無損檢測細胞miRNA的表達量及確定細胞類型與狀態的方法
【專利摘要】本發明提供一種無損檢測細胞miRNA的表達量及確定細胞類型與狀態的方法，具體為利用細胞培養基中miRNA的表達量來判斷細胞類型與狀態的方法，包括培養不同類型的細胞，收集其培養基，提取培養基中的RNA，反轉錄，利用熒光定量PCR的方法檢測細胞培養基中的miRNA，根據在對照不同細胞類型與狀態下miRNA的表達量與所檢到的miRNA表達量的關系來判斷所檢細胞的類型與狀態。本發明的方法首次證明可通過檢測培養基中miRNA的表達量判斷細胞的類型與狀態，包括干細胞的多能性水平和轉分化獲得的細胞狀態等，從而避免對細胞的破壞，尤其適用于細胞數量有限的實驗與臨床方面的應用。
【專利說明】無損檢測細胞miRNA的表達量及確定細胞類型與狀態的方
法【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】,涉及一種檢測細胞中miRNA(microRNA)的表達量和確定細胞類型與狀態的方法，尤其涉及一種快速、簡便、對細胞無損并且可以在培養過程中持續檢測干細胞多能性水平和其它細胞類型與狀態的方法，具體為利用細胞培養基中微小RNA(microRNA,miRNA)的表達量來判斷細胞類型與狀態的方法，包括培養不同類型的細胞，收集其培養基，提取培養基中的RNA，反轉錄，利用熒光定量PCR的方法檢測細胞培養基中的miRNA，從而根據標志miRNA的表達量判斷干細胞的多能性水平或其他細胞的類型與狀態。
【背景技術】
[0002]miRNA是真核生物基因組中廣泛存在的大小約為21~25個堿基的非編碼微小RNA。它一般由位于基因間區及內含子中的miRNA基因轉錄，形成原始miRNA，在動物細胞核內被加工成70nt左右的miRNA前體(pre-miRNA)，再轉運到胞質加工為成熟miRNA。成熟miRNA進入miRNA誘導的基因沉默復合物(miRNA-1nduced silencingcomplex;miRISC),與目標mRNA配對,通過降解目標mRNA或阻礙蛋白質翻譯來負向調控基因表達(Valencia-Sanchez, Μ.A.，等，Control of translation and mRNA degradationby miRNAs and siRNAs.Genes Dev, 2006.20 (5):p.515-24)。目前的研究已發現人類miRNA有1900多種，這些miRNA參與了人類1/3基因的表達調控，涉及多種關鍵生命過程。
[0003]2008 年，Chen 等(Chen, X.，等，Characterization of microRNAs in serum: anovel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.CellRes, 2008.18(10):p.997-1006)用Solexa測序技術證明了人、大鼠、小鼠、牛、馬等物種的血清中可以檢測到大量的miRNA。之后大量研究結果提示，血清miRNA與腫瘤組織中 miRNA 的表達譜相關(Ng, E.K.，等，Differential expression of microRNAs inplasma of patients with colorectalcancer:a potential marker for colorectalcancer screening.Gut,2009.58(10):p.1375-81 ；Lawrie, C.H.,等,Detection ofelevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol, 2008.141 (5):p.672-5 ；Lawrie, C.H.,等，MicroRNA expression distinguishes between germinal center B cell-likeand activated B cell-like subtypes of diffuse large B cell lymphoma.1nt JCancer, 2007.121 (5):p.1156-61 ；Zhu, ff.,等，Circulating microRNAs in breast cancerand healthy subjects.BMC Res Notes, 2009.2:p.89)。此 Gilad 等(Gilad，S.，等，Serum microRNAs are promising novel biomarkers.PLoS One, 2008.3(9):p.e3148)發現利用實時定量PCR (Quantitative Real-Time RT-PCR，qRT-PCR)技術可以對人體的尿液、唾液、羊水及胸水中的miRNA進行定量。這些發現為研究miRNA開辟了新的途徑，證明了體液中普遍含有miRNA。[0004]目前研究細胞中miRNA的方法一般都是通過收集破壞細胞提取RNA來實現的。但由于胚胎干細胞、誘導多能性干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS細胞)等具有臨床應用價值的細胞一般數量有限，并且需要在臨床應用前對其細胞特性與狀態等特征進行動態檢測，收集破壞細胞的方法不僅造成的大量細胞損耗，而且檢測結果與繼續培養的細胞也具有不一致性，從而成為數量受限的細胞在基礎研究與臨床應用方面的一個重要瓶頸。針對這一問題，本發明首次證明細胞培養基中存在可檢測的miRNA，并且其相對表達豐度與細胞中miRNA的相對表達豐度的變化趨勢存在一致性。在檢測方法方面，本發明利用TRIZOL LS進行小分子RNA提取，并利用糖原使RNA可見，從而最大限度地防止了 RNA丟失。[0005]利用不同手段轉變細胞類型(如將分化的動物成體細胞轉變為誘導多能性干細胞(iPS細胞)和不經過干細胞狀態的成體細胞轉分化)是細胞生物學研究的重要方向，也具有廣闊的臨床應用前景。但由于目前細胞命運轉變方法的誘導周期普遍較長，成功率還很低，如果能夠在誘導過程中動態地檢測細胞的狀態，則可在誘導早期對細胞的特性進行判斷，有利于快速篩選出符合要求的目標細胞，具有重要的基礎研究與臨床應用價值。在本發明中，我們通過持續檢測小鼠胚胎成纖維細胞(MEF細胞)誘導成為誘導多能性干細胞(iPS細胞)過程中細胞培養基中miRNA在每一天的表達變化情況，證明細胞培養基中miRNA的表達情況與細胞的類型與狀態相一致，因此可以通過檢測細胞培養基中miRNA的表達情況來判斷細胞狀態和監測細胞類型的轉變。
