專利名稱：一種人類粒細胞抗原(hna)1-5系統基因分型的pcr-sbt方法及試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因分型檢測方法，尤其涉及一種用于人類粒細胞抗原(HumanNeutrophil Alloantigens,縮寫為HNA) 1-5系統抗原基因分型的分子生物學檢測方法,本發明還涉及該方法所應用的試劑。
背景技術：
人類白細胞膜上具有一系列的血型抗原，包括粒細胞特異性抗原和人類白細胞抗原，這些抗原在不同人群中表現出高度的多態性，輸注后由于個體抗原的差異可以刺激不 同的機體產生免疫反應，從而引發某些輸血不良反應，導致輸注無效或引起某些嚴重的疾病，因此研究粒細胞特異性抗原具有重要的臨床意義。目前國際輸血協會的粒細胞抗原工作組制訂了人類粒細胞特異性抗原(Human Neutrophil Alloantigens)的命名原則,粒細胞特異性抗原系統被稱“HNA”。命名原則中作為抗原糖蛋白的定位用阿拉伯數字表示，如HNA-I定位于Fe Y Receptor IIIb ;同一糖蛋白不同的多態性則根據發現先后順序用小寫英文字母表示(如HNA-la，HNA-lb、HNA-lc等)。目前研究發現的粒細胞特異性抗原系統(HNA)有7個抗原，歸屬于5個人類粒細胞抗原系統。個體粒細胞特異性抗原的差異可以導致輸血后產生粒細胞抗體，目前證實粒細胞抗原、抗體在多種臨床疾病中起重要的作用，包括新生兒同種免疫性粒細胞減少癥、自身免疫性粒細胞減少癥、發熱性非溶血性輸血反應、輸血相關性急性肺損傷(TRALI)、骨髓移植后同種免疫性粒細胞減少癥、輸血相關性同種免疫性粒細胞減少癥、藥物誘導的粒細胞減少癥和粒細胞輸注無效等。其中粒細胞抗體與TRALI的關系近年來受到血液領域的高度關注，國外研究發現粒細胞特異性抗體與TRALI的發生密切相關，大多數發生TRALI的病例均能檢測到粒細胞特異性抗體，而且存在抗原系統的差異性。TRALI是臨床輸血并發的急性呼吸窘迫綜合癥，是一種嚴重的輸血不良反應，患者可發生急性呼吸困難、低氧血癥、非心源性肺水腫、低血壓和發燒，其死亡率較高，是輸血反應并發死亡的主要原因，目前已成為輸血反應引起死亡的第二位原因。現有關粒細胞特異性抗原系統與TRALI的關系以及TRALI的預防已成為輸血領域的研究熱點之一，近年國外部分國家已開展在獻血人群中系統檢測粒細胞特異性抗原系統的研究，以期預防和減少TRALI的發生。目前粒細胞特異性鑒定方法主要有血清學方法和基因分型方法。血清學鑒定粒細胞抗原或抗體方法主要有粒細胞凝集試驗、粒細胞免疫熒光試驗(GIFT)、單克隆抗體特異性粒細胞抗原捕獲試驗(Monoclonal Antibody Immobilization of GranulocyteAntigen, MAIGA)、流式細胞術和ELISA等方法。粒細胞抗原系統的基因分型方法主要有PCR-RFLP, PCR-SSP, PCR-SSO等。Bux等的實驗表明，基因分型法與MAIGA方法對HNA的分型具有同樣的可靠性，而GIFT有15%的分型失誤率。目前的HNA抗原基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特異性引物)，該方法需要進行多管擴增，并且PCR-SSP方法在設計引物時只能針對某些具有區別性的特異性位點進行設計，因此只能對常規的HNA抗原進行基因分型，對于一些特殊的新突變位點則難以明確。而HNA的PCR-SBT (PCR-Sequence based typing,基于PCR測序的分型技術)分型方法可以克服上述缺陷和局限性，為最準確的分型的方法。但現階段的HNA抗原基因PCR-SBT分型方法還不夠完善，雖然也有實驗室采用PCR-SBT的方法對HNA個別抗原進行基因分型，但至今未對HNA五個系統進行系統分型。因此，建立HNA1-5系統的PCR-SBT分型方法具有重要的意義。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于HNA1-5系統抗原分型的PCR-SBT方法，以克服現有基因分型技術中的上述缺陷。為此，本發明采用以下技術方案它對五個HNA抗原系統的基因進行分型，包括以下步驟(I)制備人基因組DNA ；
(2)提供擴增引物，用聚合酶鏈反應分別擴增人基因組DNA中HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系統的基因序列；(3)將步驟(2)得到的擴增產物進行雙酶切純化；(4)提供測序引物，將步驟(3)得到的純化產物進行測序PCR反應；(5)將步驟(4)得到的測序產物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序;(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。所述步驟(3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。本發明另一個所要解決的技術問題是提供上述方法所用的試劑。為此，本發明采用以下技術方案它由用于擴增的引物和用于測序分析的寡核苷酸測序引物組成；所述用于擴增的引物為(I)HNA-I抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-IF :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3，HNA-IR :5，-CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3，(2) HNA-2抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-2F:5， -TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT-3，HNA-2R:5，-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3J(3) HNA-3抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-3F:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3’HNA-3R:5，-CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3J(4) HNA-4抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-4F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’HNA-4R:5，-CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3J(5) HNA-5抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-5F:5， -TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’HNA-5R:5’ -CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3J所述2條寡核苷酸測序引物序列如下
M13F:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT—3’Ml3R : 5，-CAGGAAACAGCTATGACC-3，。本發明中引物設計是PCR擴增的關鍵，有關引物設計的方法和軟件均可從英特網上免費獲得。本發明所設計的寡核苷酸引物是根據GenBank中人類HNA抗原基因序列中包括多態性位點在內的連續寡核苷酸序列而設計獲得的。HNA-I抗原系統的基因序列的擴增引物根據 GenBank 中編號為 NC_000001. 10(161592986. . 161601158)的序列設計;HNA_2 抗原系統的基因序列的擴增引物根據GenBank中編號為NC_000019. 9 (43857825-43867480)的序列設計；HNA-3抗原系統的基因序列的擴增引物根據GenBank中編號為NC_000019. 9(10713121.. 10755235)的序列設計；HNA_4抗原系統的基因序列的擴增引物根據 GenBank 中編號為 NC_000016. 9 (31271288. · 31344213)的序列設計;HNA_5 抗原系統的基因序列的擴增引物根據GenBank中編號為NC_000016. 9 (30483983. . 30534506)的序列設計。所有正向擴增引物5’端連接有M13載體正向序列上的18個堿基序列TGTAAAACGACGGCCAGT，所有反向擴增引物5’端連接有M13載體反向序列上的18個堿基序 列CAGGAAACAGCTATGACC，通過連接后所有正向擴增引物、反向擴增引物分別具有共同的接頭序列，然后選擇這些接頭序列作為測序引物。本發明以5對寡核苷酸引物分別擴增HNA系統的5個基因片段(分別為HNA-1抗原系統擴增 GenBank 編號為 NC_000001. 10(161592986. . 161601158)序列中 1197-1668 位的片段，HNA-2抗原系統擴增GenBank編號為NC_000019. 9 (43857825-43867480)序列中的1-457 位的片段，HNA-3 抗原系統擴增 GenBank 編號為 NC_000019. 9 (10713121. . 10755235)序列中的28745-29265位的片段，HNA-4抗原系統擴增GenBank編號為NC_000016. 9(31271288. · 31344213)序列中的 5409-5838 位的片段，HNA-5 抗原系統擴增GenBank編號為 NC_000016. 9 (30483983. . 30534506)序列中的 33996-34321 位的片段)，可保證五個抗原系統基因的有效擴增。擴增引物的設計避開了 HNA抗原編碼序列的多態性位點，避免了任何突變點的漏檢。測序引物的設計能保證清晰準確測得所擴增片段的序列，通過對這些序列進行雙向測序，從而將樣本進行精確的基因定型。本發明通過對HNA抗原5個系統分別進行序列測序，獲得HNA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精確地對其基因進行定型。隨著DNA序列分析儀的普及，PCR-SBT技術廣泛應用于臨床檢測。高通量獲得的所有HNA抗原系統的編碼序列信息在基因定型、基因多態性檢測、基因頻率調查分析等方面的應用將受到廣泛重視。本發明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應用廣泛的鑒定方法，解決了 HNA抗原5個系統準確定型的問題，發揮PCR-SBT對HNA基因定型操作高通量，結果精確的特點，在臨床輸血醫學研究和遺傳學等領域的相關應用將受到高度重視，對于醫學研究單位、藥學研究和試劑開發單位具有重要的現實意義。特別是明確獻血人群粒細胞抗原系統分布情況，避免輸注含有粒細胞抗體的血液，以預防粒細胞抗體產生的輸血不良反應，將有效預防TRALI發生，從而提高血液的安全性。
