專利名稱：一種制備漿細胞的方法及其得到的漿細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種制備漿細胞的方法及其得到的漿細胞。
背景技術：
成熟B細胞接受抗原刺激后，在抗原遞呈細胞和輔助性T細胞的輔助下成為活化的B細胞,進而分化為衆細胞,合成并分泌各類免疫球蛋 白。漿細胞及其分泌的抗體在保護性免疫、腫瘤和自身免疫性疾病的發生發展中發揮重要的作用。目前，多從小鼠脾臟分離B細胞并用LPS體外刺激獲得漿細胞，具有如下局限性所需時間長，誘導過程中細胞死亡較多，生成的漿細胞分泌抗體能力一般。雖然可通過干擾抑制漿細胞分化的轉錄因子的表達來促進漿細胞分化，但并不能同時提高漿細胞的抗體分泌能力。
發明內容
本發明的目的是提供一種制備漿細胞的方法及其得到的漿細胞。本發明提供了一種用B細胞制備漿細胞的方法，依次包括如下步驟(I)干擾離體的B細胞中MYSMl基因的表達；所述MYSMl基因為編碼序列表的序列I所不蛋白質的基因；(2)采用脂多糖(Lipopolysaccharide)誘導細胞分化為衆細胞。所述MYSMl基因具體可為序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列3所示的DNA分子。所述步驟(I)中，所述“干擾B細胞中MYSMl基因的表達”的實現方式如下在所述離體的B細胞中導入抑制所述MYSMl基因表達的物質。所述“抑制所述MYSMl基因表達的物質”具體可為表達針對所述MYSMl基因的shRNA的重組慢病毒。所述“在所述離體的B細胞中導入抑制所述MYSMl基因表達的物質”的實現方式具體如下將所述重組慢病毒與所述離體的B細胞共培養。所述重組慢病毒的制備方法可包括如下步驟將重組質粒甲、質粒pMDLg/pRRE、質粒pRSV-Rev和質粒pMD2. G共轉染哺乳動物細胞，培養細胞后得到重組慢病毒；所述重組質粒甲為含有DNA片段甲的質粒；所述DNA片段甲編碼的RNA為具有沉默所述MYSMl基因的功能的shRNA。所述DNA片段甲具體可如序列表的序列4所示。所述重組質粒甲具體可為質粒pLKO. 1-shmMysmlo所述哺乳動物細胞具體可為293T/17細胞。所述重組慢病毒具體可為LV-shmMysml病毒。所述LV-shmMysml病毒的制備方法具體如下培養293T/17細胞，待細胞達到85%融合時轉染混合物甲，培養60-72小時后收取上清，即為LV-shmMysml病毒液。所述混合物甲的制備方法具體如下將質粒pLKO. 1-shmMysml、質粒pMDLg/pRRE、質粒pRSV-Rev、質粒pMD2. G混合。所述混合物甲的制備方法具體如下將質粒pLKO. 1-shmMysml、質粒pMDLg/pRRE、質粒pRSV-Rev、質粒pMD2. G與轉染試劑PEI混合。所述質粒pLKO. 1-shmMysml 即為 Sigma 公司 Cat. No. TRCN0000085873 的質粒產
品O所述混合物甲的制備方法具體如下將質粒pLKO. 1-shmMysml 10ug、質粒pMDLg/pRRE 5ug、質粒 pRSV-Rev 2. 5ug、質粒 pMD2. G 3ug 與轉染試劑 PEI 80ug 混合。所述步驟(I)中，所述重組慢病毒的感染劑量具體可為M0I=5。 所述步驟(I)中，進行所述共培養時，還可加入輔助病毒感染的試劑，如Polybrene0所述Polybrene的加入量可為達到8ug/ml的濃度。所述步驟(I)中，所述共培養的時間具體可為6小時。所述步驟(I)中，所述共培養的溫度具體可為37°C。所述步驟(2)中，所述誘導細胞分化的時間可為2-4天。所述步驟(2)中，所述誘導細胞分化的初始時刻，所述脂多糖的濃度具體可為20ug/mlο所述離體的B細胞具體可為細胞表面標志物B220為陽性的細胞。所述離體的B細胞可為離體的小鼠B細胞，如離體的C57BL/6小鼠B細胞。所述離體的B細胞的制備方法具體如下取離體的小鼠脾臟，分離單個核細胞，然后收集細胞表面標志物B220為陽性的細胞，即為離體的B細胞。所述漿細胞具體可為細胞表面標志物⑶138為陽性的細胞。采用本發明提供的方法制備漿細胞具有如下顯著優點(1)得到的漿細胞純度高、數量多、分泌抗體能力強；(2)誘導時間短、操作簡單、方便實用。本發明建立了穩定的高效分泌抗體的漿細胞的制備方法，為漿細胞及其抗體的研究和應用奠定了基礎。