【發明內容】
[0006]因而，本發明的目的是針對現有技術的不足，提出了一種檢測細胞培養基中miRNA含量的方法，首次證明細胞培養基中miRNA的相對豐度與所培養細胞中miRNA的相對豐度的變化趨勢存在一致性，因此可以通過檢測細胞培養基中miRNA的表達情況來鑒定細胞的類型與狀態，從而避免對細胞的破壞，尤其適用于細胞數量有限的基礎研究與臨床方面的應用。本發明還提供了不同發育潛能的多能性干細胞(2N-1PS細胞為部分多能性細胞，4N-1PS細胞為完全多能性細胞)以及他們的來源細胞培養基中miRNA的表達檢測結果，證明培養基中特定miRNA的相對表達量可以指示細胞多能性水平的高低。其中2N-1PS細胞IP20D-3和IP36D-3，4NiPS細胞IP14D-1和IP14D-6來源于小鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryo fibroblast, MEF),4N_iPS 細胞 IP16DT-2A 來源于小鼠尾尖成纖維細胞(tail-tipfibroblast, TTF)，4N-1PS細胞IP14DN-5來源于小鼠神經前體細胞(小鼠AM1-3細胞)。
[0007]除非特別指明，本文中的“Ct值”是指“每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數”。
[0008]除非特別指明，本文中的“FBS”是指“胎牛血清(Fetal Bovine Serum)”。
[0009]除非特別指明，本文中的“EGF”是指“上表皮生長因子”。
[0010]除非特別指明，本文中的“bFGF”是指“堿性纖維生長因子”。
[0011]針對上述目的，本發明提供的技術方案如下:
[0012]一方面，本發明提供一種快速、簡便、對細胞無損的檢測細胞中miRNA的表達量的方法，其是通過檢測培養基中的miRNA的表達量而進行的，所述細胞培養基中miRNA表達量的檢測通過包括以下步驟的方法進行:[0013]I)收集過夜培養細胞的培養基，離心，取上清，再將其過濾；
[0014]2)用步驟I)獲得的過濾后的上清液提取RNA ；
[0015]3)將步驟2)提取的RNA進行逆轉錄反應，得到cDNA溶液；
[0016]4)將步驟3)得到的cDNA溶液進行PCR擴增反應，再用熒光定量PCR儀檢測，從而得出其miRNA表達量。
[0017]優選地,在步驟I)中,所述細胞選自人或動物胚胎成纖維細胞、人或動物誘導多能性干細胞(iPS細胞)、人或動物尾尖成纖維細胞、動物胚胎干細胞(ES細胞)、人或動物成體干細胞、轉分化來源的人或動物細胞、人或動物的分化細胞、或腫瘤等疾病細胞或疾病干細胞中的一種或多種。
[0018]優選地，所述動物胚胎成纖維細胞可為小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryofibroblast, MEF)。
[0019]優選地，所述動物誘導多能性干細胞可選自2N_iPS細胞和4N_iPS細胞，更優選地，所述2N-1PS細胞包括細胞系IP20D-3和IP36D-3，所述4N_iPS細胞包括細胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A 和 IP14DN-5。
[0020]優選地，所述動物胚胎干細胞為小鼠胚胎干細胞ESC2和/或CL11。
[0021]優選地，所述人或動物的分化細胞可選自動物尾尖細胞和/或小鼠神經前體細胞。
[0022]優選地，所述動物尾尖成纖維細胞可為小鼠尾尖成纖維細胞(tail-tipfibroblast, TTF)。
[0023]優選地，所述神經前體細胞可為小鼠神經前體細胞(小鼠AM1-3細胞)。
[0024]優選地，所述腫瘤細胞可為人乳腺癌細胞(MCF-7)。
[0025]優選地，當所述細胞為MEF、TTF或MCF-7細胞時，所述培養細胞的培養基配方為450ml DMEM加入50ml FBS,5ml IOOx青鏈霉素的培養基。
[0026]優選地，當所述細胞為AM1-3時，所述培養細胞的培養基為加入EGF和bFGF(濃度均為20ng/ml)的N2B27培養基。
[0027]優選地，當所述細胞為小鼠胚胎干細胞或iPS細胞(誘導多能性干細胞)時，所述培養細胞的培養基為含15%FBS (胎牛血清，Gibco)的DMEM，并添加1000U的LIF (白血病抑制因子，Chemicon)、2mM 的谷氨酸胺(glutamine, Sigma)、ImM 的丙酮酸鈉(sodium pyruvate,Sigma)、以及 0.1mM 的 β -巰基乙醇(β-mercaptoethanol, Sigma)、0.1mM 的非必需氨基酸(non-essential amino acid, Gibco)等。
[0028]優選地，在步驟4)中，所述PCR擴增反應的上游引物為miRNA特異擴增的上游引物，所述下游引物為序列為通用引物(Universal Adaptor PCR Primer),優選地,所述通用引物為商品名A0MD-Q050，GeneCopoeia的通用引物。
[0029]優選地，所述miRNA的特異擴增的上游引物為miRNA-292_3P、miRNA-294_3P、miRNA-323-3P或miRNA-21_5P的特異擴增的上游引物。
[0030]優選地，所述miRNA-292-3P的特異擴增的上游引物為商品名為MmiRQP0944，GeneCopoeia 的引物。
