3-吡唑基酪氨酸翻譯系統及其應用的制作方法
【專利摘要】3-吡唑基酪氨酸翻譯系統及其應用。本發明涉及氨酰基-tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。本發明提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對將3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)定點特異插入目標蛋白質的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。所述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統包含：(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
【專利說明】3-吡唑基酪氨酸翻譯系統及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物化學領域。具體地，本發明提供氨酰基-tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。本發明還涉及一種3-吡唑基酪氨酸((S)-2-氨基-3-(4-羥基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸，簡寫為pyTyr)的高效合成方法及包含其的翻譯系統。更具體地，本發明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它們的配對將3-吡唑基酪氨酸定點特異插入目標蛋白質的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本發明還涉及用這種翻譯系統和這種方法產生的含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質，例如，含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，以及含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的應用。
【背景技術】
[0002]電子傳遞(Eletctron Transfer, ET)涉及體內許多重要的生化過程,包括光合作用和細胞色素P450介導的氧化作用等。盡管目前人們在了解生物大分子如核酸及蛋白質的電子傳遞機制方面取得了巨大進步，但是對蛋白質的電子傳遞實驗仍依賴于在蛋白質本身含有的殘基如組氨酸或半胱氨酸上連接探針來進行，因此該方法僅能用于研究小的可溶性蛋白，這也就大大地限制了其應用。光誘導電子傳遞(photo-1nduced electrontransfer,PET)導致的突光淬滅是一種用來探索生物大分子中的電子傳遞機理及酶分子構象動力學等的有利工具，但由于受到目前技術的限制，缺乏新技術手段仍是將光電子轉移應用于生物功能研究中的一個瓶頸。研究者通常利用色氨酸和酪氨酸等天然氨基酸作為電子供體，熒光基團作為電子受體，因此也只能限制于研究相對簡單的生物學系統。
[0003]我們通過在蛋白中遺傳整合金屬螯合非天然氨基酸(UAAs)來克服上述限制因素。相比于在蛋白電子傳遞過程研究中作為電子供體的多種天然氨基酸以及多巴、3-氨基酪氨酸或者二氟代酪氨酸等非天然氨基酸，3-吡唑基酪氨酸-Cu (II)可以作為電子受體，這種獨特的性質使得我們可以研究復雜生物學系統中的電子傳遞過程，而這是先前的電子傳遞研究方法所不能達到的。盡管已有報道含有可以結合金屬基團(如聯吡啶，羥基喹啉等)的非天然氨基酸可以被基因編碼至目標蛋白中，但是對于它們在蛋白中發揮電子傳遞功能的應用至今卻沒有描述，而且，以上非天然氨基酸應用的最大瓶頸問題來自于其合成的復雜性，目前能夠整合至蛋白中的以上非天然氨基酸的合成至少需要五個步驟才能得到產率較低的消旋混合物，而且整個合成過程涉及到重金屬催化，致癌溶劑，強酸強堿以及多重純化步驟。本發明中，我們開發了一種高效合成金屬螯合非天然氨基酸-3-吡唑基酪氨酸(PyTyr)的方法，該方法僅需兩步就可以獲得較高產率(50%)的pyTyr，并且不需要經過后續復雜的過柱純化步驟即可被遺傳整合到蛋白質中。
[0004]水母綠色突光蛋白(Aequoreavictoria green fluorescent protein, GFP)目前被廣泛應用于研究生物分子定位和相互作用中，但是在水母中該蛋白的生物功能及機制至今仍在探索研究中。近期，有研究表明GFP可以作為光誘導電子供體，因此在生物體內可能通過感光進而發揮體內電子傳遞的功能。然而，由于缺乏在目標蛋白的特定位點中加入電子受體的有效方法，導致人們無法深入了解生物體內GFP的電子傳遞機制。本發明擬通過在GFP中定點特異插入pyTyr,使其通過螯合銅離子Cu(II)形成pyTyr_Cu (II)復合物，而PyTyr-Cu(II)可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發色基團產生光誘導電子傳遞，該研究將為GFP的電子傳遞機制提供研究基礎。本研究現已開發了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內位點特異性地定點插入蛋白質的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質翻譯組分，所述組分識別合適的選擇密碼子(selector codon)從而能在體內多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識別選擇密碼子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相應的特異性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該Ο-tRNA。這些組分不與宿主生物體內的任何內源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對可能遺傳編碼大量結構各異的非天然氨基酸。