圖I為本發明中檢測標本的ΗΝΑ-1、ΗΝΑ-2、ΗΝΑ-3、ΗΝΑ-4和HNA-5抗原基因PCR擴增電泳圖譜。I為HNA-I系統擴增片段，2為HNA-2系統擴增片段，3為HNA-3系統擴增片段，4為HNA-4系統擴增片段，5為HNA-5系統擴增片段。圖2為本發明檢測3個樣本HNA-I系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。141、147和227表示多態性堿基位置。檢測到HNA-I抗原系統三個基因型，其中第141、147和227位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)HNA-la+b-c-，標本2 (圖的中部)ΗΝΑ-la+b+c-，標本3 (圖的下部)HNA-la-b+c-為例。圖3為本發明檢測3個樣本HNA-2系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。49表示多態性堿基位置。檢測到HNA-2抗原系統三個基因型，其中第49位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)為HNA-2a+b-，標本2 (圖的中部)HNA_2a+b+，標本3 (圖的下部)HNA_2a_b+為例。圖4為本發明檢測3個樣本HNA-3系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。306表示多態性 堿基位置。檢測到HNA-3抗原系統三個基因型，其中第306位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)HNA-3a+b-，標本2 (圖的中部)HNA_3a+b+，標本3 (圖的下部)HNA_3a_b+為例。圖5為本發明檢測I個樣本HNA-4系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。檢測到HNA-4抗原系統一個基因型，其中第141位為多態性堿基位置。以標本HNA-4a+b-為例。圖6為本發明檢測3個樣本HNA-5系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。2466表示多態性堿基位置。檢測到HNA-5抗原系統三個基因型，其中第2466位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)HNA-5a+b_,標本2 (圖的中部)HNA_5a+b+,標本3 (圖的下部)HNA_5a_b+為例。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明內容作進一步詳細說明。實施例I :本實施具體以獻血者進行HNA1-5系統抗原基因分型為例對本發明內容做詳細說明，本發明所采用的一種HNA 1-5系統抗原基因分型的PCR-SBT方法具體包括以下步驟I、制備人基因組DNA，作為后續步驟的PCR擴增模板。取待檢全血200 μ I,按照QuickGene DNAwhole blood kit S試劑盒說明書提取基因組DNA，利用分光光度計測定基因組濃度和純度。2、合成5對擴增引物和2條測序引物，具體序列見前述發明內容中的序列，不再贅述，將擴增引物用純水稀釋至50μΜ ;準備La-Taq 酶(Lot CK4501, TaKaRa),10X 緩沖液(Lot CK4501, TaKaRa), Mg2+(Lot AA2601A, TaKaRa),dNTP (Lot :CBG4301A，TaKaRa)、純水，與步驟 I 所制備的 PCR 擴增模板，按表I所述體系配制PCR擴增體系表I :步驟2中HNA 5個系統的PCR擴增體系
HNA 5個系統PCR擴增體系體積(μ I)~
~10XPCR 緩沖液270
dNTP (2. 5mM) Γθ
Mg2+ (25mM) Γθ
引物IοΓΤθ
引物2αΤθ La-Taq 酶(5U/μ I)θΤθ
H2O12. 32
DNA 模板(lOOng/μ I)2 0
總體系20 μ I上表中，引物I :ΗΝΑ-1 5各引物對中的正向引物，引物2 :ΗΝΑ-1 5各引物對中的反向引物。用PCR儀(ΑΒΙ9700)按以下程序擴增95°C預變性5min，DNA雙鏈充分解開；95°C變性30s，63°C退火30s，引物結合到模板上，72°C延伸45s，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C，lOmin，擴增片段充分延伸；3、擴增產物的雙酶切純化。檢測樣本所擴增片段，各取2μ I PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖I所示，確定擴增片段的特異性。在剩余的PCR產物中分別加入蝦堿性磷酸酶(SAP，IU/μ 1，Lot M820A, Promega)和核酸外切酶 I (Exo- I，5U/μ 1，Lot CK11011B, TaKaRa)，利用蝦堿性磷酸酶(SAP)的核苷酸Y端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo- I)的單鏈特異性Y - 核酸外切酶功能，進行擴增產物純化。在25μ1擴增產物體系中加入SAP 2μ I和Exo- I I μ 1,37。。30min酶切反應，80°C 15min酶失活。4、對PCR產物進行測序PCR。將步驟3中純化之后的PCR產物中加入20 μ I純水稀釋，混勻。將發明內容中所述的兩條測序引物用純水稀釋至濃度為3. 2ymol/L，以BigDyeterminator v3. Isequencing kit (美國ABI公司)試劑按照表2配制反應體系表2 :步驟4中PCR產物的PCR測序體系
5 X緩沖液 1.5 BigDye mix I.O 測序引物I ΓοDNA2.0
H2OTl
總體積10.0