[0031]優選地，所述miRNA-294-3P的特異擴增的上游引物為商品名為MmiRQP0947，GeneCopoeia 的引物。[0032]優選地，所述miRNA-323-3P的特異擴增的上游引物為商品名為MmiRQP0410，GeneCopoeia 的引物。
[0033]優選地，所述miRNA-21-5P的特異擴增的上游引物為商品名為HmiRQP0316，GeneCopoeia 的引物。 [0034]優選地，所述步驟I)通過包括以下步驟的方法進行:收集過夜培養細胞的培養基5-10ml，于2000-3000rpm離心，取上清，再將其用0.45 μ m的過濾器過濾。
[0035]優選地，在步驟I)中，收集過夜培養細胞的培養基5ml，于2000rpm離心。
[0036]優選地，在步驟2)中，用TRIZOL LS試劑提取RNA。
[0037]優選地,在步驟3)中，用All-1n-OneTM miRNA反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。
[0038]另一方面，本發明提供一種快速、動態、對細胞無損傷的確定干細胞的多能性水平的檢測方法，所述方法是通過上述方法檢測干細胞培養基中miRNA的表達量而進行的。
[0039]再一方面，本發明提供一種快速、動態、對細胞無損傷的確定細胞類型與狀態的檢測方法，所述方法是通過上述方法檢測細胞培養基中miRNA的表達量而進行的。
[0040]還一方面，本發明提供一種快速、動態、對細胞無損傷的鑒定用于臨床治療前細胞狀態與性質的檢測方法，所述方法是通過上述方法檢測細胞培養基中miRNA的表達量而進行的。
[0041]因而，從技術層面:本發明提出的檢測細胞培養基中miRNA含量的方法，首次證明細胞培養基中miRNA的相對豐度與所培養細胞中miRNA的相對豐度一致，因此可以通過檢測細胞培養基中miRNA的表達情況來鑒定細胞的類型與狀態，從而避免對細胞的破壞，尤其適用于細胞數量有限的基礎研究與臨床方面的應用。從應用層面:通過檢測細胞培養基中miRNA的表達，可以實現:1)對不同類型干細胞多能性水平的檢測；2)對不同時期iPS誘導細胞多能性水平的檢測；3)對轉分化來源與轉分化過程中細胞類型與狀態的檢測；4)對通過其它方式改變細胞狀態而獲得的細胞或其它來源與類型的細胞狀態的檢測。發明人在小鼠和人的培養細胞獲得一致的結果，說明本檢測方法不具有物種局限性，可被應用于任何物種來源的細胞。總之，本發明提供了有效地提取細胞培養基中的miRNA，并通過對提取的miRNA進行定量PCR檢測來判斷細胞類型與狀態的方法。本發明的方法首次實現在對細胞無創傷的情況下對細胞的類型和狀態進行快速的分子水平判斷，對于動態監測細胞類型改變、早期與快速的目標細胞篩選、臨床應用前細胞狀態監測具有重要應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0043]圖1為實施例1中通過本發明的方法利用PCR檢測CLll細胞培養基中的miRNA-292-3P和miRNA-294_3P的擴增曲線，其中，圖1A為CLl I細胞培養基中的miRNA-292-3P的擴增曲線，圖1B為CLll細胞培養基中的miRNA-294_3P的擴增曲線，圖中dR表示基線校正的熒光值；
[0044]圖2為實施例2中通過本發明的方法PCR檢測iPS細胞誘導過程中細胞培養基中的miRNA-294-3P的表達結果，其中縱坐標表示以第I天的miRNA表達量為基準，在iPS細胞誘導過程中細胞培養基中，每天的miRNA-294-3P的表達量；
[0045]圖3為實施例3中通過本發明的方法PCR擴增檢測iPS細胞誘導過程中細胞中的miRNA-294-3P的表達結果，其中縱坐標表示以第I天的miRNA表達量為基準，在iPS細胞誘導過程中細胞中，每天的miRNA-294-3P的表達量；
[0046]圖4為實施例4中通過本發明的方法PCR擴增檢測不同細胞培養基中的miRNA-323-3P的表達結果，其中縱坐標表示以第一天的MEF細胞培養基中miRNA的表達量為基準，不同細胞培養基中的miRNA-323-3P的表達量；
[0047]圖5為實施例5中通過本發明的方法PCR檢測不同細胞中的miRNA-323_3P的表達結果，其中縱坐標表示以MEF細胞中miRNA的表達量為基準，不同細胞中的miRNA-323_3P的表達量。
[0048]圖6為實施例6中通過本發明的方法PCR檢測人乳腺癌MCF-7細胞培養基中的miRNA-21-5P的擴增曲線，圖中dR表示基線校正的熒光值。
【具體實施方式】
[0049]除非特別指明，以下實施例中的MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2和人乳腺癌細胞系MCF-7均購自中國科學院動物研究所，CLll細胞購自北京生命科學研究所。
[0050]其中MEF、TTF和MCF-7細胞的培養基配方為450ml DMEM加入50ml FBS，5mlIOOx青鏈霉素。AM1-3培養基為N2B27培養基加入EGF和bFGF (濃度均為20ng/ml)，小鼠ES細胞(胚胎干細胞)和iPS細胞(誘導多能性干細胞)培養基為含15%FBS (胎牛血清，Gibco)的DMEM，并添加1000U的LIF (白血病抑制因子，Chemicon),2mM的谷氨酰胺(glutamine, Sigma)、ImM 的丙酮酸鈉(sodium pyruvate, Sigma)、以及 0.1mM 的 β _ 疏基乙酉享(β-mercaptoethanol, Sigma)、0.1mM 的非必需氨基酸(non-essential amino acid,Gibco )等。
·[0051 ] 除非特別指明，以下實施例中所用的突光定量PCR儀型號為Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀，購自吉泰公司。
[0052]除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級的試劑，且可從常規渠道商購獲得。