[0005]本領域普遍知道利用適合于制備含一個或多個非天然氨基酸的蛋白質的正交翻譯系統，例如產生正交翻譯系統的通用方法。例如，參見國際公布號WO 2002/086075，其發明名稱為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ；W0 2002/085923，其發明名稱為 “ IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;W0 2004/094593，其發明名稱為“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定點特異插入非天然氨基酸的正交翻譯系統及它們的產生和使用方法的其他討論還可參見Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) 1:1-11(2002)；Wang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66 (2005) ；Xie 和 Schultz,Methods 36(3):227-238(2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion in Chemical Biology9 (6):548-554 (2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249 (2006)。
【發明內容】
[0006]1、技術問題
[0007]本發明提供一種氨酰基-tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ IDNO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。這種氨酰基-tRNA合成酶突變體能夠用3-吡唑基酪氨酸優先氨酰化與之配對的正交tRNA，從而在翻譯的氨基酸序列中插入3-吡唑基酪氨酸。這是本發明人首次發現的，相應地，在本發明中將其命名為正交3-吡唑基酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(pyTyrRS)。
[0008]本發明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對將3_吡唑基酪氨酸定點特異插入目標蛋白質的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本發明還涉及用這種翻譯系統和這種方法產生的含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質及其應用。
[0009]因此，本發明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對將3-吡唑基酪氨酸定點特異插入蛋白質的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，并且提供該翻譯系統在目標蛋白質中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。
[0010]本發明還提供利用本發明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統產生的含有至少一個3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質。在本發明的優選方面中，本發明人利用這種方法將3-吡唑基酪氨酸定點特異插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，綠色熒光蛋白(GFP)。通過本發明的方法得到的包含3-吡唑基酪氨酸的突變綠色熒光蛋白通過螯合銅離子，可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發色基團產生光誘導電子傳遞。同時，本發明還通過解析了 GFP-151pyTyr和GFP-151pyTyr_Cu(II)的高分辨率晶體結構為pyTyr螯合銅離子及GFP發色基團和PyTyr-Cu(II)之間產生的光誘導電子傳遞提供了結構研究基礎。然而，本領域技術人員應該理解，本發明的方法也可以用于在綠色熒光蛋白之外的多種蛋白中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸，并不局限于綠色熒光蛋白。[0011]最后，本發明還有一個目的是提供一種高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，該方法僅需兩步就可以獲得較高產率的pyTyr，并且不需要經過后續復雜的過柱純化步驟。
[0012]2、技術方案
[0013]本發明人經過篩選，首次獲得一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。并且，本發明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研發了 3-吡唑基酪氨酸翻譯系統。
[0014]具體來說，本發明提供在體內(例如在宿主細胞內)對選擇密碼子(selectorcodon)如琥珀終止密碼子(TAG)起反應而將非天然氨基酸3-吡唑基酪氨酸定點特異插入延伸中的多肽鏈的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統。所述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統包含不與宿主細胞翻譯機制相互作用的正交-tRNA (Ο-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配對。SP，宿主細胞內源性氨酰基-tRNA合成酶不會用氨基酸(天然的或非天然的)加載0-tRNA。類似地，本發明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下不以可檢測水平地用氨基酸(天然的或非天然的)加載內源性tRNA。利用所述翻譯系統能夠產生含有在翻譯過程中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的大量蛋白質。
[0015]在一些方面中，本發明提供3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，所述翻譯系統包含:(a)非天然氨基酸，即3-吡唑基酪氨酸，(b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和(c)正交tRNA(Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)，優先氨酰化所述0-tRNA。
