一種小麥蛋白TaMYB1及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種小麥蛋白TaMYB1及其編碼基因與應用。本發明提供的一種蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗病相關或具有轉錄激活活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明發現了一種蛋白TaMYB1，將其瞬時表達，發現其可以抗小麥白粉菌生理小種E09或大麥白粉菌A6引起的病害，進一步研究發現該蛋白還具有轉錄激活活性，其可以作為轉錄激活因子。上述研究表明，該蛋白可以為培育具有抗病性的轉基因植物的研究奠定基礎。
【專利說明】—種小麥蛋白TaMYBI及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種小麥蛋白TaMYBl及其編碼基因與應用。【背景技術】
[0002]小麥白粉病(Powdery mildew)是由專性寄生真菌禾布氏白粉菌Bgt (Blumeriagraminis f sp.tritici)引起的一種真菌性病害,屬世界性分布的病害,嚴重影響了世界小麥的產量。近年來，由于作物種植密度的增高，氮肥施用量的增大，以及作物種植的單一，使小麥白粉病造成的危害日益嚴重。小麥受害后，可導致葉片早枯，光合作用降低，呼吸作用加強，分蘗數減少，成穗率降低，干粒重下降，一般可減產5%~10%，重病田減產達20%以上。由于小麥白粉病菌具有群體大、適應范圍廣、生理小種眾多，且變異速度快，使得許多有效抗病基因喪失抗性。目前育種工作者一直以選育和推廣抗病品種作為病害的主要防治手段，多年來頗見成效，但抗性喪失一直是未能解決的問題，抗源多樣化是實現抗病性持久的有效途徑。為此通過生物學的方法克隆新的抗病基因，利用轉基因的方法提高小麥對白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。
【發明內容】
[0003]本發明的一個目的是提供一種小麥蛋白TaMYBl及其編碼基因。
[0004]本發明提供的蛋白，是如下(a)或(b):
[0005](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0006](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗病相關或具有轉錄激活活性的由序列2衍生的蛋白質。
[0007]上述(a)或(b)中的·蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列I所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5丨端和/或3'端連上表2所示的標簽的編碼序列得到。
[0008]上述蛋白的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發生的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起的。
[0009]編碼上述蛋白的基因也是本發明保護的范圍。
[0010]上述基因為如下I) -3)中任一一種的DNA分子:
[0011]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0012]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子；
[0013]3)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子。
[0014]上述嚴格條件為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0015]含有上述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的范圍；其中，重組載體可以為將序列表中的序列I插入pUB1-Adaptor-NOS載體中得到的載體；也可以為將序列表中的序列I插入35S-BD載體的BamH I與Sal I酶切位點間得到的載體。
[0016]擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的范圍；上述引物對可以是由序列表中的序列3所示的DNA分子和序列表中的序列4所示的DNA分子組成。
[0017]上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在抗病或使植物抗病中的應用也是本發明保護的范圍。
[0018]上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育具有抗病性的轉基因植物中的應用也是本發明保護的范圍。
[0019]在上述應用中，所述抗病為抗白粉病；所述白粉病具體為小麥白粉病或大麥白粉病。
[0020]上述小麥白粉病的病原菌為小麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)；所述小麥白粉病菌具體為小麥白粉菌生理小種E09 ；
[0021]上述大麥白粉病的病原菌為大麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)；所述大麥白粉病菌具體為大麥白粉菌A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)。
[0022]上述植物為雙子葉植物或單子葉植物；其中單子葉植物具體為小麥或大麥；本發明的實施例中的大麥品種為POl (含Mlal)，小麥品種為Chancellor或科農199。
[0023]上述蛋白在作為轉錄激活因子中的`應用也是本發明保護的范圍。
[0024]上述蛋白作為轉錄激活因子體現在激活基因表達；本發明的實施例中基因為報告基因LUC。
[0025]本發明的實驗證明，本發明發現了一種蛋白TaMYBl，將其瞬時表達，發現其可以抗小麥白粉菌生理小種E09或大麥白粉菌A6引起的病害，進一步研究發現該蛋白還具有轉錄激活活性，其可以作為轉錄激活因子。上述研究表明，該蛋白可以為培育具有抗病性的轉基因植物的研究奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為TaMYBl的PCR擴增結果圖
[0027]圖2為抗病細胞和感病細胞的表型圖
[0028]圖3為TaMYBl瞬時表達后對吸器指數的影響結果
[0029]圖4為TaMYBl轉錄激活報告基因表達結果圖
[0030]圖5為TaMYBl定位于細胞核內的結果圖
[0031]圖6為TaMYBl受小麥白粉菌誘導的表達圖
【具體實施方式】
[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0034]下述實施例中的部分材料如下:
[0035]小麥品種豫麥66記載在普通小麥品種“豫麥66”抗白粉病基因的鑒定與分子標記.作物學報，2008，34 (4): 545-550，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0036]大麥POl 記載在 Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependencein Barley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery Mildew Fungus.PlantCell，2003，15:732-744，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0037]小麥Chancellor記載在白粉病菌侵染后小麥葉片蛋白質變化的研究.華北農學報，2007，22 (3):126-128，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0038]小麥科農199記載在高產廣適小麥新品種-科農199.麥類作物學報，2007，27(2):368-370，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0039]Columbia 型擬南芥(col-Ο)記載在 Molecular characterization of thesubmergence response of the Arabidopsis thaliana ecotype Columbia.NewPhytologist.2011，190:457 - 471，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0040]小麥白粉菌生理小種E09 (Blumeria graminis f.sp.Tritici)記載在利用人工合成小麥培育的大穗抗白粉小麥基因資源GB4.植物遺傳資源學報，2007，8 (3): 378,公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0041]大麥白粉菌A6 (Blumeria graminis f.sp.Hordei)記載在 RecognitionSpecificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla Disease Resistance Genes tothe Powdery Mildew Fungus.Plant Cell，2003，15:732-744，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得
[0042]質粒pUbiGUS 記載在 A Transient Assay System for the FunctionalAssessment of Defense-Related Genes in Wheat.MPMI，1999，12:647 - 654，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0043]pUB1-Adaptor-NOS 記載在 Recognition Specificity and RAR1/SGT1Dependence in Barley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell，2003，15:732-744，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0044]35S-BD 載體記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE，2009，4(9):e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0045]35S-BD-VP16 記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE，2009，4(9):e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0046]5 XGAL4-LUC 記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE，2009，4(9):e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0047]Pptrl 記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulators improve stresstolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE，2009，4 (9): e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0048]pUb1-Gateway-eYFP 載體記載在 The CC-NB-LRR-type Rdg2a resistance geneconfers immunity to the seed-borne balrey leaf stripe pathogen in the absenceof hypersensitive cell death.PLoS One，2010，5: el2599，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0049]實施例1、TaMYBl基因的獲得
[0050]1、RNA 的獲得
[0051]小麥品種豫麥66的7天幼苗接菌小麥白粉菌生理小種E09，24小時取材，提RNA。
[0052]2、反轉錄獲得cDNA
[0053]反轉錄體系:
[0054]RNA2.5ul
[0055]01igo-dT Iul
[0056]DEPC-H2O 6.5ul
[0057]離心管混合上述溶液，700C 5分鐘，冰上再放置5分鐘。
[0058]
【權利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗病相關或具有轉錄激活活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因為如下I)-3)中任一一種的DNA分子: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 所述重組載體具體為將權利要求2或3所述基因插入表達載體中，得到表達權利要求1所述蛋白的重組載體。
5.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對；所述引物對具體由序列表中的序列3所示的DNA分子和序列表中的序列4所示的DNA分子組成。
6.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在抗病或使植物抗病中的應用。
7.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育具有抗病性的轉基因植物中的應用。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于:所述抗病為抗白粉病； 所述白粉病具體為小麥白粉病或大麥白粉病。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于: 所述小麥白粉病的病原菌為小麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici);所述小麥白粉病菌具體為小麥白粉菌生理小種E09 ； 所述大麥白粉病的病原菌為大麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.hordei);所述大麥白粉病菌具體為大麥白粉菌A6 ； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為小麥或大麥。
10.權利要求1所述蛋白在作為轉錄激活因子中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK103588868SQ201210295409
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月17日 優先權日:2012年8月17日
【發明者】荊邵娟, 常誠, 沈前華, 于德水 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所