[0053]實施例1
[0054]a.收集培養基:收集過夜培養的小鼠胚胎干細胞CLll細胞的培養基5ml，2000rpm離心5分鐘，取上清，用0.45 μ m的濾器過濾。
[0055]b.提取RNA:將收集的5ml培養基中加入15ml TRIZOL LS試劑(Invitrogen)，用力振蕩混勻，冰中靜置15分鐘。加入4ml氯仿用力震蕩均勻，靜置15分鐘。12000g離心15分鐘，收集上清。加入等體積的異丙醇沉淀，1μ I糖原，lh(_20°C)，然后12000g離心20分鐘，沉淀總RNA。用75%乙醇洗滌，干燥沉淀10分鐘，用20 μ I無RNA酶的水溶解，測濃度，_80 C備用ο
[0056]c.RNA逆轉錄:用All-1n-0ne?miRNA反轉錄試劑盒(GeneCopoeia)對步驟b獲得的RNA進行逆轉錄反應，具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入18 μ I在步驟b中獲得的RNA，再加入5 μ I逆轉錄反應液，1μ I PolyA聚合酶，1μ I RTase mix,37°C反應I小時，85°C 5分鐘，得到cDNA溶液。
[0057]d.PCR檢測:用SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟c的cDNA溶液進行PCR擴增反應。上游引物為:miRNA-292-3P特異擴增的上游引物為商品名的MmiRQP0944，GeneCopoeia引物，miRNA-294-3P特異擴增的上游引物為商品名的MmiRQP0947，GeneCopoeia引物，小RNA U6特異擴增的上游引物為商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物為Universal Adaptor PCR Primer (商品名:A0MD_Q050, GeneCopoeia)。在突光定量 PCR 反應管中分別加入上下游引物各I μ 1，cDNA溶液9 μ 1，SYBR Green PCR反應緩沖液10 μ I。反應條件:95°C預變性10分鐘，然后95°C 30秒，60°C I分鐘，共40個循環。再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作以檢測試劑盒及熒光定量PCR儀說明書進行，分三次平行擴增胚胎干細胞CLll培養基。[0058]通過檢測不同細胞培養基中的miRNA和小RNA U6 (內參值)的Ct值，就可根據公式Λ Ct=CtmiENA-CtU6來計算該miRNA的Λ Ct值，根據Λ Ct值的大小就可以判斷出該miRNA的相對表達量，Δ Ct值小，其對應的miRNA的表達水平高；而八Ct值大，其對應的miRNA的表達水平低。
[0059]miRNA-292-3P (SEQ ID NO:1:AAAGUGCCGCCAGGUUUUGAGU⑶)的擴增結果如圖1A所示:圖中為胚胎干細胞CLl I培養基三次平行擴增miRNA-292-3P的擴增曲線，從擴增曲線可以得到三次平行擴增miRNA-292-3P的Ct值分別為:21.92，21.81，21.99。miRNA-294_3P的擴增結果如圖1B所示:圖中為胚胎干細胞(^11培養基三次平行擴增1^1?^-294-3?的擴增曲線，從擴增曲線可以得到三次平行擴增miRNA-294-3P的Ct值分別為:21.31，21.49，22.15。以上結果說明:細胞培養基中存在miRNA，并且本檢測方法存在一致性。
[0060]將上述實施例獲得的PCR產物，送往中國科學院北京基因組研究所通過Sanger測序法進行測序，結果證明所得PCR產物為目的miRNA-292-3P。
[0061]實施例2
[0062]a.收集培養基:接種約IxlO4個MEF細胞，利用KOSM體系進行iPS細胞誘導，收集MEF誘導為iPS細胞過程中從第I天到第16天每天的培養基5ml, 2000rpm離心5分鐘,取上清，用0.45 μ m的濾器過濾。
[0063]b.提取RNA:將分離的5ml培養基中加入15ml TRIZOL LS試劑(Invitrogen)，用力振蕩混勻，冰中靜置15分鐘。加入4ml氯仿用力震蕩均勻，靜置15分鐘。12000g離心15分鐘，收集上清。加入等體積的異丙醇和I μ I糖原沉淀Ih (_20°C)，然后12000g離心20分鐘。沉淀總RNA。用75%乙醇洗滌，干燥沉淀10分鐘，用20 μ I無RNA酶的水溶解，測濃度，_80°C備用。
[0064]c.RNA逆轉錄:用All-1n-One?miRNA反轉錄試劑盒(GeneCopoeia)對步驟b獲得的RNA進行逆轉錄反應，具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入18 μ I在步驟b中獲得的RNA，再加入5 μ I逆轉錄反應液，1μ I PolyA聚合酶，1μ I RTase mix,37°C反應I小時，85°C 5分鐘。得到cDNA溶液。
[0065]d.PCR檢測:用SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟c獲得的cDNA溶液進行PCR擴增反應。上游引物為:miRNA-294-3P特異擴增的上游引物為商品名:MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，小RNA U6特異擴增的上游引物為商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物為Universal Adaptor PCR Primer (商品名:A0MD-Q050,GeneCopoeia)。在熒光定量PCR反應管中分別加入上下游引物各I μ 1，cDNA溶液9μ1，SYBR Green PCR反應緩沖液10 μ I。反應條件:95°C預變性10分鐘，然后95°C 30秒，60°CI分鐘，共40個循環。再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作以檢測試劑盒及熒光定量PCR儀說明書進行。
