自殺而不能獲得表達產物。所以，非常有必要再尋找一條新的、能夠降低抗菌肽生產成本的途徑。近年來，隨著植物分子生物學的飛速發展以及植物遺傳分析和遺傳工程技術的不斷革新，轉基因植物在基礎研究和生產實踐上都具有其重要意義。利用轉基因植物作為生物反應器的研究和開發也在快速的發展，近年越來越受到人們的關注。轉基因植物生物反應器的研究使植物以極低的費用大量生產外源蛋白，具有極大的商業價值；利用轉基因植物作為生物反應器生產藥用蛋白不僅可以大大降低生產成本，而且簡化了它們的貯存運輸和使用的方式；用植物作為生物反應器，可以使外源基因以農桿菌或植物病毒為載體介導的在其中表達，因為植物體只表達病原菌的部分免疫蛋白，不含致病微生物，對人畜相對較安全，提高了其表達產物的生物安全性。由于紫花苜蓿具有抗逆性強，適應范圍廣，利用年限長，再生性強的特點，毎年可以收獲多次，而且苜蓿本身能固氮，需肥量少，和其他植物相比投入少、生物量大，所以我們能在低成本的情況下大量生產有抑菌活性的蛋白，有利于植物系統表達外源蛋白的產業化發展。目前抗菌肽的實際開發和應用也有了諸多的實例。用途主要集中在養殖、植物抗病和應用劑型等方面。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于表達生產雜合抗菌肽天蠶素B的植物表達載體。ー種植物表達載體，它是在植物表達體pCAMBIA1390中插入了 CaMV35S啟動子，命名為pCAMBIA1390R ;在pCAMBIA1390R中插入其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3、2或I的基因，分別命名為 pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2 和 pCAMBIA1390RCB。—種雜合抗菌妝天香素B的基因，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 3所不；
所述的雜合抗菌肽天蠶素B的基因為人工合成。本發明另ー個目的是，提供ー種轉基因植物的生產方法，pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2或pCAMBIA1390RCB通過農桿菌介導，轉化至苜蓿中，獲得含抗菌肽天蠶素B的轉基因苜蓿。 本發明的又ー個目的是，提供ー種利用苜蓿作為生物反應器生產天蠶素抗菌肽B的方法。利用苜蓿作為生物反應器生產天蠶素抗菌肽B的方法，種植上述方法獲得的含抗菌肽天蠶素B的轉基因苜蓿，提取抗菌肽天蠶素B。本發明提供了抗菌肽天蠶素B (CB)及雜合抗菌肽天蠶素B (CB2、CB3)，在植物表達體 PCAMBIA1390 中插入了 CaMV35S 啟動子，命名為 pCAMBIA1390R ;在 pCAMBIA1390R中分別插入CB、CB2、CB3基因，獲得植物表達載體pCAMBIA1390RCB、pCAMBIA1390RCB2和pCAMBIA1390RCB3O通過農桿菌介導轉化至苜蓿中，獲得了轉基因苜蓿。通過實驗證明，CB、CB2, CB3基因已整合到苜蓿的基因組中，轉基因苜蓿對金黃色葡萄球菌、沙門桿菌有抑制活性，而野生型苜蓿沒有抑制活性，CB3-基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性強、適應范圍廣、利用年限長、再生性強及每年可以收獲多次的特點；而由于轉基因苜蓿轉入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用轉基因苜蓿作為生物反應器生產抗菌肽天蠶素B，可以更大地降低了生產抗菌肽天蠶素B的成本。
圖I為植物表達體pCAMBIA1390R質粒圖譜；
圖2為植物表達體pCAMBIA1390R-CB結構示意圖
圖3為pCAMBIA1390R- CB的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二泳道為質粒酶切后片段；
圖4為植物表達體pCAMBIA1390RCB的PCR鑒定農桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ;第二泳道為陰性對照；3_7泳道PCR鑒定LBA4404的菌落。圖5為Puc-T-CB2的PCR鑒定農桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ;2_3為PCR鑒定LBA4404的菌落
圖6是Puc-T-CB2的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質粒酶切后片段；
圖7為植物表達體pCAMBIA1390R-CB2結構示意圖
圖8是pCAMBIA1390R- CB2的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質粒酶切后片段；
圖9是pCAMBIA1390R-CB2的PCR鑒定農桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ； 1，2為PCR鑒定LBA4404的菌落
圖10為植物表達體pCAMBIA1390R-CB3結構示意圖
圖11是Puc-T-CB3的PCR鑒定農桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ; 1，2為PCR鑒定的菌落
圖12是Puc-T-CB3的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質粒酶切后片段；
圖13是pCAMBIA1390R-CB3的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質粒酶切后片段；
圖14是pCAMBIA1390R-CB3的PCR鑒定農桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ；1，2為PCR鑒定LBA4404的菌落
圖15是潮霉素對苜蓿愈傷組織生長的抗性篩選