[0016]優選地，本發明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統還包含編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識別的至少一個選擇密碼子，優選地為琥珀密碼子。更優選地，本發明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統還包含編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0017]所述系統中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即為本發明人發現的氨酰基tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。
[0018]在本發明的優選方面中，本發明提供一種3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，所述系統包含:
[0019](i) 3-吡唑基酪氨酸；
[0020](ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0021](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和[0022](iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
[0023]優選地，所述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統還包含編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0024]該翻譯系統中的各種組分可以衍生自各種物種來源，例如，該翻譯系統中的各組分衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA (Ο-tRNA)為古菌來源的反密碼子突變為與琥珀密碼互補的酪氨酸tRNA。在一些實施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些實施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，優選地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID N0:1所示。在一個實施方式中，用于該系統的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列及該序列的保守變體。
[0025]在一些方面中，本發明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統還包含編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識別的至少一個選擇密碼子。在優選方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
[0026]在一些方面中，本發明提供包含正交tRNA序列和編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細胞。所用的宿主細胞不作具體限定，只要O-RS和Ο-tRNA在它們的宿主細胞環境中保留它們的正交性即可。例如，所述宿主細胞可以是真細菌細胞，如大腸桿菌。如實施例所述，可以將包含正交tRNA序列的重組載體和包含編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重組載體共轉化到宿主細胞中，而獲得包含正交tRNA序列和編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細胞。所述包含正交tRNA序列和編碼本發明的正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細胞構成本發明的另一個方面。
[0027]本發明還提供產生在至少一個所選位置定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質的方法。所述方法利用上述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統實現。所述方法通常始于提供含有以下組分的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統的步驟:(i)非天然氨基酸，即3-吡唑基酪氨酸；(?)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS) ; (iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)優先氨酰化所述Ο-tRNA;和(iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列轉化到適當的宿主細胞中，然后將編碼所述目標蛋白質的核酸轉化到包含正交tRNA序列和編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細胞中，在培養基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白質的翻譯過程中，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的Ο-tRNA對所述選擇密碼子起反應而將培養基中的3-吡唑基酪氨酸定點特異插入所述目標蛋白質的所選位置，從而產生在所選位置含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質。其中包含正交tRNA序列和編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細胞可以通過將包含正交tRNA序列的重組載體和包含編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重組載體共轉化到所選的宿主細胞中而獲得。本領域技術人員應該理解，適當的重組載體的構建和宿主細胞的篩選可以通過常規分子克隆技術和篩選技術實現。