[0066]通過檢測不同誘導天數細胞培養基中的miRNA和小RNA U6的Ct值，就可根據公式Λ Ct=CtmiENA-CtU6來計算該miRNA的Λ Ct值，根據Λ Ct值的大小就可以判斷出該miRNA的相對表達量，Δ Ct值小，其對應的miRNA的表達水平高；而八Ct值大，其對應的miRNA的表達水平低。
[0067]培養基中miRNA-294-3P (SEQ ID NO:2:AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU)的相對表達量如圖2所示:圖中為熒光定量PCR結果經過上述公式計算后得到的各個樣品中miRNA-294-3P的相對表達量，縱坐標為miRNA的相對表達量。可以看到:miRNA-294_3P為ES細胞特異表達的標記物(marker)，因此在iPS細胞誘導過程中，隨著誘導時間的增長，ES克隆逐漸增加，細胞培養基中的miRNA-294-3P的相對表達量也隨著誘導時間的增長而增高。圖中，以誘導第I天細胞培養基中的表達量為1，其他誘導時間的表達量均為與第I天相比而得到的相對表達量。
[0068]將上述實施例獲得的PCR產物，送往中國科學院北京基因組研究所通過Sanger測序法進行測序，結果證明所得PCR產物為目的miRNA-294-3P。
[0069]實施例3
[0070]a.收集細胞:接種約IxlO4個MEF細胞，利用KOSM體系進行iPS細胞誘導，收集MEF誘導為iPS細胞過程中從第I天到第16天每天的細胞，冰PBS洗滌一遍。
[0071]b.提取RNA:將 約IxlO4個細胞加入Iml TRIZOL試劑(Invitrogen)，用力振蕩混勻，冰中靜置15分鐘。加入200 μ I氯仿用力震蕩均勻，靜置15分鐘。12000g離心15分鐘，收集上清。加入等體積的異丙醇沉淀Ih (_20°C)，然后12000g離心，20分鐘。沉淀總RNA。用75%乙醇洗滌，干燥沉淀10分鐘，用40 μ I無RNA酶的水溶解，測濃度，_80°C備用。
[0072]c.RNA逆轉錄:用All-1n-One?miRNA反轉錄試劑盒(GeneCopoeia)對步驟b獲得的RNA進行逆轉錄反應，具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入18 μ I在步驟b中獲得的RNA，再加入5 μ I逆轉錄反應液，1μ I PolyA聚合酶，1μ I RTase mix,37°C反應I小時，85°C 5分鐘。得到cDNA溶液。
[0073]d.PCR檢測:用SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟c的cDNA溶液進行PCR擴增反應。上游引物:miRNA-294-3P的特異擴增的上游引物為商品名MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特異擴增的上游引物為商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物為 Universal Adaptor PCR Primer (商品名:A0MD_Q050,GeneCopoeia)。在突光定量PCR反應管中分別加入上下游引物各I μ 1，cDNA溶液9 μ 1，SYBRGreen PCR反應緩沖液10 μ I。反應條件:95°C預變性10分鐘，然后95°C 30秒，60°C I分鐘，共40個循環。再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作以檢測試劑盒及熒光定量PCR儀說明書進行。
[0074]通過檢測不同細胞中的miRNA和小RNA U6的Ct值，就可根據公式Δ Ct=CtmiENA-CtU6來計算該miRNA的Λ Ct值，根據Λ Ct值的大小就可以判斷出該miRNA的相對表達量，Δ Ct值小，其對應的miRNA的表達水平高；而八Ct值大，其對應的miRNA的表達水平低。
[0075]細胞中miRNA-294_3P的相對表達量如圖3所示:圖中為熒光定量PCR結果經過上述公式計算后得到的各個樣品中miRNA-294-3P的相對表達量，縱坐標為miRNA的相對表達量。可以看到:在iPS細胞誘導過程中，細胞中的miRNA-294-3P的相對表達量隨著誘導時間的增長而增高。結果表示以誘導第I天細胞的表達量為1，其他誘導時間的表達量均為與第I天相比而得到的相對表達量。
[0076]miRNA-294-3P(SEQ ID NO:2:AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU)為 ES 細胞特異表達的標記物(marker)，因此在iPS細胞誘導過程中，隨著誘導時間的增長，ES細胞克隆逐漸增加，細胞中的miRNA-294-3P的相對表達量隨著誘導時間的增長而增高。與圖2相比表明，細胞培養基miRNA-294-3P的表達與所培養細胞狀態的改變趨勢相一致。 [0077]將上述實施例獲得的PCR產物，送往中國科學院北京基因組研究所通過Sanger測序法進行測序，結果證明所得PCR產物為目的miRNA-294-3P。
[0078]實施例4
[0079]a.收集培養基:收集過夜培養 MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2、CL11 細胞的培養基各 5ml，2000rpm 離心 5 分鐘，取上清，用0.45 μ m的濾器過濾。
[0080]b.提取RNA:將收集的5ml不同細胞培養基中分別加入15mlTRIZ0L LS試劑(Invitrogen),用力振蕩混勻,冰中靜置15分鐘。加入4ml氯仿用力震蕩均勻,靜置15分鐘。12000g離心15分鐘，收集上清。加入等體積的異丙醇和I μ I糖原沉淀Ih (_20°C)，然后12000g離心20分鐘。沉淀總RNA。用75%乙醇洗滌，干燥沉淀10分鐘，用20 μ I無RNA酶的水溶解，測濃度，_80°C備用。