5X緩沖液175其中測序引物I為M13F和M13R中任意一條。所測樣本以擴增純化的片段1:1稀釋后作為模板，分別進行2個反應，用PCR儀(ABI9700)按以下程序擴增預變性96°C lmin，DNA雙鏈充分解開；96°C變性10s，50°C退火5s，測序引物結合到DNA模板上，60°C延伸4min，延長擴增片段，25個循環。5、測序擴增PCR產物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。將步驟4中測序擴增PCR產物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。直接在PCR產物中加入I μ I EDTAC I. 25 μ Μ) 和25 μ I醋酸鈉(3Μ)/無水乙醇(I 40)混合液，混勻，3000g離心30min ;去除上清，加入50 μ I 75%乙醇，300(^離心1011^11，去除上清，酒精揮發后加入1(^1甲酰胺溶解，95°C變性3min,迅速在冰上冷卻。6、將制備好的產物在ABI 3730測序儀上進行48孔毛細管高通量電泳測序，所測序結果利用SeqScape V2. 5軟件進行序列比對，確定HNA抗原系統的基因型，結果顯示了檢測樣本 HNA-I (圖 1)，HNA-2 (圖 2)，HNA-3 (圖 3)，HNA-4 (圖 4)，HNA-5 (圖 5)的部分序列。其中圖I為本發明中檢測標本的HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原基因PCR擴增電泳圖譜。I為HNA-I系統擴增片段，2為HNA-2系統擴增片段，3為HNA-3系統擴增片段，4為HNA-4系統擴增片段，5為HNA-5系統擴增片段。圖2為本發明檢測3個樣本HNA-I系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。141、147和227表示多態性堿基位置。檢測到HNA-I抗原系統三個基因型，其中第141、147和227位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)HNA-la+b-c-，標本2 (圖的中部)HNA-la+b+c-，標本3 (圖的下部)HNA-la-b+c-為例。圖3為本發明檢測3個樣本HNA-2系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。49表示多態性堿基位置。檢測到HNA-2抗原系統三個基因型，其中第49位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)為HNA-2a+b-，標本2 (圖的中部)HNA_2a+b+，標本3 (圖的下部)HNA_2a_b+為例。圖4為本發明檢測3個樣本HNA-3系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。306表示多態性堿基位置。檢測到HNA-3抗原系統三個基因型，其中第306位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)HNA-3a+b-，標本2 (圖的中部)HNA_3a+b+，標本3 (圖的下部)HNA_3a_b+為例。圖5為本發明檢測I個樣本HNA-4系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。檢測到HNA-4抗原系統一個基因型，其中第141位為多態性堿基位置。以標本HNA-4a+b-為例。圖6為本發明檢測3個樣本HNA-5系統的部分測序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。2466表示多態性堿基位置。檢測到HNA-5抗原系統三個基因型，其中第2466位為多態性堿基位置，分別以標本I (圖的上部)HNA-5a+b_,標本2 (圖的中部)HNA_5a+b+,標本3 (圖的下部)HNA_5a_b+為例。所以，本發明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應用廣泛的鑒定方法，解決了 HNA基因的準確分型鑒定問題，發揮PCR-SBT對HNA基因分型結果精確、高通量操作的特點，在臨床輸血醫學研究和遺傳學等領域的相關應用將受到高度重視，對于醫學研究單位、藥學研究和試劑開發單位具有重要的意義。特別是明確獻血人群粒細胞抗原系統分布情況，避免輸注含有粒細胞抗體的血液，以預防粒細胞抗體產生的輸血不良反應，將有效預防 TRALI發生，從而提高血液的安全性。
權利要求
1.一種人類粒細胞抗原(ΗΝΑ)1-5系統基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于它對五個HNA抗原系統的基因進行分型，所述五個HNA抗原系統分別為HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5，所述方法包括以下步驟 Cl)制備人基因組DNA ； (2)提供擴增引物，用聚合酶鏈反應分別擴增人基因組DNA中HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系統的基因序列； (3)將步驟(2)得到的擴增產物進行雙酶切純化； (4)提供測序引物，將步驟(3)得到的純化產物進行測序PCR反應； (5)將步驟(4)得到的測序產物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序； (6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