[0028]在所述方法的一些實施方式中，提供翻譯系統的步驟包括通過定點誘變使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸結合口袋發生突變，選擇用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)優先氨酰化所述Ο-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突變體(即，本發明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述選擇步驟包括定點誘變后從得到的氨酰基-tRNA合成酶分子庫進行所述O-RS的正選擇和負選擇(參見下述實施例2)。在一些實施方式中，提供翻譯系統的步驟還包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA為古菌來源的反密碼子突變為與琥珀密碼互補的酪氨酸tRNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。在這些方法中，提供翻譯系統的步驟還包括提供含有所述翻譯系統所用的琥珀選擇密碼子的編碼目標蛋白質的核酸。 [0029]還可在宿主細胞內實施產生含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質的方法。在這些情況中，提供的宿主細胞包含本發明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(即，包含編碼O-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一個選擇密碼子的編碼目標蛋白質的核酸)，而在適宜的培養條件下(例如，在培養基中添加3-吡唑基酪氨酸等)培養該宿主細胞可導致在所述目標蛋白質中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸。在一些實施方式中，提供步驟包括提供真細菌宿主細胞(例如，大腸桿菌)。
[0030]本發明還提供生產含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的方法，所述方法利用上述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，其中所用的編碼綠色熒光蛋白突變體的核酸序列可以為，但不限于，SEQ ID NO:8，10，12，例如，在野生型綠色熒光蛋白的149位，151位和182位分別引入3-吡唑基酪氨酸，相應地，利用本發明的突變方法所得到綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:7,9,llo這些方法通常始于提供含有以下組分的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統的步驟:(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)正交tRNA(Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3-吡唑基酪氨酸優先氨酰化所述Ο-tRNA ;和(iv)編碼所述綠色熒光蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQ ID NO:8，10，12，其中所述核酸含有所述Ο-tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列轉化到適當的宿主細胞中，然后將編碼所述目標蛋白質的核酸轉化到所得到的宿主細胞中，在培養基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白質的翻譯過程中，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的Ο-tRNA對所述選擇密碼子起反應而將培養基中的所述3-吡唑基酪氨酸定點特異插入所述綠色熒光蛋白的所選位置，之后通過螯合銅離子來研究GFP的光誘導電子傳遞。
[0031]本發明還提供利用本發明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統產生的含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，所述綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:7，9，ll，在野生型綠色熒光蛋白的149位，151位和182位分別引入3-吡唑基酪氨酸，所述綠色熒光蛋白突變體通過螯合銅離子產生光誘導電子傳遞。
[0032]最后，本發明還提供一種高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，所述方法包括下列兩個步驟:第一步:在50ml圓底燒瓶中加入2.46g3-碘代酪氨酸,溶于20ml 10%NaOH水溶液中，另取1.92gt-Boc酸酐溶于20ml THF中后，將其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室溫下攪拌過夜，停止反應后，加入適量的鹽酸，調節PH值至6.5-7.0之間，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相進行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
[0033]第二步:取一干凈的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g無水Cs2C03，0.019gCuI (作為催化劑)，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml無水DMF。在氮氣保護的條件下，攪拌并于180°C回流18小時，冷卻后，旋干DMF，用無水乙醇溶解并抽濾沉淀，取濾液加濃鹽酸至沉淀完全，然后再進行抽濾，旋干濾液，用乙酸乙酯和蒸餾水進行萃取，收集水相，用制備型HPLC進行分離純化。