[0081]c.RNA逆轉錄:用All-1n-One?miRNA反轉錄試劑盒(GeneCopoeia)對步驟b獲得的RNA進行逆轉錄反應，具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入18 μ I在步驟b中獲得的RNA，再加入5 μ I逆轉錄反應液，1μ I PolyA聚合酶，1μ I RTase mix,37°C反應I小時，85°C 5分鐘。得到cDNA溶液。
[0082]d.PCR檢測:用SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟c的cDNA溶液進行PCR擴增反應。上游引物:所述miRNA-323-3P的特異擴增的上游引物為商品名MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特異擴增的上游引物為商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia 引物，下游通用引物為 Universal Adaptor PCR Primer (商品名:A0MD_Q050，GeneCopoeia)。在熒光定量PCR反應管中分別加入上下游引物各I μ 1，cDNA溶液9μ1，SYBR Green PCR反應緩沖液10 μ I。反應條件:95°C預變性10分鐘，然后95°C 30秒，60°CI分鐘，共40個循環。再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作以檢測試劑盒及熒光定量PCR儀說明書進行。
[0083]通過檢測不同細胞培養基中的miRNA和小RNA U6的Λ Ct值，就可根據公式Δ Ct=CtmiENA-CtU6來計算該miRNA的Λ Ct值，根據Λ Ct值的大小就可以判斷出該miRNA的相對表達量，Δ Ct值小，其對應的miRNA的表達水平高；而八Ct值大，其對應的miRNA的表達水平低。
[0084]miRNA-323-3P(SEQ ID NO:3:CACAUUACACGGUCGACCUCU)的相對表達量如圖4所示:圖中為熒光定量PCR結果經過上述公式計算后得到的各個細胞的培養基中miRNA-323-3P的相對表達量，縱坐標為miRNA的相對表達量。可以看到:miRNA-323-3P是干細胞多能性標志的標記物(marker)，在多能性水平高的細胞中高表達，因此miR-323_3P在成纖維細胞(MEF、TTF)和 4N-1PS 細胞(IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5)及 ES 細胞(ESC2、CLI I)的培養基高表達，而在2N-1PS細胞(IP20D-3、IP36D-3)及神經前體細胞(AM1-3)的培養基表達很低或不表達。圖中，以MEF細胞培養基中的表達量為1，其他細胞的表達量均為與MEF細胞相比而得到的相對表達量。
[0085]將上述實施例獲得的PCR產物，送往中國科學院北京基因組研究所所通過Sanger測序法進行測序，結果證明所得PCR產物為目的miRNA-323-3P。
[0086]實施例5
[0087]a.收集細胞:收集 MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2 和 CLll 細胞各約 IxlO6 個，冰 PBS 洗滌一遍。
[0088]b.提取RNA:將不同細胞中分別加入Iml TRIZOL試劑(Invitrogen)，用力振蕩混勻，冰中靜置15分鐘。加入200 μ I氯仿用力震蕩均勻，靜置15分鐘。12000g離心15分鐘，收集上清。加入等體積的異丙醇沉淀Ih (_20°C)，然后12000g離心20分鐘。沉淀總RNA。用75%乙醇洗滌，干燥沉淀10分鐘，用40 μ I無RNA酶的水溶解，測濃度，_80°C備用。
[0089]c.RNA逆轉錄:用All-1n-One?miRNA反轉錄試劑盒(GeneCopoeia)對步驟b獲得的RNA進行逆轉錄反應，具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入18 μ I在步驟b中獲得的RNA，再加入 5 μ I逆轉錄反應液，1μ I PolyA聚合酶，1μ I RTase mix,37°C反應I小時，85°C 5分鐘。得到cDNA溶液。
[0090]d.PCR檢測:用SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟c的cDNA溶液進行PCR擴增反應。擴增的上游引物為miRNA-323-3P和U6特異擴增的上游引物，miRNA-323_3P的上游引物為商品名MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特異擴增的上游引物為商品名 MmiRQP9002,GeneCopoeia 的引物，下游通用引物為 Universal Adaptor PCR Primer(商品名:A0MD-Q050，GeneCopoeia)。在熒光定量PCR反應管中分別加入上下游引物各I μ 1，cDNA溶液9 μ 1，SYBR Green PCR反應緩沖液10 μ I。反應條件:95°C預變性10分鐘，然后950C 30秒，60°C I分鐘，共40個循環。再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作以檢測試劑盒及熒光定量PCR儀說明書進行。
[0091]通過檢測不同細胞中的miRNA和小RNA U6的Ct值，就可根據公式Δ Ct=CtmiENA-CtU6來計算該miRNA的Λ Ct值，根據Λ Ct值的大小就可以判斷出該miRNA的相對表達量，Δ Ct值小，其對應的miRNA的表達水平高；而八Ct值大，其對應的miRNA的表達水平低。
