專利名稱：一種特異性γ-谷氨酰基轉移酶檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種特異性Y-谷氨酰基轉移酶特異性檢測方法及其應用。
背景技術：
血清中的Y-谷氨酰基轉移酶(GGT，EC2. 3. 2. 2)是以同工酶或多種分子形式存在的，有些GGT能與脂蛋白結合在一起，如與低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)結合，但其形成原因及生理功能尚不清楚。現有技術中，關于血清GGT總活性測定是臨床常規開展的酶學檢測項目，其在急性病毒性肝炎、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、肝內膽汁淤積、肝外膽道阻塞、原發性或轉移性肝癌時，均有不同程度增高；但血清中GGT總活性測定特異性低，無法作為與之相關疾病的特異性檢查，尤其是對于肝癌與其他肝病的鑒別診斷尚缺乏特異性的檢測方法及其配套產品
發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種特異性Y -谷氨酰基轉移酶檢測方法及其應用，是特異性針對與血清中低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白結合的Y -谷氨酰基轉移酶活性，以實現用簡便、快捷的方法來檢測樣品中肝癌及其其他嚴重肝病的鑒別診斷。為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法，具體為通過檢測以抗載脂蛋白B抗體(Apo B抗體)與低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)間形成的免疫沉淀結合物前后的血清中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性差值。作為一種優選方案，所述的抗載脂蛋白B抗體與低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)間形成的免疫沉淀結合物后的血清中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性為形成免疫結合物后經離心的上清液中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性。作為進一步優選方案，所述的檢測Y-谷氨酰基轉移酶的活性的方法為以L-Y-谷氨酰-3-羧基-對硝基苯胺(3-carboxy-GGPNA)為底物且能在全自動生化分析儀上應用的連續監測法。作為更進一步優選方案，上述檢測方法包括如下步驟4)測定樣品血清中的總Y -谷氨酰基轉移酶的活性；5)加入抗載脂蛋白B抗體液及沉淀劑，5 30分鐘后，離心，取上清液，測定上清液中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性；6)計算步驟I)與步驟2)中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性差值。一種特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法的應用，是指以上述方法制備用于診斷或輔助診斷肝癌的診斷試劑或診斷試劑盒。作為一種優選方案，上述的診斷試劑或診斷試劑盒，包括抗載脂蛋白B抗體液、緩沖液、沉淀劑。
作為進一步優選方案，所述的緩沖劑為pH7. 0,30mmol/L MOPS緩沖液。作為進一步優選方案，所述的沉淀劑為30%聚乙二醇6000。與現有技術相比，本發明提供了一種簡單有效的診斷或輔助診斷肝癌的診斷試劑或診斷試劑盒，實驗結果表明，本發明提供的特異性檢測血清LDL/VLDL-GGT活性方法可用于檢測或輔助檢測肝癌的診斷試劑或診斷試劑盒，平均診斷特異性可達70%以上，平均陽性預測值為90%。因此，其應用前景十分廣闊。
圖I為本發明提供的特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測試劑盒的結構示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例及對比例對本發明作進一步詳細、完整地說明。 實施例I、制備特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測試劑盒(10人份)，具體如圖I所示，其中包括三管試劑，分別為抗體液⑴抗人Apo B抗體+緩沖液；緩沖液(2)pH7.0,30mmol/L MOPS ；沉淀劑(3):30%聚乙二醇 6000。A.試劑組成I)對照組(總活性組)pH7. 0，3OmmoVL MOPS 緩沖液 850 U L。2)抗體組(待測定組)含抗載脂蛋白B抗體850 U L、30%聚乙二醇6000沉淀劑420 u L。B.操作步驟(I)抗體組在離心試管內加入患者血清標本IOOii L，抗體液80 ii L，沉淀劑20 u L，37°C放置20min，離心(5500gX 5min)，取上清液在生化分析儀上測定GGT活性。(2)對照組在離心試管內加入患者血清標本100 iiL，緩沖液80ii L，沉淀劑20 u L，37°C放置20min，離心(5500gX 5min)，取上清液在生化分析儀上測定GGT活性。(3)結果計算LDL/VLDL-GGT活性(U/L)=(對照組管-抗體組管)X 2。注GGT活性測定可采用各實驗室在生化分析儀上應用的方法，試劑自備。具體檢測方法如下a)檢測原理本法以溶解度較大的L- Y -谷氨酰-3-羧基_對硝基苯胺為底物，雙甘肽為Y-谷氨酰基的受體。在GGT的催化下，谷氨酰基轉移到雙甘肽分子上，同時釋放出黃色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，引起405nm 4IOnm波長處吸光度的增高。吸光度增高速率與GGT活性呈正比關系。b)檢測試劑試劑成份和在反應液中的終末濃度如下pH7. 7，37°C，150mmol/L甘氨酰甘氨酸緩沖液，6mmol/L的L-Y-谷氨酰-3-羧基-對硝基苯胺，樣品體積分數I : 11。c)檢測儀器參數溫度37°C，波長410nm，帶寬彡2nm,比色杯光徑I. 0cm，孵育時間180s，延遲時間60s，監測時間180s，讀數點彡6，因數1159。d)計算方法GGT(U/L) = A A/minX (106X2. 75)/(9490 X0. 