[0034]本領域技術人員應該理解，上述制備方法中各反應物的用量僅是舉例說明的目的，本領域技術人員根據所需終產物量等因素，可以適當成比例放大或減少各反應物用量，這也在本發明的范圍之內。
[0035]3、有益效果
[0036]蛋白質分子設計的目的之一是揭示一些通過研究天然蛋白所無法獲得的生物原理，而這些新的原理可能會有潛在的生物化學與生物物理的應用前景。然而，近觀一些天然存在的金屬蛋白，我們發現自然界利用金屬或其配合物的種類十分有限。而且能與這些金屬或其配合物形成配位作用的氨基酸種類也十分有限，自然界存在的20種天然氨基酸中能形成配位作用的不到一半。對于天然配位性氨基酸的局限性，人們正試圖通過在蛋白的設計與構建的過程中引入非天然氨基酸來加以克服。這些非天然氨基酸與天然氨基酸在結構上有著類似性，但其結構與性質更多樣化。
[0037]通過生物正交化學的方法選擇性的修飾蛋白，可以實現蛋白位點特異性插入非天然氨基酸。應用琥珀密碼子在細胞中編碼3-吡唑基酪氨酸，實現在綠色熒光蛋白中特定位點插入該非天然氨基酸，使其螯合銅離子Cu(II)形成PyTyr-Cu(II)復合物，而PyTyr-Cu(II)可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發色基團產生光誘導電子傳遞。同時，本發明還通過解析了 GFP-15IpyTyr和GFP-15IpyTyr-Cu (I I)的高分辨率晶體結構為pyTyr螯合銅離子及GFP發色基團和PyTyr-Cu(II)之間產生的光誘導電子傳遞提供了結構研究基礎。同時，本發明涉及的高效合成3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的方法，大大簡化了合成步驟，避免了合成過程中所涉及到的重金屬催化，致癌溶劑及強酸強堿，并且不需要經過后續復雜的過柱純化步驟就能得到較高產率的目標產物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中:
[0039]圖1是(S)-2-氨基-3-(4-羥基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸(簡寫為pyTyr)的化學合成；
[0040]圖2是pyTyr的核磁圖譜，上圖是氫譜圖，下圖是碳譜圖；
[0041]圖3是正交tRNA，氨酰基-tRNA合成酶，肌紅蛋白及綠色熒光蛋白系列突變體序列；
[0042]圖4是SDS-PAGE電泳圖及質譜圖:A是pyTyr_Mb (4TAG)的SDS-PAGE電泳圖，B是pyTyr-GFP(151TAG)的 SDS-PAGE 電泳圖；C 是 pyTyr-Mb (4TAG)的質譜圖；
[0043]圖5 是 wt GFP, GFP_149pyTyr 和 GFP_151pyTyr 的熒光光譜圖；
[0044]圖 6 是 wt GFP, GFP_149pyTyr, GFP_151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 中加入不同濃度Cu(II)離子后的熒光強度圖；
[0045]圖7是亞鐵氰化鉀導致的GFP-149pyTyr_Cu(II)熒光強度恢復；
[0046]圖8是熒光淬滅強度與溫度的關系圖；
[0047]圖9是pyTyr-Cu (II)的吸收光譜和GFP的熒光光譜圖；[0048]圖10是GFP-149pyTyr-Cu(II)光激發后加入BCS的吸收光譜圖；
[0049]圖11是GFP系列突變體螯合銅離子后的熒光壽命曲線圖；
[0050]圖12是GFP發光基團和pyTyr殘基間距離值與光誘導電子傳遞速率kET值的線性關系圖；
[0051]圖13是高分辨率晶體結構圖和電子密度圖:A是GFP-151pyTyr-Cu(II)的晶體結構圖；B是GFP-151pyTyr的電子密度圖；C是GFP-151pyTyr_Cu(II)的電子密度圖。
【具體實施方式】
[0052]以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發明的范圍和精神。
[0053]本領域技術人員應該理解，除非特別說明，下述實施例中所用的化學試劑均為可通過商業途徑購得的分析純級別的試劑。
[0054]實施例1:pyTyr的化學合成(參見圖1和圖2)
[0055]在50ml圓底燒瓶中加入3_碘代酪氨酸(2.46g，8mmol，購自上海吉爾生化公司)，溶于20ml 10% NaOH水溶液中，另取t-Boc酸酐(1.92g，8.8mmol，購自北京中勝華騰有限公司)溶于20ml THF中后，將其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室溫下攪拌過夜。停止反應后，加入適量的鹽酸，調節pH值至6.5-7.0之間，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相進行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸。
[0056]取一干凈的50ml三口瓶，加入吡唑(0.34g, 5mmol,購自Sigma公司)，無水Cs2CO3 (1.92g, IOmmol,購自天津 Alfa Aesar 公司)，CuI (0.019g, 0.1mmol,作為催化劑)，Boc-L-3-碘代酪氨酸(2.03g,5mmol)和8ml無水DMF(購自北京百靈威公司)。在氮氣保護的條件下，攪拌并于180°C回流18小時。冷卻后，旋干DMF，用無水乙醇溶解并抽濾沉淀，取濾液加濃鹽酸至沉淀完全，然后再進行抽濾，旋干濾液，用乙酸乙酯和蒸餾水進行萃取，收集水相，用制備型HPLC進行分離純化(分離柱YMC AA12S052503WT，購自慧德易公司，流速 12ml/min)。收率 50 % ? MS:m/z:248 [M+H]+ ；IH-NMR(600MHz, DMS0_d6(CD3S0CD3)):δ 10-11.6(s-b, 1H)，8.44(t，2H)，8.38(s, 1H)，7.8(s, 1H)，7.7(s, 1H)，7.14(dd, I Η)，
6.6(s, 1H) ,4.27 (dd, 1H, -CH)，3.19 (m，2H，-CH2).13C NMR(600MHz, DMS0_d6) d 35，54，107，118，124，126，127，129，132，139，147，172ppm.[0057]以上合成反應所需化學試劑如無特別說明，均購自北京化工廠，純度均為分析純以上級別。