[0092]在各個細胞中miRNA-323-3P (SEQ ID NO:3:CACAUUACACGGUCGACCUCU)的相對表達量如圖5所示:圖中為熒光定量PCR結果經過上述公式計算后得到的各個細胞中miRNA-323-3P的相對表達量，縱坐標為miRNA的相對表達量。可以看到:miRNA-323_3P在成纖維細胞(MEF、TTF)和 4N-1PS 細胞(IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5)及 ES 細胞(ESC2、CL11)高表達，而在2N-1PS細胞(IP20D-3、IP36D-3)及神經前體細胞(AM1-3)表達很低或不表達。與相應細胞培養基中的表達趨勢一致，圖中以MEF細胞中的表達量為1，其他細胞的表達量均為與MEF細胞相比而得到的相對表達量。
[0093]將上述實施例獲得的PCR產物，送往中國科學院北京基因組研究所通過Sanger測序法進行測序，結果證明所得PCR產物為目的miRNA-323-3P。
[0094]實施例6
[0095]a.收集培養基:收集過夜培養人乳腺癌細胞系MCF-7培養基5ml，2000rpm離心5分鐘，取上清，用0.45 μ m的濾器過濾。
[0096]b.提取RNA:將收集的5ml培養基中加入15ml TRIZOL LS試劑(Invitrogen)，用力振蕩混勻，冰中靜置15分鐘。加入4ml氯仿用力震蕩均勻，靜置15分鐘。12000g離心15分鐘，收集上清。加入等體積的異丙醇和I μ I糖原沉淀Ih (_20°C)，然后12000g離心20分鐘。沉淀總RNA。用75%乙醇洗滌，干燥沉淀10分鐘，用20 μ I無RNA酶的水溶解，測濃度，_80°C備用。 [0097]c.RNA逆轉錄:用All-1n-One?miRNA反轉錄試劑盒(GeneCopoeia)對步驟b獲得的RNA進行逆轉錄反應，具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入18 μ I在步驟b中獲得的RNA，再加入5 μ I逆轉錄反應液，1μ I PolyA聚合酶，1μ I RTase mix,37°C反應I小時，85°C 5分鐘。得到cDNA溶液。
[0098]d.PCR檢測:用SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟c的cDNA溶液進行PCR擴增反應。上游引物:所述miRNA-21-5P的特異擴增的上游引物為商品名為HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物，小RNA U6的特異擴增的上游引物為商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物為Universal Adaptor PCR Primer (商品名:A0MD-Q050,GeneCopoeia)。在熒光定量PCR反應管中分別加入上下游引物各I μ 1，cDNA溶液9μ1，SYBR Green PCR反應緩沖液10 μ I。反應條件:95°C預變性10分鐘，然后95°C 30秒，60°C
I分鐘，共40個循環。再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作以檢測試劑盒及熒光定量PCR儀說明書進行，分三次平行擴增人乳腺癌細胞MCF-7細胞培養基。
[0099]通過檢測細胞培養基中的miRNA和小RNA U6的Λ Ct值，就可根據公式Δ Ct=CtmiENA-CtU6來計算該miRNA的Λ Ct值，根據Λ Ct值的大小就可以判斷出該miRNA的相對表達量，Δ Ct值小，其對應的miRNA的表達水平高；而八Ct值大，其對應的miRNA的表達水平低。
[0100]miRNA-21-5P (SEQ ID N0:4:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)的擴增結果如圖 6 所示:圖中為人乳腺癌細胞MCF-7培養基三次平行擴增miRNA-21-5P的擴增曲線，從擴增曲線可以得到三次平行擴增的Ct值分別為:27.01,26.98，27.35。以上結果說明:人乳腺癌細胞MCF-7細胞培養基中存在miRNA，并且本檢測方法存在一致性。
[0101]將上述實施例獲得的PCR產物，送往中國科學院北京基因組研究所通過Sanger測序法進行測序，結果證明所得PCR產物為目的miRNA-21-5P。
[0102]本發明涉及由本方法檢測到ES細胞特異高表達的標記物(marker) —miRNA-292-3P 和 miRNA-294_3P 以及 Dlkl_Dio3 印跡區的微小 RNA — miRNA-323_3P，其中Dlkl-Dio3印跡區中的微小RNA在2N_iPS細胞中表達低而在4N_iPS細胞中表達高。在我們的結果中可以看到:1.在MEF誘導為iPS細胞的過程中，MEF為成纖維細胞，不表達ES細胞特異表達的miRNA-294-3P，而隨著誘導時間的增加，ES細胞越來越多，miRNA-294_3P表達逐漸上升，第一時間觀察到了細胞命運的轉換。2.miRNA-323-3P在成纖維細胞(MEF、TTF)，4N-1PS 細胞(IP14D-l、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5)及 ES 細胞(ESC2、CL11)中高表達，而在2N-1PS細胞(IP20D-3、IP36D-3)及神經前體細胞(AM1-3)中表達很低或不表達。可以通過檢測培養基中miRNA的表達鑒定細胞的多能性水平。3.在人的細胞培養基中也可以檢測到miRNA，說明本方法適用于多種屬，為以后本方法應用于利用ES與iPS細胞進行臨床治療前細胞性質檢測、轉分化來源的細胞性質檢測、臨床對IVF胚胎植入前發育潛能的檢測以及其它需要無損傷確定細胞狀態的應用提供了很好的基礎。通過本發明的方法首次檢測到細胞培養基中的miRNA且證明培養基中的miRNA的表達趨勢與所培養細胞中miRNA的表達趨勢一致。首次證明可以通過檢測培養基中miRNA的表達鑒定細胞的類型與狀態，從而避免對細胞的破壞，尤其適用于細胞數量有限的基礎研究與臨床方面的應用。總之，本發明首次采用無損傷性的方法檢測細胞在不同類型和狀態下miRNA的表達水平，可為動態的無創性鑒定細胞類型和特性與觀察`細胞命運的轉換提供了新的思路。