圖I 為質粒 pLKO. l-shmMysml 和質粒 pLKO. 1-puro eGFP shRNA 的結構不意圖；當shRNA為針對MYSMl基因的shRNA的編碼序列時，為質粒pLKO. 1-shmMysml ;當shRNA為針對eGFP基因的shRNA的編碼序列時，為質粒pLKO. 1-puroe GFP shRNA。圖2為實施例I中的流式細胞圖。圖3為實施例I中實驗組和對照組漿細胞生產抗體的能力比較。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。MOI (multiplicity of infection,感染復數)，含義是感染時病毒與細胞數量的比值。MYSMl基因編碼的蛋白如序列表的序列I所示，MYSMl基因如序列表的序列2或序列表的序列3所示。用于實施例的小鼠品種為C57BL/6小鼠，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK-(軍)-2007-004。LV-shmMysml 病毒將 293T/17 細胞(又稱 HEK293T/17 細胞；ATCCT Number CRL-11268 )接種于IOcm培養皿，待細胞達到85%融合時轉染混合物甲，培養60-72小時后收取上清，即為LV-shmMysml病毒液(可以干擾MYSMl基因表達)。混合物甲的制備方法將質粒 pLKO. 1-shmMysml (Sigma, Cat. No. TRCN0000085873，產品說明中有具體描述；http://www. broadinstitute. org/rnai/public/clone/details cloneId=TRCN0000085873 網頁中也具有相關描述，結構示意圖見圖I) 10ug、質粒pMDLg/pRRE(慢病毒包裝質粒；Addgene,Cat. No. 12251) 5ug、質粒 pRSV-Rev (慢病毒包裝質粒；Addgene, Cat. No. 12253)2. 5ug、質粒 pMD2. G (信封質粒；Addgene, Cat. No. 12259) 3ug 與轉染試劑 PEI (polyethyIenimine ；Polysciences Inc 公司，Cat. No. 23966)80ug 混合。質粒 pMDLg/pRRE、質粒 pRSV-Rev 和質粒pMD2. G都是制備慢病毒的質粒，質粒pLKO. 1-shmMysml為表達MYSMl基因的shRNA的質 粒，將上述四個質粒共同轉染細胞后，得到表達針對MYSMl基因的shRNA的重組慢病毒。LV-GFP 病毒將 293T/17 細胞(又稱 HEK293T/17 細胞；ATCC''Number CRL-11268 )接種于IOcm培養皿，待細胞達到85%融合時轉染混合物乙，培養60-72小時后收取上清，即為LV-GFP病毒液(可以干擾GFP基因表達)。混合物乙的制備方法將質粒pLKO. 1-puroeGFPshRNA (Sigma, Cat. No. SHC005V，產品說明中有具體描述；結構示意圖見圖l)10ug、質粒pMDLg/pRRE (慢病毒包裝質粒；Addgene, Cat. No. 12251) 5ug、質粒 pRSV-Rev (慢病毒包裝質粒；Addgene, Cat. No. 12253)2. 5ug、質粒 pMD2. G ((信封質粒；Addgene, Cat. No. 12259) 3ug與轉染試劑 PEI (po lyethy lenimine ；Polysciences Inc 公司，Cat. No. 23966) 80ug 混合。質粒pMDLg/pRRE、質粒pRSV-Rev和質粒pMD2. G都是制備慢病毒的質粒,質粒pLKO. 1-puroeGFP shRNA為表達eGFP基因的shRNA的質粒，將上述四個質粒共同轉染細胞后，得到表達針對eGFP基因的shRNA的重組慢病毒。Polybrene (輔助病毒感染的助轉劑):Santa Cruz 公司，Cat. No. sc-134220。胎牛血清Hyclone公司。LPS(英文全稱為Lipopolysaccharide,中文名稱為脂多糖):Sigma公司，貨號為 L4391-1MG。APC-B220 抗體eBioscience 公司，Cat. No. 17-0452-82。PE-CD138抗體BD 公司，Cat. No. 553714。實施例I、制備漿細胞和漿細胞的性能驗證I、取小鼠脾臟，剪碎，研磨后，用Ficoll密度梯度離心法(采用的Ficoll的密度是1.073g/ml)分離單個核細胞，然后用Mini MACS B220細胞免疫磁珠分選系統(德國Miltenyi公司，Cat. No. 130-049-501)分離細胞表面標志物B220為陽性的B細胞(B220+B細胞)。2、將步驟I得到的B220+B細胞懸于RPMI1640培養基中，得到2X IO5個細胞/ml的細胞懸液。3、將步驟I的細胞懸液接種至24孔板，每孔接種1ml，然后分成兩組(每組5個復孔)，分別進行如下平行處理實驗組加入LV-shmMysml病毒液(M0I=5)和polybrene (使其濃度達到8ug/ml),然后1200g離心90min ；