[0058]實施例2:進化pyTyr特異性氨酰基-tRNA合成酶
[0059]為了在基因中位點特異性插入pyTyr，需要在所用的E.coli宿主細胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交對，這個正交對來源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA (MjtRNACUATyr) /酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2)對。MjTyrRS突變庫構建在卡納霉素抗性pBK質粒(購自美國Scripps研究所Peter G.Schultz實驗室)中，位于該質粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的啟動子和終止子之間。所使用的合成酶突變庫為pBk-lib-jwl庫，該突變庫的構建方法為:在MjTyrRS 基因上挑選 6 個位點(Tyr32，Leu65，Phel08，Glnl09，Aspl58，和 Leul62)引入 NNK突變(N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6個位點(Ile63,Ala67,His70,Tyrll4, Ilel59,Vall64)或隨機突變為 Gly 或保持不變(參見 Xie, J.；Liu, ff.S.；Schultz, P.G.Angew.Chem., Int.Ed.2007,46,9239-9242 ;Wang, JY.；Zhang ff.；Song WJ ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010,132,14812-14818)。
[0060]通過正負篩選來進化特異性識別pyTyr的氨酰基-tRNA合成酶(參見Liu，X.H.；Yu, Y.；Hu,C.；Zhang, ff.；Lu,Y.；ffang, J.Y,Significant Increase of Oxidase Activitythrough the Genetic Incorporation of a Tyrosine-Histidine Cross-Link in aMyoglobin Model of Heme-Copper Oxidase.Angewandte Chemie-1nternational Edition2012,51 (18),4312-4316.)。正篩選質粒包含MjtRNACUATylr，TAG突變的氯霉素乙酰轉移酶基因，啟動表達綠色熒光蛋白的琥珀突變的T7 RNA聚合酶，四環素抗性基因。負篩選質粒包含MjtRNAa/'在阿拉伯糖操縱子下的琥珀突變芽孢桿菌RNA酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。進行3輪正負篩選:包含有正篩選質粒的E.coli DHlOB細胞作為正篩選寄主細胞。細胞電轉pbk-lib-jwl庫，SOC培養基(2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母粉，0.05%(W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖)在37°C培養I小時。之后換用極限培養基(GMML 極限培養基的配方:M9 鹽 / 甘油:764gNa2HP04.7H20 或者 30g Na2HPO4,15g KH2PO4,
2.5g NaCl，5g NH4Cl, 50ml 甘油，高壓滅菌，pH 7.0 ；1M MgSO4:高壓滅菌；50mM CaCl2:高壓滅菌；25mM FeCl2:過濾滅菌；0.3M亮氨酸:溶解于0.3M NaOH中，過濾滅菌；1L液體GMML培養基:200ml M9鹽/甘油，2ml MgSO4, 2ml CaCl2, 2ml FeCl2, Iml亮氨酸)洗兩次，鋪板固體極限培養基(在液體GMML培養基中加入500ml 3%瓊脂粉，0.5mM pyTyr，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四環素)，37°C培養60小時。收取細胞，提取質粒DNA，電泳分離，膠回收。然后，將經過正篩選 的pBK-lib-jwl轉化到包含負篩選質粒的DH10B感受態細胞中。SOC培養基中恢復I小時。之后涂板包含0.2%阿拉伯糖(購自sigma公司)的LB固體培養基(每升培養基含IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl)。37°C培養8_12小時。共重復3輪。
[0061]最后一輪正篩選挑384個克隆，分別點板在含有0.5mM pyTyr、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固體培養基上，及不包含pyTyr、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固體培養基。挑選在在0.5mM pyTyrl20mg/L氯霉素的培養基上生長，而在OmM pyTyr 40mg/L氯霉素培養基中不生長的克隆進行進一步驗證。挑出3個克隆，其中克隆I的3-吡唑基酪氨酸插入效率最高，測序表明，克隆I所包含的氨酰基-tRNA合成酶突變體(pyTyrRS)的氨基酸序列為SEQ ID N0:3所示，其中突變位點為Tyr32Asp，Leu65Thr，His70Gly和Aspl58Ala。
[0062]實施例3:表達pyTyr-肌紅蛋白，pyTyr-綠色突光蛋白及質譜鑒定