【權利要求】
1.一種快速、簡便、對細胞無損地檢測細胞中HiiRNA的表達量和確定細胞類型與狀態的方法，其是通過檢測細胞培養基中的miRNA的表達量而實現的，所述培養基中miRNA表達量的檢測通過包括以下步驟的方法進行: O收集過夜培養細胞的培養基，離心，取上清，再將其過濾； 2)用步驟I)獲得的過濾后的上清液提取RNA； 3)將步驟2)提取的RNA進行逆轉錄反應，得到cDNA溶液； 4)將步驟3)得到的cDNA溶液進行PCR擴增反應，再用熒光定量PCR儀檢測，從而得到其中miRNA的表達量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟I)中，所述細胞選自人或動物胚胎成纖維細胞、人或動物誘導多能性干細胞、動物胚胎干細胞、人或動物成體干細胞、轉分化來源的人或動物細胞、人或動物的分化細胞或腫瘤疾病細胞或疾病干細胞中的一種或多種； 優選地，所述動物誘導多能性干細胞選自2N-1PS細胞和4N-1PS細胞，更優選地，所述2N-1PS細胞包括細胞系IP20D-3和IP36D-3，所述4N_iPS細胞包括細胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A 和 IP14DN-5 ； 優選地，所述動物胚胎干細胞為ESC2和/或CLll ; 優選地，所述動物胚胎成纖維細胞為小鼠胚胎成纖維細胞； 優選地，人或動物的分化細胞選自動物尾尖細胞和/或小鼠神經前體細胞，更優選地，所述動物尾尖細胞為小鼠尾尖細胞；所述神經前體細胞為小鼠神經前體細胞； 優選地，所述腫瘤細胞為人乳腺癌細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟I)中，當所述細胞為小鼠胚胎成纖維細胞、小鼠尾尖細胞或人乳腺癌細胞時，所述培養細胞的培養基為450ml DMEM加入50mlFBS, 5ml IOOx青鏈霉素的培養基；或 當所述細胞為小鼠神經前體細胞時，所述培養細胞的培養基為添加有EGF和bFGF的N2B27培養基，優選地，所述EGF和bFGF的濃度均為20ng/ml ;或 當所述細胞為小鼠胚胎干細胞或小鼠iPS誘導多能性干細胞時，所述培養細胞的培養基為含15%FBS的DMEM培養基，優選地，所述DMEM培養基中還添加有1000U的白血病抑制因子、2mM的谷氨酰胺、ImM的丙酮酸鈉、0.1mM的β -巰基乙醇和0.1mM的非必需氨基酸。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟4)中，所述PCR擴增反應的上游引物為miRNA特異擴增的上游引物，所述下游引物為通用引物，優選地，所述通用引物為商品名A0MD-Q05·0，GeneCopoeia的通用引物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述miRNA的特異擴增的上游引物為miRNA-292-3P、miRNA-294_3P、miRNA-323_3P 或 miRNA-21_5P 的特異擴增的上游引物；優選地，所述miRNA-292-3P的特異擴增的上游引物為商品名為MmiRQP0944，GeneCopoeia的引物，優選地，所述miRNA-294-3P的特異擴增的上游引物為商品名為MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，優選地，所述miRNA-323_3P的特異擴增的上游引物為商品名為MmiRQP0410, GeneCopoeia的引物，優選地，所述miRNA-21_5P的特異擴增的上游引物為HmiRQP0316, GeneCopoeia 的引物。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟I)通過包括以下步驟的方法進行:收集過夜培養細胞的培養基5-10ml，于2000-3000rpm離心，取上清，再將其用0.45 μ m的過濾器過濾。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟I)中，收集過夜培養細胞的培養基5ml,于 2000rpm 離心。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，用TRIZOLLS試劑提取RNA。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，用AlΙ-1n-OneTMmiRNA反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。
10.一種確定細胞類型與狀態和干細胞的多能性水平的方法，所述方法是通過權利要求I至9中任一項所述的方法檢測細胞中miRNA的表達量而進行的。
11.一種鑒定用于臨床治療前細胞類型與狀態的方法，所述方法是通過權利要求1至9中任一項所述的方法檢測 細胞中miRNA的表達量而進行的。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571929SQ201210258472
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月24日 優先權日:2012年7月24日
【發明者】周琪, 王秀杰, 張映 申請人:中國科學院動物研究所, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所