對照組加入LV-GFP病毒液(M0I=5)和polybrene (使其濃度達到8ug/ml)，然后1200g 離心 90min。將實驗組和對照組37°C孵育6小時。4、完成步驟3后，每孔加入胎牛血清(使其體積比達到10%)，然后每孔加入LPS(使其濃度達到20ug/ml),于培養箱誘導培養2天或4天。5、完成步驟4后，收集細胞，每2X IO5個細胞加入I個EP管，用PBS緩沖液洗兩遍后加入APC-B220和PE-⑶138抗體，4°C避光反應30分鐘，然后用PBS緩沖液洗兩次，然后進行流式細胞術檢測。流式細胞圖見圖2。第2天，實驗組中漿細胞占總細胞的比率達到21%，對照組中漿細胞占總細胞的比率為5. 95%，實驗組是對照組的3-4倍。第4天，實驗組中漿細胞占總細胞 的比率達到49. 4%，對照組中漿細胞占總細胞的比率為24. 1%。結果表明，采用LV-shmMysml病毒干擾MYSMl基因表達后，縮短了誘導漿細胞的時間并提高了獲得漿細胞的效率，漿細胞占總細胞的比率顯著升高。6、收集步驟4中培養4天的細胞，用⑶138細胞免疫磁珠分選系統(德國Miltenyi公司，Cat. No. 130-092-530)分離細胞表面標志物CD138為陽性的細胞(CD138+細胞)，即漿細胞。7、將步驟6得到的漿細胞懸于含10% (體積比)胎牛血清的RPMI1640培養基中，得到I X IO5細胞/ml的細胞懸液。8、將步驟7的細胞懸液接種至96孔板，每孔接種O. 1ml，37°C孵育36小時，然后收集上清液。9、采用ELISA試劑盒檢測步驟8得到的上清液中的IgM水平和IgG水平。用于檢測IgM水平的試劑盒如下(按試劑盒說明進行操作)Mouse IgM ELISAReady-SET-Go (eBioscience 公司，Cat. No. 88-50470)。用于檢測IgG水平的試劑盒如下(按試劑盒說明進行操作)Mouse IgG totalELISA Ready-SET-Go (eBioscience 公司，Cat. No. 88-50400)。結果見圖3 (三次試驗，每次試驗3個復孔的平均值)。對于同樣數量的漿細胞來說，實驗組分泌IgM和IgG的能力是對照組的3-4倍或4-5倍。結果表明，采用LV-shmMysml病毒干擾MYSMl基因表達后，漿細胞分泌抗體的能力顯著增強。
權利要求
1.一種用B細胞制備漿細胞的方法，依次包括如下步驟 (1)干擾離體的B細胞中MYSMl基因的表達；所述MYSMl基因為編碼序列表的序列I所不蛋白質的基因； (2)采用脂多糖誘導細胞分化為漿細胞。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述“干擾B細胞中MYSMl基因的表達”的實現方式如下在所述離體的B細胞中導入抑制所述MYSMl基因表達的物質。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述“抑制所述MYSMl基因表達的物質”為表達針對所述MYSMl基因的shRNA的重組慢病毒。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述“在所述離體的B細胞中導入抑制所述MYSMl基因表達的物質”的實現方式如下將所述重組慢病毒與所述離體的B細胞共培養。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述重組慢病毒的制備方法包括如下步驟將重組質粒甲、質粒pMDLg/pRRE、質粒pRSV-Rev和質粒pMD2. G共轉染哺乳動物細胞，培養細胞后得到重組慢病毒；所述重組質粒甲為含有DNA片段甲的質粒；所述DNA片段甲編碼的RNA為具有沉默所述MYSMl基因的功能的shRNA。
6.如權利要求3或4或5所述的方法，其特征在于所述重組慢病毒的感染劑量為M0I=5。
7.如權利要求4或5或6所述的方法，其特征在于進行所述共培養時，加入輔助病毒感染的試劑。
8.如權利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，所述誘導細胞分化的時間為2-4天。
9.如權利要求I至8中任一所述的方法，其特征在于所述離體的B細胞為離體的小鼠B細胞。
10.權利要求I至9中任一所述方法制備得到的漿細胞。
全文摘要
本發明公開了一種制備漿細胞的方法及其得到的漿細胞。本發明提供了一種用B細胞制備漿細胞的方法，依次包括如下步驟(1)干擾離體的B細胞中MYSM1基因的表達；所述MYSM1基因為編碼序列表的序列1所示蛋白質的基因；(2)采用脂多糖(Lipopolysaccharide)誘導細胞分化為漿細胞。采用本發明提供的方法制備漿細胞具有如下顯著優點(1)得到的漿細胞純度高、數量多、分泌抗體能力強；(2)誘導時間短、操作簡單、方便實用。本發明建立了穩定的高效分泌抗體的漿細胞的制備方法，為漿細胞及其抗體的研究和應用奠定了基礎。
文檔編號C12N15/867GK102807994SQ201210262858
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者江小霞, 毛寧 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所