2.如權利要求I所述的一種人類粒細胞抗原(HNA)1-5系統基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟(2)中的擴增引物為5對寡核苷酸分別擴增ΗΝΑ-1、ΗΝΑ-2、ΗΝΑ-3、HNA-4和HNA-5抗原系統的基因序列 (OHNA-1抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-IF :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3，HNA-IR :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3， (2)HNA-2抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-2F :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT-3，HNA-2R :5，-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3， (3)HNA-3抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-3F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3，HNA-3R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3， (4)HNA-4抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-4F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’HNA-4R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3， (5)HNA-5抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-5F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’HNA-5R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3’ 所述步驟(4)中的測序引物為用于測序分析的2條寡核苷酸測序引物Ml3F :5 ’ -TGTAAAACGACGGCCAGT-3，M13R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
3.如權利要求I所述的一種人類粒細胞抗原(ΗΝΑ)1-5系統基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟(3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
4.一種人類粒細胞抗原(HNA) 1-5系統基因分型的PCR-SBT方法所用的試劑，其特征在于它由用于擴增的引物和用于測序分析的寡核苷酸測序引物組成； 所述用于擴增的引物為 (OHNA-1抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-IF :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3，HNA-IR :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3，(2)HNA-2抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-2F :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT3，HNA-2R :5，-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3，(3)HNA-3抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-3F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3，HNA-3R:5’ -CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3J(4)HNA-4抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-4F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’HNA-4R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3，(5)HNA-5抗原系統的基因序列的擴增引物，HNA-5F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’HNA-5R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3’所述2條寡 核苷酸測序引物序列如下Ml3F :5 ’ -TGTAAAACGACGGCCAGT-3，M13R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
全文摘要
本發明提供一種HNA1-5系統抗原分型的PCR-SBT方法，它包括以下步驟制備人基因組DNA；提供擴增引物，用聚合酶鏈反應分別擴增HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系統的基因序列；將擴增產物進行雙酶切純化；提供測序引物，將純化產物進行測序PCR反應；將測序產物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；將獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。本發明還提供上述方法所用的試劑。本發明通過對HNA抗原5個系統分別進行序列測序，獲得HNA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精確地對其基因進行定型。本發明對于醫學研究單位、藥學研究和試劑開發單位具有重要的現實意義。
文檔編號C12Q1/68GK102827932SQ20121029752
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者朱發明, 何俊俊, 何吉, 呂杭軍 申請人:浙江省血液中心