[0063]將正交tRNA(SEQ ID NO:1)和篩選出來的pyTyrRS (SEQ ID NO:3)分別構建到pEVOL載體(購自美國scripps研究所Peter G.Schultz實驗室)上,然后共轉化到包含有pbad-肌紅蛋白(4TAG)或pET-綠色熒光蛋白(151TAG)表達質粒(該質粒購自美國Scripps研究所Peter G.Schultz實驗室)(其中肌紅蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:5,綠色熒光蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:10)的DH10B細胞(購自全式金公司)中。挑取單個克隆在37°C培養到OD6tltl約等于1.1時，向LB培養基中加入0.5mM pyTyr, ImM IPTG及0.2%阿拉伯糖(購自Sigma公司)培養細胞,對照不加入pyTyr。6_8小時之后，收菌，N1-NTA純化蛋白，并用SDS-PAGE電泳分析(圖4A，圖4B)。[0064]我們發現，只有在存在pyTyr的培養基中才能純化出全長的肌紅蛋白和綠色熒光蛋白，這說明篩選出來的pyTyrRS可以特異性的識別pyTyr。在LB培養基中pyTyr-肌紅蛋白的產率為10mg/L，而野生型肌紅蛋白的產率為50mg/L ;pyTyr_綠色熒光蛋白的產率為20mg/L,而野生型綠色突光蛋白的產率為100mg/L。為了檢測pyTyr僅僅插入到肌紅蛋白的4位琥珀突變位點，我們對pyTyr-肌紅蛋白進行了 ES1-TOF質譜檢測，檢測結果分子量為18496Da(圖4C)，與計算的分子量18496Da吻合。
[0065]實施例4:表達pyTyr-綠色熒光蛋白突變體進行光誘導電子傳遞研究
[0066]我們用基因工程方法構建了綠色熒光蛋白系列突變體(核苷酸序列如SEQ ID NO:8，10，12所示)，其中149位，151位和182位分別突變為TAG終止密碼子，然后用實施例3中的相同方法在GFP的突變位定點特異插入pyTyr，表達產生突變蛋白GFP_149pyTyr，GFP-151pyTyr 和 GFP_182pyTyr (氨基酸序列如 SEQ ID NO:7，9，11 所示)。
[0067]由于本發明主要通過測量熒光淬滅和熒光壽命的方法來研究GFP的光誘導電子傳遞，因此首先需驗證GFP突變后有沒有對蛋白自身的熒光強度產生影響，所以我們測量了 ΙμΜ wt GFP(核苷酸序列為 SEQ ID NO:6)，GFP_149pyTyr 和 GFP_151pyTyr 在 60mMTris-HCl (pH 7.0)緩沖液中的發射光譜，結果顯示GFP系列突變體與其野生型的發射光譜相似，說明GFP中引入非天然氨基酸后沒有影響蛋白的發光團形成及其熒光量子產率(圖5)。然后，我們往 5μ M Wt GFP，GFP-149pyTyr, GFP_151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 中加入不同濃度的Cu(II)離子，測量其熒光強度，結果如圖6所示，加入5μΜ的Cu(II)離子可以導致 GFP-149pyTyr，GFP-151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 的熒光強度分別淬滅 85 %，50 %和 25 %，而wt GFP僅僅淬滅了不到5%,證明GFP中插入pyTyr后可以有效地螯合銅離子,且蛋白熒光可以被Cu(II)不同程度的淬滅。接著，我們又往GFP-149pyTyr-Cu(II)中分別加入多種對Cu(II)離子具有不同親和力的銅離子螯合劑:甲硫氨酸、乙二胺、組氨酸、44'-聯吡啶和N-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸，通過測量GFP-149pyTyr-Cu(II)的熒光強度，再結合Scatchard分析法計算發現GFP-149pyTyr對Cu (II)具有高度親和力，其Kd值為0.9nM。然后，我們用還原滴定法往5 μ M GFP-149pyTyr-Cu (II)中加人50mM還原劑亞鐵氰化鉀，發現其可以完全恢復GFP-149pyTyr-CU(II)的熒光強度(圖7)，根據能斯特方程設計實驗并計算得出GFP-149pyTyr-Cu(II)的還原電位為168mV，這與Cu2++丨一Cu+中產生的153mV電位值很接近。以上這些結果都充分地證明GFP-149pyTyr對Cu(II)的高度親和力。
[0068]由于GFP在不同位置含有結合金屬離子的非天然氨基酸pyTyr，其熒光強度可以被Cu(II)離子不同程度的淬滅，為了驗證這種淬滅機制，我們還檢測了熒光淬滅強度和溫度的關系，發現淬滅強度隨著溫度的增加而降低(圖8)，說明該淬滅現象并非動態熒光淬滅；如圖9所示，pyTyr-Cu(II)的吸收光譜和GFP的熒光光譜沒有重疊，因此由FRET引起的淬滅機制也可能得到排除；為了進一步驗證以上的熒光淬滅機制為PET機制，我們選用一種Cu(I)特異性螯合劑-bathocuproine disulfonate (浴酮靈二磺酸二鈉鹽,BCS)來驗證GFP-149pyTyr-Cu(II)中的光誘導電子傳遞現象，因為當GFP_149pyTyr螯合Cu(II)并且經過光激活后，如果能夠在GFP和Cu(II)之間形成電子傳遞，勢必會產生Cu(I),而BCS和Cu (I)特異性結合形成的復合物在483nm處具有較強吸收(摩爾消光系數為12，δΟΟΜ^1)。測量結果如圖10所示，當2μΜ GFP-149pyTyr,5yM Cu(II)和10 μ M BCS的混合液經過405nm激光激發后，其在483nm處的吸光值迅速升高，并且在10分鐘后達到最高值。計算發現，該過程中產生了 4.ΙμΜ Cu1(BCS)2產物。即I當量的蛋白通過光誘導轉移可以產生兩個當量的電子轉移，這些結果與之前報道的GFP能通過光誘導產生2個電子氧化的結果一致。該實驗證實了 GFP發色基團和pyTyr-Cu(II)之間確實產生了光誘導電子傳遞現象。
[0069]通過測量熒光壽命進一步研究GFP發色基團和pyTyr-Cu(II)之間的光誘導電子傳遞速率。如圖11所示，加入Cu(II)后，PyTyr-GFP不同突變體的熒光壽命均不同程度的減短，其中GFP-149pyTyr的突光壽命從3.4ns降低至0.7ns,根據公式:kET = τ 加入Cu(II))-τ2_Η不加Cu(II))可以得到GFP-149pyTyr-Cu(II)的光誘導電子傳遞速率kET為 1.13X IOV1 ;同理計算出 GFP-151pyTyr-Cu(II)和 GFP_182pyTyr_Cu (II)的 kET 分別為