25) = AA/minX 1159 (2-硝基-5-氨基苯甲酸在405nm處的摩爾吸光度為9490)2、檢測性能驗證DApoB抗體沉淀效果取16份血清樣品，I 8號樣品的LDL-C濃度范圍在I. 5 10. 3mmol/L，9 16號樣品的GGT活性范圍在30 1950U/L，分別用抗體液沉淀后，上清液進行脂蛋白電泳。電泳結果表明，所有樣品只有高密度脂蛋白(HDL)I條帶，而無LDL和VLDL區帶，說明該ApoB抗體能很好地沉淀血清樣品中LDL和VLDL。2)沉淀時間影響取低、中、高LDL/VLDL-GGT活性樣品3份，加入抗體液和沉淀劑后分別在37°C放置5、10、15、20、25、30min，結果表明，在5 30min內，沉淀效果基本一致。本實驗盒選擇20min為沉淀時間。 3)精密度實驗取不同GGT活性的3份新鮮混合血清，GGT活性分別為52、264、875U/L，每份樣品重復測定LDL/VLDL-GGT活性15次，計算批內精密度。3份血清LDL/VLDL-GGT活性的均值分別為 8. 4、29、123U/L，s 為 0. 69、I. 78,4. 38，批內 CV 為 8. 21,6. 14,3. 56%。每份樣品每間隔Ih測定，每批重復3次取平均值，共測定5批，計算批間精密度。3份血清LDL/VLDL-GGT活性的均值分別為 8. 6、31、128U/L，s 為 0. 84,2. 24,6. 98，批間 CV 為 9. 77,7. 23,5. 45%。4)線性實驗取一極高GGT活性的肝癌病人血清，經檢測LDL/VLDL-GGT活性為587U/L，取一正常人血清經檢測LDL/VLDL-GGT活性為0U/L，將二者按不同比例混合(I 9 9 1)，分別測定各混合樣品的LDL-VLDL-GGT活性。結果表明，LDL-VLDL-GGT活性在0 587U/L范圍內線性良好。5)參考范圍，由上述線性實驗結果中可知，血清中LDL/VLDL-GGT正常參考值為(10U/L。6)試劑盒臨床應用結果a)標本來源患者血清150份，其中肝癌65份，肝硬化53份，慢性肝炎32份。所有臨床病人均經病理檢查、B超及臨床確診。體檢健康者血清標本75份，其中男39名，女36名，年齡范圍20 54歲，無溶血，脂血。以上血清收集后，置_30°C冰箱保存。b)各肝臟疾病組血清LDL/VLDL-GGT活性檢測結果對150份肝臟疾病病人血清LDL/VLDL-GGT進行檢測，具體結果見表I。表I各肝臟疾病組血清LDL/VLDL-GGT活性結果
權利要求
1.一種特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法，其特征在于通過檢測以抗載脂蛋白B抗體與低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)間形成的免疫沉淀結合物前后的血清中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性差值。
2.根據權利要求I所述的特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法，其特征在于所述的抗載脂蛋白B抗體與低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)間形成的免疫沉淀結合物后的血清中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性為形成免疫結合物后經離心的上清液中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性。
3.根據權利要求I所述的特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法，其特征在于所述的檢測Y-谷氨酰基轉移酶的活性的方法是以L-Y-谷氨酰-3-羧基-對硝基苯胺(3-carboxy-GGPNA)為底物且能在全自動生化分析儀上應用的連續監測法。
4.根據權利要求I所述的特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法，其特征在于所述特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法包括如下步驟 1)測定樣品血清中的總Y-谷氨酰基轉移酶的活性； 2)加入抗載脂蛋白B抗體液及沉淀劑，5 30分鐘后，離心，取上清液，測定上清液中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性； 3)計算步驟I)與步驟2)中的Y-谷氨酰基轉移酶的活性差值。
5.一種權利要求I所述特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法的應用，其特征在于是指以上述方法制備用于診斷或輔助診斷肝癌的診斷試劑或診斷試劑盒。
6.根據權利要求5所述特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法的應用，其特征在于上述的診斷試劑或診斷試劑盒，包括抗載脂蛋白B抗體液、緩沖液、沉淀劑。
7.根據權利要求6所述特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法的應用，其特征在于所述的緩沖劑為PH7. 0,30mmol/L MOPS緩沖液。
8.根據權利要求6所述特異性Y-谷氨酰基轉移酶檢測方法的應用，其特征在于所述的沉淀劑為30%聚乙二醇6000。
全文摘要
本發明提供了一種特異性γ-谷氨酰基轉移酶檢測方法，具體為通過檢測以抗載脂蛋白B抗體與低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)間形成的免疫沉淀結合物前后的血清中的γ-谷氨酰基轉移酶的活性差值；以及應用上述方法制備的診斷試劑或診斷試劑盒。與現有技術相比，本發明提供了一種簡單有效的診斷或輔助診斷肝癌的診斷試劑或診斷試劑盒，實驗結果表明，本發明提供的特異性檢測血清LDL/VLDL-GGT活性方法可用于檢測或輔助檢測肝癌的診斷試劑或診斷試劑盒，平均診斷特異性可達70％以上，平均陽性預測值為90％。因此，其應用前景十分廣闊。
文檔編號C12Q1/48GK102796804SQ20121026140
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者于嘉屏 申請人:上海迪安醫學檢驗所有限公司