圖16為PCAMBIAlSgOR-CB1轉基因植株PCR檢測圖，其中第一泳道為marker DL2000 ；第二泳道為為陰性對照；2-5泳道為轉基因植株
圖17是pCAMBIA1390R-CB2_基因植株的PCR檢測圖，其中第一泳道為marker，2_5泳道為轉化的苜蓿；
圖18為pCAMBIA1390R-CB3_基因植株的PCR檢測圖，其中第一泳道為marker DL2000 ；第二泳道為陽性質粒pCAMBIA1390R-CB3 ;第三泳道為陰性對照；4_7泳道為轉基因植株圖19為pCAMBIAl 3901^ 轉基因植株RT-PCR檢測圖，其中第一泳道為markerDL2000 ;第二泳道為陽性質粒pCAMBIA1390R-CB3 ;第3泳道為陰性對照，4-11泳道為轉基因植株
圖20是轉基因植株的Southern Blot檢測圖，其中第一泳道為沿/ dIIIDNA sizemarker，第二泳道為陽性質粒對照；第三泳道為野生型苜蓿基因組；第五泳道為PCAMBIA1390RCB轉基因植株.六，七泳道為pCAMBIA1390RCB2轉基因植株.ノV，九泳道為pCAMBIA1390RCB3轉基因植株
圖21是瓊脂糖擴散法測抑菌活性檢測圖，其中A為金黃色葡萄球菌；B為沙門桿菌；I為pCAMBIA1390R-CB轉基因植株提取的蛋白；2為pCAMBIA1390R_CB2轉基因植株提取的蛋白；3，4為pCAMBIA1390-CB3.基因植株提取的蛋白，其中，3為人工合成的CB3,4為按照同尾酶的的方法串聯的CB3; — :為陰性對照。圖22為瓊脂糖擴散法測抑菌活性檢測的抑菌活性柱形圖，其中A為金黃色葡萄球菌；B為沙門桿菌；I為PCAMBIA1390R-CB轉基因植株提取的蛋白；2為pCAMBIA1390R-CB2轉基因植株提取的蛋白；3，4為pCAMBIA1390_CB3轉基因植株提取的蛋白，其中，3為人工合成的CB3,4為按照同尾酶的的方法串聯的CB3。
具體實施例方式實施例I植物雙元表達載體PCAMBIA1390R的構建
PCAMBIA1390R質粒為本實驗室構建，是以植物表達載體pCAMBIA1390為基本骨架，用內切與Bgll進行酶切，回收得載體大片段；與體外合成的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子進行連接，獲得了含有CaMV35S啟動子的植物表達載體，命名為pCAMBIA1390R。PCAMBIA1390R質粒圖譜見圖I。
實施例2植物表達載體pCAMBIA1390R-CB構建及轉化
I、根據GenBank上登錄的CecropinB堿基序列，應用Primer Premier 5. 0軟件按照植物偏好密碼子將CB堿基序列重新改造，人工合成單基因CB，其堿基序列如序列表SEQ IDNO. I所示。設計引物
PlCGG GGTACC ATGAACTTCGCGAAGATCCT
P2 AAAACTGCAG TCACTTCCCTATTGCTTTAG以人工合成單基因CB模板，PCR擴增。PCR反應條件94. (TC預變性5min，94. (TC變性35s，65. (TC退火35s，72. (TC延伸35s，30個循環，72. (TC后延伸2min，4°C保存至結束。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶正確且無非特異性條帶后，用PCR清潔回收試劑盒純化回收，回收單基因CB。將回收的單基因CB片段與Pucl9_T在16°C水浴下過夜連接，連接體系如下
表I連接反應體系
權利要求
1.ー種植物表達載體，它是在植物表達體PCAMBIA1390中插入了 CaMV35S啟動子，命名為pCAMBIA1390R ;在pCAMBIA1390R中插入其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3、2或I的基因，分別命名為 pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2 和 pCAMBIA1390RCB。
2.根據權利要求I所述的ー種植物表達載體，其特征在于所述的表達載體為pCAMBIA1390RCB3o
3.—種雜合抗菌妝天香素B的基因,其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 3所不。
4.根椐權利要求3所述的ー種雜合抗菌肽天蠶素B的基因，所述的雜合抗菌肽天蠶素B的基因為人工合成。
5.ー種轉基因植物的生產方法，其特征在于權利要求I所述的植物表達載體通過農桿菌介導，轉化至苜蓿中，獲得含抗菌肽天蠶素B的轉基因苜蓿。
6.根據權利要求5所述的ー種轉基因植物的生產方法,所述的植物表達載體為權利要求2所述的植物表達載體。
7.利用苜蓿作為生物反應器生產天蠶素抗菌肽B的方法，種植按權利要求5方法獲得的含抗菌肽天蠶素B的轉基因苜蓿，提取抗菌肽天蠶素B。
全文摘要
本發明公開了一種抗菌肽天蠶素B(CB)及雜合抗菌肽天蠶素B(CB2、CB3)，在植物表達體pCAMBIA1390中插入了CaMV35S啟動子，獲得pCAMBIA1390R；分別插入CB、CB2、CB3基因，通過農桿菌介導轉化至苜蓿中，獲得了轉基因苜蓿。通過實驗證明，CB、CB2、CB3基因已整合到苜蓿的基因組中，轉基因苜蓿對金黃色葡萄球菌、沙門桿菌有抑制活性，而野生型苜蓿沒有抑制活性，CB3轉基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性強、適應范圍廣、利用年限長、再生性強及每年可以收獲多次的特點；而由于轉基因苜蓿轉入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用轉基因苜蓿作為生物反應器生產抗菌肽天蠶素B，可以更大地降低了生產抗菌肽天蠶素B的成本。
文檔編號C12N15/82GK102776226SQ20121025425
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者萬秋, 劉秀明, 李校堃, 李海燕, 杜淑環 申請人:吉林農業大學, 溫州醫學院