0.37X IO9 和 0.08X IOV1 (表 I)。相比于 GFP_149pyTyr_Cu (II)，GFP-15IpyTyr-Cu (II)和GFP-182pyTyr-Cu(II)電子傳遞速率有所降低，我們推測很有可能是因為GFP發色團與pyTyr殘基之間的距離增大而導致的，因此我們根據GFP-151pyTyr_Cu (II)高分辨率晶體結構(如實施例5所述)計算出GFP發色基團與pyTyrl51殘基之間的距離為為11.4A，而GFP發色基團與pyTyr 149和pyTyr 182之間的距離則通過測量GFP-15IpyTyr-Cu (II)晶體結構中其與Asnl49和Tyrl82之間的距離得到。結果如圖12所示，GFP發色基團和PyTyr-Cu(II)之間的光誘導電子傳遞速率隨著它們之間距離的增加而減慢。由于GFP 二級結構主要為β桶組成的，實驗證明該種類型結構相對于α螺旋更有利于GFP中的電子傳遞發生。通過計算發現GFP-151pyTyr-Cu (II)的距離衰減因子β值為0.7,該值小于在通常蛋白中的距離衰減因子，因此推測在該GFP蛋白中的電子傳遞有可能還存在跳躍模式，使電子傳遞更加有效的進行。需要值得關注的是，GFP-151pyTyr-Cu(II)的電子傳遞速度約10-100倍低于光系統(II)的主要電子傳遞反應，但高于目前為止的光系統(II)模擬系統。
[0070]表1.GFP系列突變體的熒光壽命值及電子傳遞速率kET值。
【權利要求】
1.一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。
2.一種3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，所述系統包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；和 (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA。
3.如權利要求2所述的翻譯系統，其還包含(iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。
4.如權利要求2所述的翻譯系統，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且其還包含編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
5.一種宿主細胞，其包含所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列，并且該所述宿主細胞是真細菌細胞，優選大腸桿菌細胞。
6.一種產生在至少一 個所選位置定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質的方法，所述方法包括下述步驟: (a)提供權利要求3所述的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，該系統包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)編碼所述目標蛋白質的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子；和 (b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列轉化到適當的宿主細胞中，然后將編碼所述目標蛋白質的核酸轉化到所得到的宿主細胞中，在培養基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白質的翻譯期間，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的正交tRNA對所述選擇密碼子起反應而將培養基中的3-吡唑基酪氨酸定點特異插入所述目標蛋白質的所述所選位置，從而產生在所選位置含3-吡唑基酪氨酸的所述目標蛋白質。
7.生產含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的方法，其利用權利要求6所述的方法，其中所用的編碼綠色熒光蛋白突變體的核酸序列分別為SEQ ID NO:8，10，12，在野生型綠色熒光蛋白的149位，151位和182位分別引入3-吡唑基酪氨酸，所述綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列分別為SEQ ID NO:7,9,llo
8.由權利要求7所述的方法獲得的含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，其氨基酸序列選自SEQ ID NO:7，9或11。
9.由權利要求8獲得的綠色熒光蛋白突變體及其螯合銅離子后形成的復合物的高分辨率晶體結構，其中所述綠色熒光蛋白突變體的核酸序列為SEQ ID NO:8，10，12，氨基酸序列分別為 SEQ ID NO:7,9,11ο
10.一種高效的3-批唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法,其包括下述兩個步驟: 第一步:在50ml圓底燒瓶中加入2.46g 3-碘代酪氨酸，溶于20ml 10% NaOH水溶液中，另取1.92g t-Boc酸酐溶于20ml THF中后，將其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室溫下攪拌過夜，停止反應后，加入適量的鹽酸，調節PH值至6.5-7.0之間，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相進行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
第二步:取一干凈的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g無Cs2CO3,0.019g
CuI，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml無水DMF，在氮氣保護的條件下，攪拌并于180°C回流18小時，冷卻后，旋干DMF，用無水乙醇溶解并抽濾沉淀，取濾液加濃鹽酸至沉淀完全，然后再進行抽濾，旋干濾液，用乙酸乙酯和蒸餾水進行萃取，收集水相，用制備型HPLC進行分離純化。
【文檔編號】C12N9/10GK103571804SQ201210285659
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月10日 優先權日:2012年8月10日
【發明者】王江云, 劉曉紅, 李家松, 董建樹, 胡誠, 龔為民, 江歡歡 申請人:中國科學院生物物理研究所